CN101735973B

CN101735973B - 一株高效脱氮除磷菌c18

Info

Publication number: CN101735973B
Application number: CN2010101005767A
Authority: CN
Inventors: 蔡天明; 陈立伟; 蔡舒; 吴守中; 李晓丹; 刘志伟
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-01-25
Filing date: 2010-01-25
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2030-01-25
Also published as: CN101735973A

Abstract

本发明提供一株高效脱氮除磷菌C18，属于废水生化处理工艺技术领域。菌株C18为革兰氏染色反应阴性菌，经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas grimontii)。该菌株主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，大小约0.9×0.6μm，偏端单生鞭毛；V-P试验阳性；吲哚试验阳性；能水解淀粉。菌株C18在缺氧培养24h后，除磷率达88.3％，脱氮率达83.4％，可将其应用于废水生化处理工艺中，大大降低废水中的氮磷含量。

Description

一株高效脱氮除磷菌C18

一、技术领域

本发明涉及一株高效脱氮除磷菌C18，是利用微生物的方法提高废水脱氮除磷工艺的效率，适用于水污染控制及废水生化处理工艺领域。

二、背景技术

长期以来，污水处理的目的侧重于去除有机物和悬浮物，并不考虑氮、磷的去除。随着污水排放量的增大，尤其是化肥、农药、合成洗涤剂的广泛使用，污水中存在的氮、磷营养物质对环境所造成的影响也逐渐引起了人们的高度重视。氮、磷植物营养型污染物的排放对水体环境的影响最为突出的是水体的富营养化，表现为藻类的过量繁殖、水质恶化等现象，最终导致湖泊退化；与此同时，氨、氮的耗氧性能够使水体中的溶解氧降低，导致鱼类死亡、水体恶臭；当水中pH值较高时，氨对鱼类等水生植物产生毒性。水环境污染和水质富营养化问题迫使越来越多的国家制定严格的氮、磷排放标准，限制氮、磷的排放量，污水处理过程中也必须考虑到相应的技术手段，有效地降低废水中的氮、磷含量已成为现代废水处理技术的一项新课题。《污水综合排放标准》(GB18918-2002)对所有排放污水中的氮、磷含量都做出了明确的规定，其中磷(以正磷酸盐计)的排放要严格控制在0.5mg/L(一级标准)，因此今后大多数城市污水处理厂都要考虑采用除磷脱氮的技术措施。

近20年，污水脱氮除磷技术一直是水处理领域的热点，也是难点，通过相应的国际交流、技术探讨及工程实践经验，加速了脱氮除磷技术的发展，重大的成就就是生物脱氮除磷技术的发展以及生物处理和化学处理的有机结合。从脱氮除磷的原理上看，某些化学、物理的方法可有效地去除污水中的氮、磷，但一般情况下，这两种方式运行较为复杂，费用很高，还需要另建构筑物才能保证处理效果，增加了基建费用，而脱氮除磷的生物处理具有同时脱除C、N、P且处理成本低等优越性。所以从环境中分离高效脱氮除磷菌，能大大提高生物脱氮处理工艺的效率，在实际中得到了广泛的应用。

三、发明内容

技术问题本发明的目的在于从环境中筛选出一株高效脱氮除磷菌，为生物脱氮除磷工艺提供进一步的理论依据及技术支持。

技术方案

本发明的详细实施步骤为：

一株高效脱氮除磷菌，2009年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.3518，菌株为革兰氏染色反应阴性菌C18，经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas grimontii)，主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，大小约0.9×0.6μm，偏端单生鞭毛；V-P试验阳性；吲哚试验阳性；能水解淀粉。

所述的脱氮除磷菌C18可以用在水污染控制及废水生化处理工艺中脱氮除磷。脱氮除磷工艺条件为，温度30℃，pH7.5。

有益效果

该发明的菌株具有很好的脱氮除磷能力，该菌株在缺氧培养24h后，除磷率达88.3％，脱氮率达83.4％。将其应用于生物脱氮除磷工艺，具有同时脱除C、N、P且处理成本低等优越性。

