CN116121112A

CN116121112A - 一株斯氏皮球菌及其在环境修复中的应用

Info

Publication number: CN116121112A
Application number: CN202211448232.4A
Authority: CN
Inventors: 熊举坤; 郭艺; 马晴; 李桂英; 安太成
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2023-05-16

Abstract

本发明公开了一株斯氏皮球菌及其在环境修复中的应用。本发明研究得到一株斯氏皮球菌(Kytococcus schroeteri)GDUTXIONG1菌株，该菌株已于2021年12月20日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20211643。本发明研究显示GDUTXIONG1菌株对有机磷阻燃剂具有优异的降解能力，能在短时间内快速降解磷酸三(丁氧基乙基)酯，降解效率能达到99％以上，属于高效降解菌，可将其应用于对环境中的有机磷阻燃剂的降解，实现环境修复的目的。

Description

一株斯氏皮球菌及其在环境修复中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株斯氏皮球菌及其在环境修复中的应用。

背景技术

有机磷阻燃剂是一种广泛使用的磷酸酯类阻燃剂，其分子结构主要由磷酸根骨架和三个取代基构成，其具有结构稳定，难以降解、生物富集性等特性。近年来有机磷阻燃剂广泛应用于电子电器、塑料和装修材料中，因此，在大气、水体、沉积物和土壤等多种环境介质中被大量检出。有机磷阻燃剂不仅能直接污染环境，还会通过电子垃圾的废弃引起间接的废品污染，给环境造成了巨大的压力，随着电子产品废弃量的增加也逐渐得到了社会各界的高度关注。

目前，有机磷阻燃剂主要采用微生物、光催化、化学氧化等降解技术，对机磷阻燃剂污染的环境进行修复。现有技术中通常采用光催化、化学氧化方式进行降解，但是采用光催化进行物理降解耗费材料量巨大、成本高昂，而采用化学氧化的方式进行降解，非主要产物多、副产物具有二次污染的风险，不适合大范围的应用。而微生物降解具有较好的降解效果，能很好地修复环境污染，且不会对环境造成二次污染，以及比其他物理或化学方式进行降解的成本要低，使其成为较为理想的有机磷阻燃剂降解方式。

然而，现有技术中也仅有少数的微生物对有机磷阻燃剂具有很好地降解效果，如短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)能降解磷酸三苯酯、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)能降解磷酸三苯酯、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)能降解磷酸三(2-氯乙基)酯、拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)能降解磷酸三(2-氯丙基)酯、曲霉(Aspergillussp.)能降解磷酸三苯酯和磷酸三甲苯酯等，目前所获得的微生物菌株能够降解的有机磷阻燃剂有限；现有技术中也未见能够降解磷酸三(丁氧基乙基)酯的微生物菌株，因此研究开发出能够高效降解磷酸三(丁氧基乙基)酯的微生物菌株，对有机磷阻燃剂污染的环境进行治理和修复具有重大意义。

发明内容

本发明提供一株斯氏皮球菌及其在环境修复中的应用。

本发明的目的是提供一株斯氏皮球菌(Kytococcus schroeteri)GDUTXIONG1菌株。

本发明的另一目的是提供一种降解有机磷阻燃剂的制剂。

本发明的又一目的是提供一种修复有机磷阻燃剂污染的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明研究得到一株斯氏皮球菌(Kytococcus schroeteri)GDUTXIONG1菌株，该菌株已于2021年12月20日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M20211643。GDUTXIONG1菌株是从污水处理厂的污泥中筛选分离、纯化得到，属于有机磷阻燃剂高效降解菌。GDUTXIONG1菌株为革兰氏阴性菌，菌落形态为圆形，黄色，不透明，菌落直径为5～8mm；菌体的形态为杆状，菌体形态为微球，菌体大小为5～10×8～15μm，边缘平整，无鞭毛。本发明研究显示斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株对1～15mg/L的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率能达到100％，对较高浓度的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率也能达到99％以上，可以用于快速降解磷酸三(丁氧基乙基)酯的污染，能够应用于环境修复以及电子垃圾污染净化治理，可降解环境中如水体、土壤和沉积物中的有机磷阻燃剂以及电子垃圾污染中的有机磷阻燃剂，其降解效果非常出色，不会造成二次污染。

