CN101928690A - 能够高效降解尼古丁的申氏杆菌hzn1及其应用 - Google Patents

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本发明提供一株新型高效降解尼古丁的申氏杆菌HZN1及其应用。所述申氏杆菌(Shinella sp.)HZN1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 2010154，保藏日期：2010年6月23日。本发明的尼古丁降解菌可通过直接投加的方式应用于水体中尼古丁的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的尼古丁，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

Description

能够高效降解尼古丁的申氏杆菌HZN1及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一株能够高效降解尼古丁的申氏杆菌HZN1及其应用。
(二)背景技术
尼古丁(nicotine)，俗称烟碱，是多种烟草中所特有的、最重要的生物碱，占烟草重量的1％～2％，是影响烟叶品质的重要因素之一，同时也是烟叶和卷烟的主要有害成分之一。尼古丁的分子式为C10H14N2，结构如下式所示：
Figure BDA0000023629270000011
因为尼古丁是一种精神药品，所以人类长期保持着吸食烟草的习惯。然而，尼古丁是烟叶和烟气中主要致癌成分烟草特有亚硝胺(TSNA)的重要前体物，长期吸烟不仅会导致人体对尼古丁的依赖性，而且过量吸入会抑制人体中枢神经，麻痹心脏，严重者会有致命的危险；尼古丁也是一种环境有毒物质，纯净的尼古丁在常温下是无色、味苦、有强烈刺激性的油状液体，在空气中极易被氧化成暗灰色。烟气环境中就含有大量的尼古丁，目前我国部分烟叶中尼古丁含量过高，尤其是在上部烟叶中的含量普遍过高，这给烟叶生产带来很大挑战。同时，烟草在加工过程中会产生浓度较高的尼古丁的废料，这种废料被认为是“有毒的危险废物”，对环境造成很大的危害。因此不断控制和降低卷烟中尼古丁含量是国际烟草业发展的必然趋势，也是降低吸烟危害的重要途径之一；同时降低环境中尼古丁含量以及减少烟草废弃物对环境的污染对于维护人类健康有着深远的意义。
尼古丁的化学结构和化学性质比较稳定，若用物理、化学的方法去除，则成本较高，且有害副产品较多，还会影响到烟草原有的优良品质；而微生物对烤烟中尼古丁的代谢具有独特的作用，若用微生物代谢的方法去除尼古丁，不仅成本低，有害副产品少，而且不影响烟草原有的优良特性，因此有着广阔的应用前景。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种新型尼古丁降解菌及其应用。
本发明采用的技术方案是：
一株能够高效降解尼古丁的降解菌——申氏杆菌(Shinella sp.)HZN1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 2010154，保藏日期：2010年6月23日。
所述申氏杆菌HZN1部分生物学特征如下：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.5μm～2.0μm)，菌落平滑，呈淡黄色，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。该菌株16S rDNA的Genbank登陆号为HM 535627。
本发明还涉及所述的申氏杆菌HZN1在微生物降解尼古丁中的应用。优选的，所述降解在pH7.0、30℃下进行。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的尼古丁降解菌可通过直接投加的方式应用于水体中尼古丁的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的尼古丁，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。
(四)附图说明
图1为本发明尼古丁降解菌的电镜图；
图2为尼古丁的标准曲线图；
图3为本发明的尼古丁降解菌在纯培养条件下对浓度为200mg/L的尼古丁的降解曲线图；
图4为本发明的尼古丁降解菌在尼古丁浓度为200mg/L纯培养条件下的生长曲线图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：菌株的筛选与鉴定
培养基：
无机盐培养基：NaCl 1g，K2HPO4 1.5g，KH2PO4 0.5g，(NH4)2SO4 1.5g，MgSO4 0.1g，1ml微量元素溶液，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得，其中微量元素溶液按如下组成配制：MnSO4·H2O 0.13g，ZnCl2 0.23g，CuSO4·H2O0.03g，CoCl2·6H2O 0.42g，Na2MoO4·2H2O 0.15g，AlCl3·6H2O 0.05g，用蒸馏水补足至1000ml。
富集培养液：在无机盐培养液中加入尼古丁，使得尼古丁的浓度为200mg/L。
LB培养液：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。
LB固体培养基：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，蒸馏水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后制得。
菌株分离纯化：
