CN117757673A - 一株扑热息痛高效降解菌及其在饮用水源生物修复中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株扑热息痛高效降解菌及其在饮用水源生物修复中的应用。一株扑热息痛降解菌,Microbacterium sp.SF‑1,于2023年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮编:510070,保藏编号为:GDMCC No:64086。本发明通过在饮用水处理厂的石英砂生物滤池中富集并筛选出扑热息痛降解菌,并应用于饮用水源生物修复。本发明的一株扑热息痛降解菌,可在8天内使浓度为50mg/L扑热息痛降解96%,将其固定化于多面体空心聚丙烯球可实现对扑热息痛微污染水体的修复。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域,具体涉及一株扑热息痛降解菌及其在饮用水源生物修复中的应用。
背景技术:
扑热息痛是世界范围广泛使用的一株解热镇痛药,其化学成份为对乙酰氨基酚。目前,扑热息痛已成为我国原料药中产量和出口量最大的品株之一。扑热息痛在水环境中的污染来源主要是工业生产过程的废水排放、家用排放、人类和动物的分泌排放等,其对环境和生态的水生毒性、遗传毒性、内分泌干扰等负效应已引起广泛关注。由于其大量的使用,在污水处理厂出水、地表水、地下水及饮用水中频繁被检测到。而传统的饮用水处理工艺并不能将其有效去除。因此,如何有效去除扑热息痛,保证与人体健康息息相关的饮用水安全具有十分重要的意义。
目前,已报道的扑热息痛去除方法主要包括电化学法、臭氧氧化、H2O2/UV氧化、TiO2光催化等高级氧化法,但高级氧化法具有操作复杂、运行和维护费用高、耗能大等缺点。少数文献中涉及微生物降解扑热息痛,生物处理虽然速度比较慢,但是去除痕量污染物的效果最好,在降解过程不需要提供额外的能量,成本低、特异性强、且不会带来二次污染。但相关降解菌株的选育都是从污水厂的活性污泥中获得,且应用方向也是针对污水处理,不适合应用于饮用水中低浓度的污染物的去除。首先,作为饮用水系统的外来菌株对饮用水贫营养环境适应性差,同时在安全性上也容易产生争议。因此,直接从饮用水环境中筛选土著菌用于饮用水微污染处理不但安全性有保障,对贫营养环境的适应性更强,是一株经济、环保且有效的方法,在饮用水生物修复中具有巨大的应用潜力。
发明内容:
为了解决上述技术问题,本发明提供了一株扑热息痛高效降解菌及其在饮用水源生物修复中的应用。
本发明通过在饮用水处理厂的石英砂生物滤池中富集并筛选出扑热息痛降解菌,并应用于饮用水源生物修复。本发明的一株扑热息痛降解菌,可在8天内使浓度为50mg/L扑热息痛降解96%,将其固定化于多面体空心聚丙烯球可实现对扑热息痛微污染水体的修复。具体地,本发明包括以下内容。
本发明的第一个目的是提供了一株扑热息痛降解菌,Microbacterium sp.SF-1,于2023年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮编:510070,保藏编号为:GDMCC No:64086。
本发明的第二个目的是提供了上述扑热息痛降解菌Microbacterium sp.SF-1在降解扑热息痛中的应用。
优选,是在饮用水源生物修复中的应用。
优选,所述饮用水源生物修复为含扑热息痛污染的饮用水源生物修复。
优选,所述的应用是将Microbacterium sp.SF-1固定化于多面体空心聚丙烯球上对饮用水源中的扑热息痛进行降解。
进一步优选的,所述将Microbacterium sp.SF-1固定化于多面体空心聚丙烯球上是把活化后的Microbacterium sp.SF-1接株于装有已灭菌的多面体空心聚丙烯球的培养基中,放于静止培养,让Microbacterium sp.SF-1细胞挂膜于多面体空心聚丙烯球表面。
本发明的第三个目的是提供一种降解扑热息痛的方法,其特征在于,是用Microbacterium sp.SF-1降解降解扑热息痛。
与现有技术相比,本发明具有如下优点和有益效果:
(1)本发明在饮用水源生物修复中能有效去除扑热息痛;
(2)本发明对低浓度(ppb级)和高浓度(ppm级)的扑热息痛去除效果显著;
(3)本发明具有降解速率快,稳定性高,环境适应性强等特点,低碳好氧条件下,固定化装置稳定运行24h后,当扑热息痛初始浓度为500μg/L时,扑热息痛的降解率为88%;当扑热息痛初始浓度为50μg/L,扑热息痛的降解率为97%。
Microbacterium sp.SF-1,于2023年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮编:510070,保藏编号为:GDMCCNo:64086。
附图说明:
图1是扑热息痛降解菌SF-1的16SrDNA系统发育树;
图2是扑热息痛降解菌Microbacterium sp.SF-1的特异性分子靶标对65株微杆菌属以及其他菌属检测的电泳图(图中标号C为空白对照;1,25,49泳道为目标微杆菌株SF-1;2-5泳道均为其他非目标微杆菌株;其他泳道代表除微杆菌属以外的菌;目标条带大小为312bp)。
图3是扑热息痛降解菌Microbacterium sp.SF-1实时荧光定量结果图;
图4是扑热息痛降解菌Microbacterium sp.SF-1降解性能的评估;
图5是固定化Microbacterium sp.SF-1对不同初始浓度扑热息痛的降解情况;Strain SF-1为实验组,当微生物固定化水处理装置运行24h后,扑热息痛的去除率;Control为对照组,当固定化装置运行24h后,扑热息痛的去除率。
具体实施方式:
现详细说明本发明的多株示例性实施方式,该详细说明不应认为是对本发明的限制,而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式,并非用于限制本发明。另外,对于本发明中的数值范围,应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
实施例1扑热息痛降解菌株的筛选与鉴定
细菌富集包括,称取10g石英砂样品,加入扑热息痛浓度为50mg/L的无机盐培养基中,放入30℃,120r/min摇床中进行富集,当富集到第7天时,吸取1mL富集样加入到另一个含有更高扑热息痛浓度的无机盐培养基中,整个过程重复7次,共富集49天,最终扑热息痛浓度达到80mg/L,49天后获得微生物富集培养物。
所述无机盐培养基包括下述组分:MgSO4.7H2O,0.1g;NaCl,0.2g;;NH4Cl,0.5g;;Na2HPO4.12H2O;,0.5g;KH2PO4,0.5g;;FeCl3.6H2O,0.1g;;CaSO4.H2O,0.1g;,并以扑热息痛为唯一碳源。
单菌落筛选包括,吸取1mL微生物富集培养物分别稀释到10-1-10-6,并吸取稀释液0.2mL涂布在80mg/L扑热息痛为唯一碳源的无机盐培养基平板上,30℃培养48h,筛选出具有不同形态的单菌落进行分离纯化,由此获得菌株SF-1。
经16s rRNA基因鉴定(SEQ ID NO.1),本发明的菌株SF-1为微杆菌属(图1),与Microbacterium esteraromaticum strain TJ-1-56的16S rRNA具有100%的序列相似性。将其命名为:Microbacterium sp.SF-1,于2023年11月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC),地址:广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,邮编:510070,保藏编号为:GDMCC No:64086。
SEQ ID NO.1
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实施例2微杆菌的特征序列分析
主要根据微杆菌的泛基因组分析结果获得其特有的非必需基因。共选取了122株代表性微杆菌属(含分析菌株)的基因组序列来进行泛基因组分析。泛基因组采用原核生物泛基因组自动化分析软件(Pan-Genomics Analysis Pipeline,PGAP)中的MP方法来分析,通过本地Perl脚本对分析结果进行处理,得到所有菌株的核心基因及非核心基因信息。