因此，本发明提供所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液在降解有机磷阻燃剂、制备降解有机磷阻燃剂的制剂、在修复有机磷阻燃剂污染的环境或修复电子垃圾污染中的应用。

进一步地，所述有机磷阻燃剂污染的环境包括水体、土壤以及沉积物。

优选地，所述有机磷阻燃剂为磷酸三(丁氧基乙基)酯。

本发明提供一种降解有机磷阻燃剂的制剂，含权斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液。

本发明提供一种修复有机磷阻燃剂污染的方法，采用斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株和/或其菌液对含有有机磷阻燃剂的样本进行处理。

优选地，所述菌株的OD₆₀₀为0.8～2.0，接种量为1％～10％。

更优选地，菌株的OD₆₀₀为1.0，接种量为10％。

优选地，所述处理条件为：pH为5.0～9.0，温度为30～40℃，时间5～10d。

更优选地，处理条件为：pH为5.0，温度为37℃，时间7d。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供一株斯氏皮球菌(Kytococcus schroeteri)GDUTXIONG1菌株，通过本发明研究显示GDUTXIONG1菌株对有机磷阻燃剂具有优异的降解能力，能在短时间内快速降解磷酸三(丁氧基乙基)酯，降解效率能达到99％以上，属于高效降解菌，可将其应用于对环境中的有机磷阻燃剂的降解，实现环境修复的目的，还能应用于电子垃圾污染净化治理，其降解效果非常出色，能很好地修复环境污染，且不会对环境造成二次污染，以及比其他物理或化学方式进行降解的成本要低。

附图说明

图1为GDUTXIONG1菌株的生长形态图；

图2为GDUTXIONG1菌株的菌体形态图；

图3为GDUTXIONG1菌株的进化树结果图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 GDUTXIONG1菌株的分离纯化

本发明的样本来自广东省广州市某污水处理厂好氧污泥，对污泥样本中进行筛选分离、纯化。在无机盐培养基(配方：K₂HPO₄·3H₂O 1.5g/L，KH₂PO₄ 1.5g/L，NH₄Cl 0.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.4g/L；微量元素：CaCl₂·2H₂O 0.3g/L，MnSO₄·4H₂O0.5g/L，CuSO₄·2H₂O 0.05g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.5g/L，CoCl₂·6H₂O 0.1g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L，H₃BO₃ 0.01g/L)中添加一定量的有机磷阻燃剂(作为碳源和能源物质)进行筛选，驯化底物的浓度依次设置为1、5、10、15和20mg/L。

首先取10mL污水处理厂中的好氧污泥加入含1mg/L有机磷阻燃剂的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高浓度进行驯化。驯化结束后将得到的终浓度菌液进行稀释，在分别选取稀释梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7七个稀释度的稀释液，各取0.2mL不同梯度的稀释液，分别均匀涂布在固体培养基(配方：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)中进行培养，并挑选生长速度快、边缘整齐的单菌落，再进行富集培养，将分离得到的菌株命名为GDUTXIONG1，同时将菌种保存便于后续鉴定。

实施例2 GDUTXIONG1菌株的鉴定

1、形态学鉴定

将实施例1中分离得到的GDUTXIONG1菌株置于固体培养基上，在37℃条件下培养24h后，培养基上菌落的生长形态如图1所示：菌落形态为圆形，黄色，不透明，菌落直径为5～8mm。

在电子显微镜下观察，结果如图2所示，其形态为球状，边缘平整，无鞭毛，菌体大小为5～10×8～15μm。

2、生理生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版，对细菌生理生化指标进行检测，主要的生理生化特征如下表1所示，GDUTXIONG1菌株为革兰氏阴性菌。

表1检测菌体的生理生化检测指标及结果

注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“-”

3、16S rDNA鉴定

采用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA，具体方法参见试剂盒说明书。采用细菌的16SrDNA通用引物：7F(5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3')和1540R(5'-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')，扩增其16S rDNA基因，将扩增结果送去公司进行测序分析。