污泥样品采自杭州农药厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养(30℃，150rpm)1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养(30℃，150rpm)1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。
取最后一次培养所得的培养液少许进行梯度稀释，取稀释后的培养液150μl涂布于含500mg/L尼古丁的LB固体平板上，置于恒温培养箱(30℃)中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含500mg/L尼古丁的LB固体平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体试管中振荡培养(30℃，150rpm)过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养3d，通过高效液相色谱法(HPLC)检测各富集培养液中尼古丁的残留量，最后筛选获得一株能高效降解尼古丁的菌株，命名为HZN1。
菌株鉴定：
将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.5μm～2.0μm)，菌落平滑，呈淡黄色，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐、柠檬酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。该菌株最适宜的生长条件为pH值7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为shinella属。
实施例2：菌剂制备
1、将保藏于液体试管中的菌种接种于40ml的无机盐培养液中活化培养4d；
2、将活化好的菌种接种于100ml含50～500mg/L尼古丁的LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡培养至对数生长期；
3、将上述处于对数生长期的菌液进行离心(6000rpm)3min，弃上清，菌体用适量的pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，此即为菌剂。
pH为7.0的0.2mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用超纯水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌(121℃、20min)后即得。
实施例3：尼古丁降解实验
无机盐培养液中菌体浓度与尼古丁含量的检测：
本实验中菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体在600nm处的吸光度值来表示。
本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养液中尼古丁的残留量。高效液相色谱(HPLC)检测条件：流动相为甲醇∶1mM H2SO4＝10∶90(体积比)，分析柱为Grace Alltima C18 Column(4.6×250mm，5μm)，流速为0.6ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。
以不同浓度尼古丁溶液进行高效液相色谱法检测，以尼古丁浓度为横坐标、吸收峰面积为纵坐标绘制尼古丁标准曲线，标准曲线见图2。
尼古丁降解实验：
取3个250ml锥形瓶，均加入100ml无机盐培养液，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)后加入尼古丁，使其浓度均为200mg/L，取适量的尼古丁降解菌菌种接种于此无机盐培养液中，相应的设置3个不含该菌种的作为空白对照，然后一同置于摇床(30℃，150rpm)中黑暗振荡培养。在培养时间为0、2、4、6、8h时定时取样，根据上述检测方法来检测无机盐培养液中菌体的生长量与尼古丁的残留量。
本发明菌株在纯培养条件下对200mg/L浓度的尼古丁的降解曲线如图3所示，菌体的生长曲线如图4所示。由图3可知，培养8h后，本发明的尼古丁降解菌对200mg/L的尼古丁的降解率接近为100％，所有未加菌的空白对照8h后的水解率均小于5％。
实验结果表明该菌种对高浓度的尼古丁具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型尼古丁降解菌，因此，该菌对研究尼古丁的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中尼古丁的降解尤其是集中修复具有一定的积极意义。

Claims (4)

1.一株能够高效降解尼古丁的降解菌——申氏杆菌(Shinella sp.)HZN1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC No：M 2010154，保藏日期：2010年6月23日。
2.如权利要求1所述的申氏杆菌HZN1，其特征在于所述申氏杆菌HZN1的生物学特征如下：革兰氏染色反应阴性，菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为(0.5μm～1.0μm)×(1.5μm～2.0μm)，菌落平滑，呈淡黄色，接触酶阳性，氧化酶阳性，能利用β-环糊精、淀粉、葡萄糖、吐温40、乙酸盐，乙酰甲基甲醇试验阴性，甲基红试验阴性。
3.如权利要求1所述的申氏杆菌HZN1在微生物降解尼古丁中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在pH7.0、30℃下进行。
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