CN104694435A - 一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株可降解三氮唑的申氏杆菌及其应用。该菌经鉴定为申氏杆菌Shinella sp.，命名为Shinella sp. NJUST26，GenBank登录号为KP890249，菌株已于2015年3月4日在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC M 2015081。本发明直接采用以三氮唑为唯一碳源和氮源的培养基进行三氮唑降解菌的富集，并采用以三氮唑为唯一碳源和氮源的筛选培养基进行分离。该菌株可实现含较高浓度（＞300mg/L）三氮唑的完全降解，对三氮唑具有较好的耐受性能，具有良好的应用前景。

Description

一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌及其应用
技术领域
本发明属于环境有机污染物生物处理技术领域，具体涉及一株降解三氮唑的细菌及其在废水生物处理和环境污染修复中的应用。
背景技术
三氮唑(主要是1，2，4-三氮唑)广泛应用于医药、农药、化工等多行业，是一种典型的难降解含氮杂环化合物。三氮唑因其杂环结构而具有较强的水溶性,很容易转移到土壤和地下水中，因而在土壤和地下水中普遍存在。由于三氮唑的生物毒性、致畸变和致癌特性,三氮唑污染对人类的健康和生态环境造成了巨大的潜在危害。因此，含三氮唑的废水如不经过处理而直接排放，会对环境造成严重污染。
目前针对三氮唑废水的处理方法主要有物理法、化学法、生物法等。其中物理手段如吸附法、萃取法等普遍存在二次污染的问题，需要辅以其他工艺，才可达到理想的去除率；化学法中高级氧化法及电化学法耗能高，成本也高，且部分中间产物的毒性更大。因此，对处理效果好、处理成本小、无二次污染的三氮唑污染废水的处理技术和工艺的探讨，具有理论和实际意义。
微生物处理法与物理、化学方法相比，具有经济、高效的优点，更重要的是可以实现污染的无害化治理。生物法无二次污染、处理量大，是目前应用最广的废水处理技术。但由于三氮唑结构稳定，可生化降解程度不高，普通的生物处理无法作用或效率低下。因此，对三氮唑降解效率高、降解效果好的微生物的驯化、筛选和应用，是解决三氮唑废水污染的有效途径。然而对于三氮唑这种杂环化合物的生物降解国内外均未见文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对目前三氮唑降解菌株的缺乏，提供一株可降解三氮唑的菌株Shinella sp.NJUST26。
本发明的另一目的在于提供一株可高效降解三氮唑的新型菌株Shinella sp.NJUST26的选育方法。
本发明还有一个目的是提供Shinella sp.NJUST26在含三氮唑废水处理领域的应用。
实现本发明目的技术解决方案是：一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌，从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口土样中分离筛选得到三氮唑降解菌株NJUST26，经鉴定为Shinella sp.，命名为Shinella sp.NJUST26，GenBank登陆号为KP890249，菌株已于2015年3月4日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 2015081。该菌株为国内外第一株可用于三氮唑啶废水处理的细菌。
一株可高效降解三氮唑的新型菌株Shinella sp.NJUST26的选育方法，包括以下步骤：
⑴菌株的分离
从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口挖取土样，接种至以三氮唑为唯一碳源和氮源的的液体无机盐培养基，摇床培养，实现三氮唑降解菌的富集培养。连续转接后，稀释涂布于以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入培养箱进行培养。挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，得到单一菌株，并进行斜面保存。
⑵菌株的筛选
挑取分离所得到的单菌落，分别接种于以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐液体培养基中，摇床培养。采用高效液相色谱测定培养基中三氮唑浓度变化，如果培养基中三氮唑浓度显著降低，即可判断三氮唑发生了降解。比较分离得到的单菌落的降解性能，选取降解性能最优异的菌株作后续的鉴定。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明所提供的Shinella sp.NJUST26，可以以三氮唑为唯一碳源、氮源进行生长。本发明直接采用以三氮唑为唯一碳源和氮源的培养基进行三氮唑降解菌的富集，并采用以三氮唑为唯一碳源、氮源的筛选培养基进行分离，确保了筛选得到的降解菌的优异降解性能。