提取这株菌特有的非核心基因蛋白序列,通过本地Blast分别将其比对到微杆菌的蛋白总库及NCBI非冗余蛋白数据库(NR)。去除能比对到已知的微杆菌蛋白的序列,剩下的则为菌株Microbacterium sp.SF-1特有基因。特有基因可通过在微杆菌属及其他菌属中PCR扩增进行特异性检验。通过PCR特异性检验结果表明(表2和图2),菌株SF-1携带了特有基因,即特异性分子靶标,序列如SEQ ID No:2所示,该特异性分子靶标可通过表1中的引物SEQ ID No:2进行扩增检验。
SEQ ID No:2:
ATGACGGCGGACCTCGTCGTCGACGTGCTCGGCCTGCACGTCCTGATCGAGCCGGGGGATGCCCTCGACGAGGCGCAGTGCGAGCGACTCCGCGCGGCATGGAGCGGCGCGGTCAGCGCGGATGCCGTGACGACGCCCGACCTCACCGTCTCCTTCGACGCCGAAGCGTCCTTCGACGAGGGGATGGAGCGTCTCACCGTCGACGTGACGCTCGCCGCCCTGGAAGCCCTCCGCGGGCGTGCGCTGATGTTCCACGCGGCGGGGGTGGCGGATGCCGAGGGGCGGGTCGTCGCGTTCGTCGGCCCGTCCGGCCGCGGTAAGACGACCCTCAGCCGGACGCTCGGACGTCGGTTCGGCTACGTCTCCGACGAGACCGTCGCTGCGGACGAGTCCCGAGCCGTGCATCCGTACCGCAAGCCGCTGTCCGTGGTGCGCGAGGGCCTCCCCAAGGAGCAGGTCTCGCCCGTCGACGCGGGGCTGCTCCCGGTGCCCTCGGCTCCCCTGCGGCTCAGCGGGCTCGTGCTGATCGATCGTGATCCGGAGCTCGCCGCCCCGCAGCTGAGCACCGTGCCCCTCGCCGAGGCGCTGCCCGAGCTCGTGACGCAGATGAGTTACCTGCGCGATCATCCGGCTCCGCTGCAGTCGATCGCCCGCCTGTGCGATGCGGTCGGAGGCGTGCGGATGCTGCGCTATCCGGACGCCGAGACCGTGCCGGCGATCATGCCCGACATCTTCAGCGCTGAACCCGCGGCATCCGCATGGCATCCGCTGGCGCTGCCGGAGGCGAGCGGCCCGTACGGCGTCGGGCAGGCGCGGGACGCCATCCGATCCGACGACTACCTCATCGTCATGGTGGAGTCCGAGCTGAAGGTGCTCGACGGCATCGCGCCCGCCATCTGGCAGGCGGCTGCGGACGGCGCCGACCTCGAAGGCATCATCGGCGCCATCGTGGACGCGCATGGCGAGCCTCCCGCCGGCTCGGCGCGGCAGATCGTCACAGACGCCGTGGACGAGCTCGTCGTCGCCGGCGTGATCAGCCGCATCTGA
表1本发明所述菌株特有基因扩增引物序列
特异性分子靶标SEQ ID NO:1的扩增体系为:引物1:35-R,0.5μL;引物2:35-F,0.5μL;Mix:12.5μL;ddH2O,10.5μL;模板DNA,1μL。
特异性分子靶标SEQ ID NO:1的PCR条件为:95℃预变性5min;95℃变性30s;60℃退火30s;72℃延伸90s;72℃保温10min;35个循环。
使用琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖浓度为1.5%)进行PCR产物的检测,判断凝胶电泳检测扩增产物在312bp是否存在单一扩增条带,检测结果栏目中“+”表示阳性,“-”表示阴性。
表2菌株微杆菌SF-1分子靶标检测方法建立的实验结果
实施例3微杆菌SF-1的定量测定
