KR102455290B1 - 담수에서 분리한 페난트렌 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼 20f-2035 균주 및 이의 용도 - Google Patents

담수에서 분리한 페난트렌 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼 20f-2035 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

현재까지 페난트렌 분해 활성을 나타내는 미생물로 알려지지 않은 새로운 용도로 활용 가능한 미생물과 신균주, 이를 이용한 페난트렌 분해용 조성물 및 이를 이용한 페난트렌 분해 방법이 개시된다. 본 발명은 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 및 신균주 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주, 그리고 이를 이용한 페난트렌 분해용 조성물 및 이를 이용한 페난트렌 분해 방법을 제공한다.

Description

담수에서 분리한 페난트렌 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼 20F-2035 균주 및 이의 용도{Phialemonium inflatum 20F-2035 strain isolated from freshwater having phenanthrene degradation activity and uses thereof}
본 발명은 페난트렌 분해 활성을 가지는 미생물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유류에 의해 오염된 토양에 많이 존재하는 페난트렌에 대한 분해 활성을 가지는 미생물에 관한 것이다.
다환방향족 탄화수소(PAH, Poly Aromatic Hydrocarbon)는 2개 이상의 벤젠고리가 서로 연결되어 있는 물질이다. 단독으로 사용되는 일은 드물지만 석유화학산업에서 다양한 물질을 생산하는 데 필요한 전구체로 쓰이고 있으며, 정제되지 않은 석유나 완전히 연소되지 않은 연료에 의해 발생하는 연기에서도 발견된다. 대부분의 다환방향족 탄화수소는 발암성과 생태독성을 나타내며, 이는 연결되어 있는 벤젠고리의 수가 많을수록 증가하는 경향을 보인다. 페난트렌은 3개의 벤젠고리를 갖고 있으며, 벤조피렌이나 파이렌에 비해 독성은 낮으나 산업현장이나 오염된 토양에서 발견되는 양이 많아 PAH의 분해 연구에 대표물질로 사용되고 있다.
PAH에 의한 환경오염은 주로 기름유출사고에 의해 오염된 토양이나 석유화학과 관련된 공업단지의 공정중 발생하는 주변 토양 및 수계오염이 대부분을 차지하고 있으며, 이렇게 유출된 PAH들은 광분해, 화학적 산화 및 생분해를 통해 제거되지만, PAH 자체의 안정성으로 인해 제거되는 속도는 매우 늦다. 따라서 미처 분해되지 못한 PAH들은 토양에 잔류하게 되고, 주변 생물체 및 사람에 흡수, 축적되어 다양한 해를 끼치게 된다.
PAH에 의해 오염된 토양을 복원하는 방법은 크게 물리화학적 방법과 생물학적 방법이 있는데, 물리화학적 방법에는 토양에 축적된 PAH들을 용매를 통해 녹여내거나 공기를 불어넣어 기화시키는 방법들이 있지만, 비용이나 2차오염과 같은 문제로 인해 대부분 생물학적 처리방법이 선호되고 있으며, 이를 위해 PAH 분해활성이 높은 미생물을 찾기 위한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.
대부분의 생물학적 오염물질 처리공정에 활용되는 미생물은 세균류로서 공정개발 및 활용연구의 역사가 길면서도 비교적 다루기 쉽고 생분해성 오염물질의 분해 효율이 높다는 특징을 갖고 있다. 따라서 지금까지 미생물을 활용한 PAH 분해 연구는 주로 슈도모나스(Pseudomonas), 에어로모나스(Aeromonas), 플라보박테리움(Flavobacterium) 등 세균류에 치우쳐져 있었으나, 최근 백색부후균을 비롯한 진균류에 의한 PAH 분해 연구가 점차 증가하고 있다. 세균류의 경우 생장속도나 유기물질의 분해속도는 높으나, PAH와 같은 난분해성 오염물질이 처리대상일 경우 효율이 급격하게 떨어지며 오염물질의 종류에 따라서는 오히려 공정의 안정성에 문제를 일으킬 정도의 타격을 받기도 한다.
곰팡이 또는 버섯이 속하는 진균류의 경우 일반적인 유기물질을 분해하는 속도는 세균류에 비해 느리지만 복잡한 구조를 갖는 유기물질을 먹이로 하는 특성으로 인해 난분해성 오염물질을 처리할 수 있는 자원으로서의 가능성이 높다. 실제로 PVA(polyvinyl alcohol), 미세플라스틱 등의 난분해성 오염물질을 분해하는 진균류가 1990년대 후반부터 지금까지 꾸준하게 보고되고 있으며, 분해에 관여하는 효소에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다.
PAH를 분해할 수 있는 진균류는 파네로케이트 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium)과 같은 백색부후균(white rot fungi)이 잘 알려져 있으나, 백색부후균이라도 PAH 분해활성을 가지는 균주는 매우 적게 알려져 있어 추가적인 발굴이 필요하며, 나아가, 백색부후균 이외에 페난트렌 분해 활성을 가지는 균류는 제시되지 않고 있다.
이에, 본 발명은 현재까지 페난트렌 분해 활성을 나타내는 미생물로 알려지지 않은 새로운 용도로 활용 가능한 미생물과 신균주, 이를 이용한 페난트렌 분해용 조성물 및 이를 이용한 페난트렌 분해 방법을 제시하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum)을 제공한다.
또한 신규 미생물 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주를 제공한다.
또한 상기 균주는 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주를 제공한다.
또한 상기 균주는 담수로부터 분리된 것을 특징으로 하는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주를 제공한다.