三氮唑废水的应用研究表明，筛选得到的Shinella sp.NJUST26，可在15d左右实现浓度约为320mg/L的三氮唑废水的处理，三氮唑的降解率达到90％以上。在三氮唑浓度为0-320mg/L的范围内，Shinella sp.NJUST26可正常生长并实现吡啶的完全降解。在pH为5.0-8.0的范围内，Shinella sp.NJUST26可实现三氮唑的完全降解。低浓度易降解碳源的加入可对三氮唑降解起促进作用。
附图说明
图1是本发明废水中三氮唑浓度对菌株Shinella sp.NJUST26降解三氮唑性能的影响。
图2是本发明废水pH对三氮唑降解性能的影响。
图3是本发明废水中易降解碳源的存在对三氮唑降解性能的影响。
图4为本发明菌株Shinella sp.NJUST26的16SrDNA序列表。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1：三氮唑降解菌Shinella sp.NJUST26的筛选分离及其对三氮唑的降解性能
⑴菌株的分离
从金坛市丰登环境技术服务有限公司长期受到三氮唑污染的排污口挖取土样，取10g土样加入100mL三氮唑浓度为100mg/L的液体无机盐培养基(MSM)，装入250mL三角瓶中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，3h后取出三角瓶静置，待泥水分离后取2mL上清液，转接入50mL三氮唑浓度为100mg/L的液体无机盐培养基(MSM)中，装入100mL三角瓶中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，实现三氮唑降解菌的富集培养。15天后，2mL液体培养基转接入50mL新鲜培养基，并摇床培养。经过连续3次转接后，用无菌蒸馏水将液体培养基稀释104-108倍，涂布于三氮唑浓度为100mg/L、以三氮唑为唯一碳源和氮源的无机盐固体培养基平板上，放入30℃培养箱进行培养。一周后挑取在菌落特征上有明显差异的菌落，采用平板划线分离的方法进行纯化，连续纯化三次后，得到单一菌株，并进行斜面保存。
无机盐培养基(MSM)的组成如下：Na2HPO4·12H2O(3.057g/L)，KH2PO4(0.760g/L)，MgSO4·7H2O(0.2g/L)，CaCl2(0.05g/L)，微量元素溶液SL-4(10mL/L)。微量元素SL-4组成：EDTA(0.5g/L),FeSO4·7H2O(0.2g/L)，微量元素SL-6(100mL/L)。微量元素SL-6组成：ZnSO4·7H2O(0.01g/L)，MnCl2·4H2O(0.03g/L)，H3BO4(0.3g/L)，CoCl2·6H2O(0.2g/L)，CuCl2·2H2O(0.01g/L)，NiCl2·6H2O(0.02g/L)，Na2MoO4·2H2O(0.03g/L)。
⑵菌株的筛选
挑取分离所得到的单菌落，分别接种于三氮唑浓度为100mg/L、以三氮唑为唯一碳源和氮源的MSM中，摇床培养15d。用高效液相色谱法测定培养基中三氮唑浓度变化，如果培养基中三氮唑浓度显著降低，即可表明三氮唑发生了降解。在分离得到的单菌落中，命名为NJUST26的菌株降解性能最为优异，在15d的培养期内，三氮唑完全降解，因此选取该菌株作后续的鉴定。
⑶菌株的鉴定
对细菌进行形态学、生理生化测试。测定菌株的16S rDNA序列，将菌株的16SrDNA基因序列与国际GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，最终从分子水平上确定该菌的种属。
①形态特征：NJUST26菌落呈白色，圆形，边缘整齐，中心有褶皱。
②生理生化特征：革兰氏阴性，催化酶阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，不能水解淀粉，可在pH为5.0的营养肉汤中生长。好氧，具有能动性，最适降解pH范围为6.0-7.0，最适生长温度为25-30℃。
③分子生物学鉴定：以NJUST26菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，测定其全序列，土壤杆菌的16S rDNA基因序列见图4所示的序列表。将菌株的16S rDNA基因序列提交至GenBank数据库(GenBank登陆号为KP890249)，与GenBank数据库中的序列进行网上同源性比较，结果表明，NJUST26与Shinella granuli strain Ch06和Shinella sp.HZN7的序列相似度高达99％以上。
根据NJUST26的形态学、生理生化测试以及分子生物学分析，NJUST26鉴定为申氏杆菌Shinella sp.，命名为Shinella sp.NJUST26。
⑷菌株对三氮唑的降解及在三氮唑废水处理中的应用