四、附图说明

图1：不同菌株好氧培养除磷能力

图2：菌株C18缺氧培养同步脱氮除磷能力

图3：温度对C18同步脱氮除磷能力的影响

图4：pH对C18同步脱氮除磷能力的影响

五、具体实施方式

以下叙述本发明的实施例

1.菌株的分离纯化

吸取污泥样品10mL置于含100mL无菌水的250mL三角瓶中，加入若干玻璃珠，于30℃摇床振荡30min。取混合液0.5mL于盛有4.5mL无菌水的试管中，振荡混匀，制成浓度梯度为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6的悬液。取不同梯度的悬液0.1mL涂布于YG平板上，每个稀释度各做三块平板，30℃培养2～3d。从平板中挑选出形态不同的菌落，在YG平板上划线纯化；将纯化的菌转接至LB斜面培养基上，30℃培养2d，于4℃条件下保存。

2.菌株的筛选

(1)蓝白斑初筛：将从平板中挑出的形态不同的菌落，分别点接于限磷和过磷培养基上，30℃培养2d。选择在限磷和过磷培养基上均呈蓝斑的菌株。

限磷和过磷培养基的配制方法如下：①先配制100mL的10×MOPS培养基：8.372gMOPS+0.717g tricine+30mL去离子水，10mol L^-1的KOH调节pH至7.4，总体积到44mL，再加入0.01％1mL新制的FeSO₄溶液，并按下列顺序加溶液：5mL 1.9mol L^-1 NH₄Cl，1mL 0.276mol L^-1 K₂SO₄，0.025mL 0.02mol L^-1 CaCl₂·2H₂O，0.21mL 2.5mol L^-1MgCl₂·6H₂O，10mL 5mol L^-1NaCl，0.02mL微量元素混合液，38.7mL去离子水，葡萄糖0.1g；②分别取50mL置于两个500mL的三角瓶中，向一个三角瓶中加入0.00866gK₂HPO₄，成为限磷培养基；向另一个瓶中加入0.1732g K₂HPO₄，成为过磷培养基。③向两种培养基中均加入0.1g/mL的thiamine溶液0.01mL，定容至500mL，用细菌滤器过滤后，取100mL分装于已灭菌的150mL的三角瓶中。微量元素配方：(NH₄)₆(MO₇)₂₄ 0.09g，H₃BO₃ 0.62g，CoCl₂ 0.18g，CuSO₄ 0.06g，MnCl₂ 0.40g，ZnSO₄ 0.07g。

(2)将上述筛选出的菌株进行Albert异染粒染色，选择具有异染粒颗粒的菌株。

Albert异染粒染色试剂：①甲液：甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.20g，冰醋酸1mL，酒精(95％)2mL，蒸馏水100ml。②乙液：碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300mL。

Albert异染粒染色方法：按常规方法制片，用甲液染5min；倾去甲液，用乙液冲去甲液，并染1min，水洗；吸干，备油镜镜检；若有异染粒，则异染粒呈黑色，菌体其他部分呈绿色。

(3)菌株除磷效果研究：将上述筛选出的菌株接入LB试管，30℃、180r·min^-1振荡培养12h后，离心收集菌体，调整菌液OD₆₀₀＝1.0，即为种子液。再按1％的接种量接种于含100mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃、180r·min^-1好氧培养24h，LB培养基配方为：蛋白胨质量比1％、酵母粉0.5％、NaCl 1％，pH7.0-7.2。在不同的生长阶段即0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分别取培养后的菌液于12000g离心1min，以大肠埃希氏菌Escherichia coli(来源：中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：20658)为对照菌，测定上清液磷浓度，由图1可知，C18在好氧培养24h后上清液磷浓度从38.7mg/L降低至2.28mg/L，磷去除率达到了94.1％。