상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 균주 또는 이의 배양물질을 유효성분으로 함유하는 페난트렌 분해용 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 상기 조성물을 페난트렌이 포함된 배지에 처리하여 페난트렌을 분해하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 기존에 알려진 미생물 이외에 페난트렌 분해 활성을 가지는 새로운 용도로 활용 가능한 미생물 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 및 신균주 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주를 제공할 수 있다.
이러한 본 발명에 따른 미생물 및 신균주는 페난트렌 분해 성능이 우수하여 오염된 토양의 생물학적 복원에 매우 적합하여, 관련 산업에 활용 가능한 생물자원으로서의 가치가 매우 높다.
도 1은 본 발명에 따른 20F-2035 균주를 PDA 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 결과를 나타낸 사진,
도 2는 본 발명에 따른 20F-2035 균주의 ITS 염기서열을 나타낸 도면,
도 3은 ITS 염기서열에 기초한 본 발명에 따른 20F-2035 균주의 분자생물학적 동정을 위한 계통도를 분석한 결과를 나타낸 도면,
도 4는 본 발명에 따른 20F-2035 균주를 페난트렌이 도말된 한천배지에서 15일간 배양하여 페난트렌이 분해된 모습을 나타낸 사진,
도 5는 본 발명에 따른 20F-2035 균주의 페난트렌 분해 활성도 측정 결과를 나타낸 그래프.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명자들은 페난트렌 분해 활성을 가지는 담수균류를 찾고자 전국 여러 담수에서 시료를 확보하였으며, 그 중 전남 함평시 함평천의 담수퇴적물에서 분리한 20F-2035 균주를 확보하였고, 순수 분리된 담수균류의 분자생물학적 동정을 실시하고자 ITS 염기서열 분석한 결과, 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum)으로 동정되었다. 상기 균주를 페난트렌이 도말된 배지에서 배양하고 페난트렌 분해율을 측정하여 페난트렌 분해 활성을 보유한 것을 확인하고, 본 발명에 이르게 되었다.
따라서, 본 발명은 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum)과, 신규 미생물 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주를 개시한다.
본 발명은 특정 미생물의 새로운 용도로서, 페난트렌 분해 활성능을 보유한 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum)를 최초로 제시하고자 하는 것이며, 따라서, 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 균주로서 페난트렌 분해를 위해 사용되는 균주, 이를 이용한 페난트렌 분해용 조성물 또는 이를 이용한 페난트렌 분해 방법들은 모두 본 발명이 예정하는 기술적 개념에 속한다고 보아야 할 것이다.
본 발명에 따른 균주는 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성이 뛰어난 것으로 확인되었다.
본 발명의 적용예에 따르면, 상기 균주 또는 이의 대사물질을 유효성분으로 함유하는 페난트렌 분해용 조성물이 제공된다.
본 발명에서 상기 균주 또는 이의 대사물질은 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양액, 상기 균주의 배양여액 등의 상태로 이용될 수 있다. 여기서, 상기 균주의 균체는 균 자체를 모두 포함하는 의미이며, 상기 배양액은 균체가 포함된 배양액을 의미하며, 상기 배양여액은 균체 비포함 배양액을 의미한다.
본 발명의 또 다른 적용예에 따르면, 페난트렌을 분해하는 방법은 상기 균주 또는 이의 대사산물의 유효량을 페난트렌이 포함된 용액에 처리하는 방법으로 수행될 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1: 페난트렌 분해 활성을 보유한 담수균류 20F-2035 균주의 분리
본 발명에서는 페난트렌 분해 활성을 지닌 담수균류를 선발하기 위하여, 하기 표 1의 균주 채집 정보로 나타낸 바와 같이, 2020년에 전라남도 함평군 신광면 지역의 함평천에서 담수퇴적물를 채집하였다. 채집한 담수퇴적물에서 담수균류를 순수 분리하기 위하여, 퇴적물 1 g을 멸균수 10 ㎖에 희석하고 이를 다시 100배까지 희석한 뒤 100 ㎕를 취하여 항생제(streptomycin, ampicilin)가 첨가된 1.5% 물한천(water agar) 배지에 도말하고 25℃, 암조건에서 배양하였다. 배양 3일 후 자라나온 균사를 물한천 배지에서 분리하여 24-웰 플레이트(24-well plate) V8 배지에 접종하여 배양하고 V8 배지에서 자란 균류는 다시 PDA 배지에 여러 번 계대배양하여 순수 분리하였다.
채집지역 채집년도 수계 분리원
전라남도 함평군 신광면 2020 영산강(함평천) 담수퇴적물
실시예 2: 페난트렌 분해 활성을 보유한 담수균류 20F-2035 균주의 동정
도 1은 본 발명에 따른 20F-2035 균주를 PDA 평판배지에 계대배양하여 순수배양 균주임을 확인한 결과를 나타낸 사진이다. 도 1과 같이 순수 분리된 담수균류의 분자생물학적 동정을 실시하고자 ITS(Internal Transcribed Spacer) 염기서열을 분석하여 그 결과를 도 2(서열번호 1)에 나타내었다. 사용된 프라이머는 하기 표 2와 같다.
프라이머
이름		 정방향(5'-3')
프라이머 염기서열		 프라이머
이름		 역방향(5'-3')
프라이머 염기서열
ITS5 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