将测序得到GDUTXIONG1菌株的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析，结果如图3所示，显示GDUTXIONG1菌株与Kytococcus schroeteri最相似，相似度为99.86％。

因此，综合上述形态学鉴定、生理生化鉴定以及16S rDNA鉴定结果，将本发明分离得到的GDUTXIONG1菌株归属于皮球菌属(Kytococcus sp.)-斯氏皮球菌(Kytococcusschroeteri)，命名为Kytococcus schroeteri GDUTXIONG1菌株，并于2021年12月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M 20211643，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

实施例3 GDUTXIONG1菌株对有机磷阻燃剂的降解作用

本实施采用筛选得到的斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株对有机磷阻燃剂磷酸三(丁氧基乙基)酯的进行测定。

在顶空瓶中根据实施例1中配方配制100mL无机盐培养液，在121℃高压灭菌30min后配制无机盐培养基。将斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株在营养肉汤培养基(配方：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 5.0g/L)中富集增菌培养至OD₆₀₀为1.0左右时，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10％接种量悬浮在100mL无机盐培养基的血清瓶中，然后加入初始浓度分别为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L的磷酸三(丁氧基乙基)酯溶液，并在温度37℃、振动频率140r/min摇床下培养进行降解实验，定期取样测定培养液中磷酸三(丁氧基乙基)酯的浓度。

检测条件为：HPLC-MS-MS(Agilent 1260-6470，安捷伦科技有限公司，美国)，色谱柱采用RRHD Eclipse Plus 95A C18(100mm×2.1mm,1.8μm，安捷伦科技有限公司)，进样量为10μL，流动相为水：甲醇(30:70，V/V)，流速为0.3mL min^-1。柱温：30℃。采用MRM(多反应检测扫描)模式，正电喷雾电离(ESI)检测；去簇电位，100V；碰撞能量，20V。

检测结果如下表2所示，显示GDUTXIONG1菌株在7d对1～15mg/L初始浓度的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率达到100％，对20mg/L的浓度的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率也能达到99.9％。

表2斯氏皮球菌对不同初始浓度的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率

TBEP浓度	降解率
		1mg/L	100％
5mg/L	100％
		10mg/L	100％
15mg/L	100％
		20mg/L	99.9％

综上，本发明鉴定出一株能够高效降解有机磷阻燃剂的斯氏皮球菌(Kytococcusschroeteri)GDUTXIONG1菌株，GDUTXIONG1菌株对1～15mg/L的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率能达到100％，对较高浓度的磷酸三(丁氧基乙基)酯的降解率也能达到99％以上，可以用于快速降解磷酸三(丁氧基乙基)酯的污染，能够应用于环境修复以及电子垃圾污染净化治理，可降解环境中如水体、土壤和沉积物中的有机磷阻燃剂以及电子垃圾污染中的有机磷阻燃剂，其降解效果非常出色，不会造成二次污染。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株斯氏皮球菌(Kytococcus schroeteri)GDUTXIONG1菌株，其特征在于，该菌株已于2021年12月20日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 20211643。

2.权利要求1所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液在降解有机磷阻燃剂中的应用。

3.权利要求1所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液在制备降解有机磷阻燃剂的制剂中的应用。

4.权利要求1所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液在修复有机磷阻燃剂污染的环境或修复电子垃圾污染中的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述有机磷阻燃剂污染的环境包括水体、土壤以及沉积物。

6.根据权利要求2～5任一所述应用，其特征在于，所述有机磷阻燃剂为磷酸三(丁氧基乙基)酯。

7.一种降解有机磷阻燃剂的制剂，其特征在于，含权利要求1所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株或其菌液。

8.一种修复有机磷阻燃剂污染的方法，其特征在于，采用权利要求1所述斯氏皮球菌GDUTXIONG1菌株和/或其菌液对含有有机磷阻燃剂的样本进行处理。

9.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述菌株的OD₆₀₀为0.8～2.0，接种量为1％～10％。

10.根据权利要求8所述方法，其特征在于，所述处理条件为：pH为5～9，温度为30～40℃。