CN102965310A

CN102965310A - 申氏杆菌及其在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用

Info

Publication number: CN102965310A
Application number: CN2012104606844A
Authority: CN
Inventors: 马云; 刘学虎
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Xie Bing
Priority date: 2012-11-14
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2032-11-14
Also published as: CN102965310B

Abstract

本发明提供了一株新型高效对乙酰氨基酚降解菌——申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2，及其在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012405。本发明所述申氏杆菌HZA2可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中对乙酰氨基酚的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的对乙酰氨基酚，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

Description

申氏杆菌及其在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用

（一）技术领域

本发明涉及一株新型高效对乙酰氨基酚降解菌——申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2，及其在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用。

（二）背景技术

对乙酰氨基酚（Acetaminophen），药品名称为扑热息痛（Paracetamol，APAP，醋氨酚）。为白色结晶性粉末，有解热镇痛作用，常用作抗炎药和止痛药等，从20世纪50年代起就得到普遍应用，其分子结构式如式（I）所示。对乙酰氨基酚无臭，味苦，熔点169～171℃，相对密度1.293(21 / 4℃)，能溶于酒精、丙酮和热水，不溶于石油醚及苯，饱和水溶液pH值为5.5～6.5。

对乙酰氨基酚作为一处常规的镇痛与退烧处方药，在全世界范围内被广泛应用。长期服用对乙酰氨基酚，其代谢产生的毒性中间体会与肝中重要的酶和蛋白质分子进行不可逆结合，可导致肝坏死。当该类药物在饮酒后使用时，会大大影响到糖类、脂肪、能量和维生素的代谢，加重中毒，过量使用对乙酰氨基酚会导致高铁血红蛋白症、DNA链的断裂，会抑制DNA复制和修复系统，还会引起乳腺癌细胞的增生。较大部分对乙酰氨基酚并没有在体内发生代谢作用，而被直接排出体外，污染了环境。同时，污水处理厂并不能完全去除厂对对乙酰氨基酚，一般污水处理厂去除率仅在85 %左右。环境中暴露的对乙酰氨基酚及其降解中间产物会对人和动物造成危害，对乙酰胺基酚对靶标生物和非靶标生物均存在较大的安全风险。通过生物富集等环境行为会加重对乙酰氨基酚污染的危害性和风险性。所以，为保证人们的健康和生态安全，在合理用药的同时，寻求合适可行的去除环境中对乙酰氨基酚污染物的方法显得尤为重要。

对乙酰氨基酚的化学结构和化学性质比较稳定，若用物理、化学的方法去除，则成本较高，且有害副产品较多，而微生物对芳香烃有机物具有独到的降解作用，利用微生物代谢方法去除对乙酰氨基酚，不仅成本低，而且有害副产品少，处理效率高，有着广阔的应用前景。

微生物是一类种类多、繁殖快、适应性强、代谢能力强的生物体。若能筛选分离出能高效降解对乙酰氨基酚的微生物，将对乙酰氨基酚降解成羧酸、氨基酸等对人体和环境无毒害的物质，这对维护人类健康和生态安全有着深远的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一株新型高效申氏杆菌属对乙酰氨基酚降解菌HZA2及其应用。

本发明采用的技术方案是：

申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012405。

所述申氏杆菌属HZA2的16S rDNA的Genbank登陆号为JX878616。

申氏杆菌属HZA2（Shinella sp.HZA2）菌株的筛选与鉴定：

1）培养基

无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，溶剂为去离子水。

富集培养液：在无机盐培养基中加入对乙酰氨基酚，使得对乙酰氨基酚的终浓度为200mg/L。

LB液体培养基：每升培养液中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

LB固体培养基：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州污水处理厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液100 ml中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液5 ml进行梯度稀释（10^-3，10^-4、10^-5、10^-6），取各个稀释后的培养液100μl涂布于含200mg/L对乙酰氨基酚的LB固体培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含200mg/L对乙酰氨基酚的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心（6000rpm，5min）后接至富集培养液中30℃培养3d，通过高效液相色谱法（HPLC）检测各富集培养液中对乙酰氨基酚的残留量，最后筛选获得一株能高效降解对乙酰氨基酚的菌株，命名为HZA2。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为 (0.5~1.0) × (1.5~2.0) μm，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈淡黄色，革兰氏染色反应阴性，能利用淀粉、葡萄糖，乙酰甲基甲醇试验阴性，V.P.反应阴性，抗氨苄青霉素、卡那霉素，不抗庆大霉素。该菌株最适宜的生长条件：pH值为7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Shinella属，因此命名为申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2。