(4)菌株反硝化能力研究：将好氧除磷能力较强的菌株接种于硝酸盐蛋白胨水培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，KNO₃ 1g，蒸馏水1000mL，pH7.4)中，30℃培养24h，观察结果，凡在硝酸盐蛋白胨水培养基中的小倒管内有气体产生者，即为阳性，表明该菌可还原硝酸盐并将硝酸盐分解产生氮气，即该菌具有反硝化能力(表1)。

表1硝酸盐还原产气试验结果

(5)菌株同步脱氮除磷能力研究：将菌株C18、C28、C31按1％的接种量接种于含有100mL缺氧培养基[KNO₃ 5％、K₂HPO₄ 2.5％、微量元素混合液20％，pH7.2-7.4；其中微量元素混合液为制备为：(NH₄)₆(MO₇)₂₄ 0.09g，H₃BO₃ 0.62g，CoCl₂ 0.18g，CuSO₄ 0.06g，MnCl₂ 0.40g，ZnSO₄ 0.07g分别先溶于40mL水中，再定容至50mL]的250mL锥形瓶中，锥形瓶内通N₂维持缺氧条件，30℃、180r·min^-1培养24h，在不同的生长阶段即0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h分别取培养后的菌液于12000g离心1min，测定上清液中磷和硝酸盐氮浓度的变化，见表2，图2(测定上清液中磷浓度：钼锑抗分光光度法；测定上清液中硝酸盐氮浓度：紫外分光光度法)。由表2、图2可知，在相同条件下，菌株C18同步脱氮除磷能力较强，除磷率及脱氮率分别达88.3％和83.4％。缺氧培养基配方为：

结合上述实验结果，确定菌株C18为高效脱氮除磷菌。

表2缺氧培养实验结果

3.对菌株C18的16S rRNA基因序列进行分析，结果表明，C18的16S rRNA基因序列与Pseudomonas grimontii 16S rRNA基因序列同源性达99％。并结合生理生化特性试验结果，将C18鉴定为假单胞菌Pseudomonas grimontii。菌株C18的主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，大小约0.9×0.6μm，偏端单生鞭毛；V-P试验阳性；吲哚试验阳性；能水解淀粉。

4.温度对C18同步脱氮除磷效率的影响：实验设置15℃、25℃、30℃、35℃、45℃几种不同的温度，将C18按1％接种量接种至含有100mL缺氧培养基的250mL锥形瓶中，锥形瓶内通N₂维持缺氧条件，在不同温度下180r·min^-1培养24h后，测定各上清液中磷和硝酸盐氮的浓度变化，结果如图3所示，C18最适脱氮除磷温度为30℃，可为其在水污染控制及废水生化处理工艺中的的应用提供依据。

5.pH对C18同步脱氮除磷效率的影响：调节缺氧培养基pH为pH5.0、pH6.0、pH7.0、pH7.5、pH8.0、pH9.0，将菌株C18按1％接种量接种至含有100mL不同pH缺氧培养基的250mL锥形瓶中，锥形瓶内通N₂维持缺氧条件，30℃、180r·min^-1培养24h，测定各上清液中磷和硝酸盐氮的浓度变化，结果如图4所示，C18最适脱氮除磷pH为pH7.5，可为其在水污染控制及废水生化处理工艺中的的应用提供依据。

Claims

1.一株高效脱氮除磷菌C18，2009年12月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为：CGMCC No.3518，该菌株为革兰氏染色反应阴性菌，经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas grimontii)，主要生物学特性为G^-，菌体为短杆状，大小约0.9×0.6μm，偏端单生鞭毛；V-P试验阳性；吲哚试验阳性；能水解淀粉。

2.权利要求1所述的脱氮除磷菌C18在水污染控制及废水生化处理工艺中脱氮除磷的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，权利要求1所述的脱氮除磷菌C18脱氮除磷最佳工艺条件为：温度30℃，pH7.5。