将菌株SF-1初始浓度为15.7ng/μL的DNA模版按照10倍梯度稀释(100、10-1、10-2、10-3、10-4)为不同拷贝数的DNA模版进行实时荧光定量测定,反应体系为20μL,其中包括:引物1:35-R,2μL;引物2:35-F,2μL;HKStart SYBR qPCR SuperMix Plus:10μL;ddH2O,3μL;模板DNA,3μL。
实时荧光定量PCR反应条件为:95℃预变性1min;95℃变性20s;60℃退火20s;72℃延伸30s;最后72℃延伸10min;2-4步共45个循环。
经过实时荧光定量PCR得到微杆菌SF-1的扩增的荧光阈值(CT值),以拷贝数为横坐标,CT值为纵坐标制作标准曲线。拟合标准曲线为y=-3.399x+46.203,相关系数R2为0.9939。如图3所示,标准曲线的相关系数R2>0.99,同时溶解曲线呈单峰,表明扩增条件及引物特异性适宜,该方法可用于微杆菌SF-1的定量测定。
实施例4菌株扑热息痛降解性能评估
3株形态各异的细菌从扑热息痛富集后的石英砂样品中分离筛选出来,分别定义为SF-1、SF-2和SF-3。将得到的3株纯菌落用R2A液体培养基中37℃培养12h,吸取1mL培养液于300mL含有50mg/L扑热息痛的无机盐培养基中,30℃120r/min摇床培养8天,SF-1展现出最佳的扑热息痛降解能力,它能在8天内使浓度为50mg/L扑热息痛降解96%(图3)。
实施例5菌株SF-1在实际饮用水源水处理中的降解性能评估
为了评估扑热息痛降解菌SF-1在实际饮用水源水处理中的降解效果,我们将菌株SF-1在多面体空心聚丙烯球上进行固定化,具体方法如下:把活化后的菌株SF-1接种于装有多面体空心聚丙烯球的200mL含有100mg/L扑热息痛的无机盐培养基中,放于30℃培养箱中静止培养,让菌株SF-1细胞挂膜于多面体空心聚丙烯球表面。将挂好膜的多面体空心聚丙烯球放入内径为4.0cm,工作体积为450mL的有机玻璃柱中,作为实验组,没有固定化菌株SF-1的多面体空心聚丙烯球作为对照组,构建了微生物固定化水处理装置。微生物固定化装置的进水为人工添加了不同初始浓度扑热息痛的饮用水水源,通过恒流泵把溶液注入到玻璃柱中,流速控制在4mL/min。当装置稳定运行24h后,采集处理组和对照组的出水用于扑热息痛浓度的检测。如图4,当扑热息痛初始浓度为500μg/L时,扑热息痛的降解率为88%;当扑热息痛初始浓度为50μg/L,扑热息痛的降解率为97%。由此看见,新构建的微生物固定化水处理装置对饮用水水源中污染的扑热息痛具有很好的去除效果,在饮用水水源的实际水处理中将会有较好的应用前景。
Claims (7)
1.Microbacterium sp.SF-1,保藏编号为:GDMCC No:64086。
2.权利要求1所述的Microbacterium sp.SF-1在降解扑热息痛中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,是在饮用水源生物修复中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述饮用水源生物修复为含扑热息痛污染的饮用水源生物修复。
5.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的应用是将Microbacterium sp.SF-1固定化于多面体空心聚丙烯球上对饮用水源中的扑热息痛进行降解。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述将Microbacterium sp.SF-1固定化于多面体空心聚丙烯球上是把活化后的Microbacterium sp.SF-1接株于装有已灭菌的多面体空心聚丙烯球的培养基中,放于静止培养,让Microbacterium sp.SF-1细胞挂膜于多面体空心聚丙烯球表面。
7.一种降解扑热息痛的方法,其特征在于,是用Microbacterium sp.SF-1降解降解扑热息痛。
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