本发明还涉及所述的申氏杆菌HZA2在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用。

具体的，所述降解在20~ 40℃、pH 5.5 ~ 8.5、黑暗条件下进行，一般需振荡（100~200 rpm）。

优选的，所述降解在30℃，pH 7.0、150rpm、黑暗条件下进行。

在对乙酰氨基酚终浓度为200mg/L的无机盐培养基，加入含申氏杆菌HZA2的细胞悬液构成反应体系，在20~ 40℃、pH值为5.5~ 8.5的条件黑暗振荡培养6~10h，即可使反应液中对乙酰氨基酚的质量残留量小于0.1%；所述含申氏杆菌HZA2的细胞悬液加入量使反应体系中申氏杆菌HZA2终浓度为1×10⁷~5×10⁷个/ml。

实际应用中，所述菌株通常需要经过活化和扩大培养，具体过程如下：

（1）斜面培养：将申氏杆菌HZA2接种于斜面培养基，20~ 40℃培养3~5天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g/L，蛋白胨5.0g/L，氯化钠10.0g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养基中，20~ 40℃培养3~5天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度组成为：每升培养液中含有NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH4）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，溶剂为去离子水，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂ 0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，溶剂为去离子水。

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基中，30℃、150rpm振荡养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心，弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含申氏杆菌HZA2的细胞悬液，该细胞悬液可投加于水体或土壤中用于对乙酰氨基酚的降解；所述LB液体培养基终浓度组成为：每升培养中含有酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，溶剂为去离子水，自然pH值。

本发明菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量菌体（即含菌细胞培养液）在600nm处的吸光度值来表示。

本发明采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中对乙酰氨基酚的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：H₂O=15:85（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

本发明所述申氏杆菌HZA2可通过直接投加的方式应用于水体和土壤中对乙酰氨基酚的降解，能安全、高效、快速的降解水体、土壤等物体上残留的对乙酰氨基酚，含有该菌株的菌剂制备工艺简单，成本低廉，使用方便，具有很好的应用前景。

（四）附图说明

图1 为本发明申氏杆菌HZA2的电镜图；

图2为对乙酰氨基酚的标准曲线图；

图3为本发明的申氏杆菌HZA2在纯培养条件下对浓度为200mg/L的对乙酰氨基酚的降解曲线图；

图4为本发明的申氏杆菌HZA2在对乙酰氨基酚浓度为200mg/L纯培养条件下的生长曲线图。

图5为温度对降解率的影响图。

图6为pH值对降解率的影响图。

图7为对乙酰氨基酚初始浓度对降解率的影响图。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：菌株的筛选与鉴定

1）培养基

无机盐培养基的配制：NaCl 1g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，（NH₄）₂SO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.1g，1ml微量元素溶液，去离子水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得，其中每升微量元素溶液中含MnSO₄﹒H₂O 0.13_g，ZnCl₂0.23g，CuSO₄﹒H₂O 0.03g，CoCl₂﹒6H₂O 0.42g，Na₂MoO₄﹒2H₂O0.15g，AlCl₃﹒6H₂O 0.05g，用去离子水补足至1000ml。

LB液体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，去离子水补足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

LB固体培养基的配制：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，去离子水足至1000ml，混合后搅拌均匀，自然pH值，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后制得。

2）菌株分离纯化

污泥样品采自杭州污水处理厂，取5ml污泥样品置于250ml锥形瓶中，加入100ml富集培养液，黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，取5ml上层浊液于新鲜的富集培养液中，继续黑暗振荡培养（30℃，150rpm）1周，重复上述操作过程3次，每次培养的接种物均取自于上次培养所得的培养液。

取最后一次培养所得的培养液5ml进行梯度稀释（（10^-3、10^-4、10^-5、10^-6），取各个稀释后的培养液100μl涂布于含200mg/L对乙酰氨基酚的LB固体培养基平板上，置于恒温培养箱（30℃）中培养，待平板上长出菌落后，挑取各菌落于含200mg/L对乙酰氨基酚的LB固体培养基平板上反复纯化，直至菌落单一，将纯化后的各菌落分别接至LB液体培养基试管中振荡培养（30℃，150rpm）过夜，将培养好的菌液离心后接至富集培养液中培养3d，通过反相高效液相色谱法检测各富集培养液中对乙酰氨基酚的残留量，最后筛选获得一株能高效降解对乙酰氨基酚的菌株，命名为HZA2。

3）菌株鉴定

将上述获得的菌株进行形态特征和分子生物学鉴定，该菌株的电镜照片如图1所示。该菌株的主要生物学特征为：菌体杆状，端生鞭毛，无芽孢，大小约为 (0.5~1.0) × (1.5~2.0) μm，菌落平坦，中间凸起，边缘扩散，呈淡黄色，革兰氏染色反应阴性，能利用淀粉、葡萄糖，乙酰甲基甲醇试验阴性，V.P.反应阴性，抗氨苄青霉素、卡那霉素，不抗庆大霉素。该菌株最适宜的生长条件：pH值为7.0，温度30℃。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Shinella 属，因此命名为申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2（CCTCC No: M 2012405）。

实施例2：含菌细胞悬液的制备

（1）斜面培养：将申氏杆菌HZA2接种于斜面培养基，30℃培养3~5天，获得菌体斜面；所述斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉10g，蛋白胨5.0g，氯化钠10.0g，琼脂20g，去离子水1000ml；