将三氮唑降解菌株NJUST26接种至添加100mg/L三氮唑的MSM培养基，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，进行NJUST26的富集培养，待菌体进入对数生长期后期(约7d)，将所得菌体用3,000×g的转速离心分离5分钟，撇去上清液，采用涡旋震荡的方法将菌体重新悬浮于无菌液体MSM，离心。重复洗涤过程四次后，将菌体重新悬浮于无菌液体MSM(调节加入的MSM量，控制菌悬浮液光密度OD600约为0.2)，得到种子液。
配制以100mg/L三氮唑为唯一碳源和氮源的液体MSM作为模拟废水，将上述种子液加入模拟三氮唑废水中，30℃条件下以180转/分的转速摇床培养，观测降解过程中废水中三氮唑浓度，观测细菌生长情况。设立未接种NJUST26的空白对照。由图1可知，100mg/L三氮唑可于9d内被驯化后的三氮唑特效降解菌完全降解。而在未接种NJUST26的对照样中，三氮唑未得到明显降解。
本实施例说明分离得到的Shinella sp.NJUST26可以利用三氮唑为唯一碳源和氮源进行生长繁殖，并可实现三氮唑的完全降解。
实施例二 三氮唑浓度对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度分别为100mg/L、160mg/L、200mg/L、260mg/L和320mg/L的液体MSM作为模拟废水，将Shinella sp.NJUST26种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图1所示，Shinella sp.NJUST26可实现三氮唑浓度高达320mg/L的模拟废水中三氮唑的完全降解。在三氮唑浓度为100mg/L、160mg/L、200mg/L、260mg/L和320mg/L的条件下，分别可在9d、12d、12.5d、15d和15.5d内实现模拟废水中三氮唑的完全去除。由于三氮唑的高毒性和难降解特性，在高浓度条件下，尽管可以实现三氮唑的完全降解，细菌生长延滞期明显延长。
本实施例说明虽然Shinella sp.NJUST26可实现较高浓度三氮唑的完全降解，但处理效率有待改进。
实施例3 pH值对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度为100mg/L，初始pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的三氮唑模拟废水，将Shinella sp.NJUST26种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图2所示，在初始pH为6.0-7.0的条件下，Shinella sp.NJUST26可实现三氮唑的高效率降解；在初始pH为5.0、6.0的条件下，Shinella sp.NJUST26也可实现三氮唑的完全降解，但降解速率明显较慢；而在pH为4.0的条件下，三氮唑降解极为缓慢，在末期甚至停止降解；而在pH为3.0、9.0和10.0的条件下，三氮唑完全不能被降解。
本实施例说明Shinella sp.NJUST26的降解三氮唑的最佳pH值条件为中性至弱酸性；在pH为5.0-8.0的范围内，三氮唑降解速率相对较高；过低和过高的pH条件都不利于三氮唑的降解。
实施例4 易降解有机碳源的存在对三氮唑降解性能的影响
配制三氮唑浓度为100mg/L、外加易降解有机碳源(蔗糖、酵母抽提物和琥珀酸)浓度分别为500mg/L、1000mg/L和2000mg/L的模拟废水，将Shinella sp.NJUST26种子液以2％的接种量接入模拟废水。由图3所示，500mg/L酵母抽提物的加入对于三氮唑的降解速率的提升最明显；而2000mg/L酵母抽提物的加入则延缓了三氮唑的降解；蔗糖的加入对三氮唑降解速率的影响与酵母抽提物类似，而加入的琥珀酸的只有在500mg/L时才对三氮唑降解速率的提升有帮助，1000mg/L和2000mg/L的琥珀酸在三氮唑降解后期会对降解有一定阻碍作用。
本实施例说明低浓度的易降解碳源的存在有利于Shinella sp.NJUST26的生长，从而促进了三氮唑的降解过程；高浓度的易降解碳源的存在消耗了氧气和营养元素，对三氮唑的降解产生竞争性抑制。

Claims (4)

1.一株具有三氮唑降解功能的申氏杆菌，其特征在于，它于2015年3月4日在中国典型培养物保藏中心CCTCC保藏，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015081，命名为申氏杆菌NJUST26，其分类命名为Shinella sp.。
2.如权利要求1所述的申氏杆菌，其特征在于，所述的申氏杆菌菌落特征和生理生化特征为：NJUST26菌落呈白色，圆形，边缘整齐，中心有褶皱；革兰氏阴性，催化酶阴性，氧化酶阳性，接触酶阳性，不能水解淀粉。
3.一种如权利要求1所述的申氏杆菌在三氮唑废水治理中的应用。
4.根据权利要求4所述的申氏杆菌在三氮唑废水治理中的应用，其特征在于，所述的三氮唑废水的pH值为3-10。
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