ITS 염기서열에 대해 NCBI의 BLAST 결과, 20F-2035 균주는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum)로 동정되었다. 또한, 도 3과 같이 근연종의 ITS 염기서열을 이용한 계통도 분석에서 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum isolate BK239)과 100% 유사성을 보였으며, 균사생장, 포자형태, 크기 등에 따라 형태학적 관찰을 통해 최종적으로 상기 균주를 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주로 명명하고, 이를 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures)에 2020년 10월 12일자로 수탁하여, 수탁번호 KCTC14329BP를 부여받았다.
실시예 3: 피알레모니움 임플라툼( Phialemonium inflatum ) 20F-2035 균주의 페난트렌 분해 활성 확인
상기 실시예 1 및 2에서 분리 및 동정한 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주의 페난트렌 분해 활성을 확인하기 위하여, 메탄올에 페난트렌을 10 mg/㎖의 농도로 녹인 용액을 PDA 배지에 100 ㎕ 도말하고 메탄올을 증발시켜 페난트렌만 배지 위에 남도록 처리하여 페난트렌 배지를 제작하였다. 제작한 페난트렌 배지에 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주를 접종한 뒤 25℃에서 15일 동안 암배양하여 생장한 균주 주변의 페난트렌이 사라지는 영역의 발생 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 20F-2035 균주가 생장하는 범위보다 넓은 영역에서 페난트렌이 사라지는 영역이 명확히 확인되고, 이로부터 본 발명에 따른 20F-2035 균주는 우수한 페난트렌 분해 활성을 보유하고 있음이 증명된다.
실시예 4: 피알레모니움 임플라툼( Phialemonium inflatum ) 20F-2035 균주의 페난트렌 분해 활성도 측정
상기 실시예 1 및 2에서 분리 및 동정한 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주의 페난트렌 분해 활성도를 측정하기 위하여, 다음과 같이 실험하였다. 페난트렌이 배지에 용해되는 양이 극히 적기 때문에 간접적인 측정방법을 사용하였으며, 실시예 3에서 사용한 페난트렌 배지의 중앙에 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주를 접종한 후 시간에 따른 페난트렌 분해 영역의 넓이를 계산하여 분해활성도를 측정하였다. 대조군으로서 균주를 접종하지 않은 페난트렌 배지를 동일한 조건으로 처리하였으며, 페난트렌 분해 실험은 5반복으로 진행한 뒤 평균 및 표준편차를 계산하여 분해 활성도를 산출하고 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, 본 발명에 따른 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035 균주에 의해 15일간 배지상의 페난트렌이 71%까지 분해되었음을 확인할 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC14329BP 20201012
<110> Nakdonggang National Institute of Biological Resources <120> Phialemonium inflatum 20F-2035 strain isolated from freshwater having phenanthrene degradation activity and uses thereof <130> NP20-11153 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 555 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Phialemonium inflatum 20F-2035 <400> 1 aacaaggtct ccgttggtga accagcggag ggatcattac agagtttaac gactcccaaa 60 ccactgtgaa catacccgta ccgttgcctc ggcgggcggc cccagggcgg ggccgcagcc 120 tccccagcgg aggcgcccgc cgcaggtcgc aaaactataa ctatatttag tggcatctct 180 gagtaacttc caaacaatca aaactttcaa caacggatct cttggttctg gcatcgatga 240 agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgaatct 300 ttgaacgcac attgcgcccg ccagcattct ggcgggcatg cctgtccgag cgtcatttca 360 accctcaagc cctgcttggt gttggggcac tacgcgcgag cgtaggccct caaaatcagt 420 ggcggacccg ctggaggtcc gggcgtagta acacatctcg cccgaggtcc ccagcgtgcc 480 cctgccgtta aacccccaaa tttacagaag gttgacctcg gatcaggtag gaatacccgc 540 tgaacttaag catat 555

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 신규 미생물 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 균주는 페난트렌(phenanthrene) 분해 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 균주는 담수로부터 분리된 것을 특징으로 하는 피알레모니움 임플라툼(Phialemonium inflatum) 20F-2035(수탁번호: KCTC14329BP) 균주.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양물질을 유효성분으로 함유하는 페난트렌 분해용 조성물.
  6. 제5항의 조성물을 페난트렌이 포함된 배지에 처리하여 페난트렌을 분해하는 방법.
KR1020200167448A 2020-12-03 2020-12-03 담수에서 분리한 페난트렌 분해 활성을 가지는 피알레모니움 임플라툼 20f-2035 균주 및 이의 용도 KR102455290B1 (ko)

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