（2）种子培养：从步骤（1）菌体斜面上挑取一接种环菌体接种至无机盐培养基中，30℃培养3~5天，获得种子液；所述无机盐培养基终浓度组成同实施例1；

（3）扩大培养：将步骤（2）获得的种子液以体积浓度10~20%的接种量接种至LB液体培养基（100 mL）中，30℃、150rpm振荡培养至对数生长期，获得菌液，将菌液离心（6000rpm，5min），弃上清，沉淀用pH值为7.0的磷酸缓冲液悬浮，获得含申氏杆菌HZA2细胞悬液100 mL，其中细胞悬液中的申氏杆菌HZA2浓度为5×10⁸个/ml；所述LB液体培养基终浓度组成同实施例1；pH值为7.0的0.2 mol/L的磷酸缓冲液的配方为：取0.2 mol/L的磷酸二氢钠39ml和0.2mol/L的磷酸氢二钠61ml，用去离子水定容至1000ml，高压蒸汽灭菌（121℃、20min）后即得。

实施例3：对乙酰氨基酚的降解实验

1）无机盐培养基中菌体浓度与对乙酰氨基酚含量的检测：

菌体生长量采用紫外分光光度计来检测，通过测量培养液中菌体在600nm处的吸光度值来表示。

本实验采用反相高效液相色谱法检测无机盐培养基中对乙酰氨基酚的残留量。反相高效液相色谱检测条件：流动相为甲醇：H₂O=15:85（体积比），分析柱为Grace Alltima C18色谱柱 (4.6×250mm，5μm)，流速为0.8ml/min，进样量为20μl，柱温为30℃。

2）对乙酰氨基酚降解实验：

取4个250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入对乙酰氨基酚，使对乙酰氨基酚浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml（细胞浓度5×10⁸个/ml），分别接种于此无机盐培养基中，使申氏杆菌HZA2终浓度约为2.5×10⁷个/ml，分别于25， 30，35，40℃培养摇床（pH 值为7.0，150rpm），每小时定时取样测定残残留对乙酰氨基酚浓度。

取6个250ml锥形瓶，加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入对乙酰氨基酚，使对乙酰氨基酚浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml（细胞浓度5×10⁸个/ml），分别接种于此无机盐培养基中，使申氏杆菌HZA2终浓度约为2.5×10⁷个/ml，分别于pH 5.5，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5培养摇床（30℃，150rpm），每小时定时取样测定残留对乙酰氨基酚浓度。

取3个250ml锥形瓶，均加入100ml无机盐培养基，高压蒸汽灭菌（121℃，20min）后加入对乙酰氨基酚，使对乙酰氨基酚浓度均为200 mg/L，各取实施例2方法获得的含菌细胞悬液5ml（细胞浓度5×10⁸个/ml），分别接种于此无机盐培养基中，使申氏杆菌HZA2终浓度约为2.5×10⁷个/ml，相应的设置3个不含该菌种的实验作为空白对照，然后一同置于摇床（30℃，pH值为7.0，150rpm）中黑暗振荡培养。在培养时间为0、1、2、3、4、5、6、7、8h时定时取样，根据上述检测方法来检测无机盐培养基中菌体的生长量与对乙酰氨基酚的残留量。

将对乙酰氨基酚标准品用无菌水溶解，在反相液相色谱测试标准曲线，对乙酰氨基酚标准曲线如图2所示，标准曲线方程为y=13.606x+5.2807，R²=0.9994，y为峰面积，x为对乙酰氨基酚浓度）。

本发明菌株对200 mg/L浓度的对乙酰氨基酚的降解曲线如图3所示，菌体的生长曲线如图4所示，图4可以看出OD₆₀₀从0.20增加到0.65，说明菌体生长良好，观察图3，可以发现，培养6h后，本发明的对乙酰氨基酚降解菌对200 mg/L的对乙酰氨基酚的降解率接近为100%，反应液中对乙酰氨基酚的质量残留量分别为0.1%，0.08%和0.05%所有未加菌的空白对照在6h后的水解率均小于5%。

实验结果表明该菌种对中、高浓度（见图7）的对乙酰氨基酚具有非常好的降解能力，而且此菌种为新型对乙酰氨基酚降解菌，因此，该菌对研究对乙酰氨基酚的降解途径与降解基因具有非常大的促进作用，对环境中对乙酰氨基酚的降解尤其是对对乙酰氨基酚的集中修复具有较大的积极意义。

Claims

1.申氏杆菌（Shinella sp.）HZA2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072，保藏日期为2012年10月15日，保藏编号为CCTCC No: M 2012405。

2.如权利要求1所述的申氏杆菌HZA2在微生物降解对乙酰氨基酚中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在20~ 40℃、pH 5.5 ~ 8.5、黑暗条件下进行。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述降解在30℃，pH 7.0、150rpm、黑暗条件下进行。