JP3673496B2 - 難分解毒性化学物質を分解する細菌共同体ｅｂｃ１０００、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に矯正する方法 - Google Patents
難分解毒性化学物質を分解する細菌共同体ｅｂｃ１０００、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に矯正する方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
（発明の属する技術分野）
本発明は、難分解毒性化学物質を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に矯正する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、土壌、廃水から分離され、高濃度の塩素化合物および2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す廃酸、廃アルカリ系統の難分解性有機化学物質(イソプロピルアルコール（IPA）、メチレン、塩化メチレン（MC）、ジメチルアミン（DMA）、アクリロニトリル（AN）、ハイドロサルファイト（SHS）、ブタジエン（BD）、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム（Tamol-SN）、エチレンジアミン四酢酸二水和物（EDTA）、硫酸第一鉄７水和物（FES）、tert-ドデシルメルカプタン（TDDM）、パラメタンヒドロペルオキシド（PMH）、N-ジメチルヒドロキシルアミン（DEHA）、メタノール（MeOH）、NaOH、CH3CNなどの廃液性廃棄物)を見事に分解する新規の細菌共同体EBC1000に関する。
【０００２】
（従来の技術）
難分解性有害物質による環境汚染は、生物圏の食物連鎖による人類食品の不良化、免疫機能の弱化による伝染性疾病の蔓延、慢性疾病の拡散、エネルギーの枯渇など人類生態系を根源的に破壊しており、その回復までは数億年もかかるかもしれない。
【０００３】
海域に排出される難分解性産業廃水、有害廃棄物による海洋汚染の危急性を認識し、その応急方法として焼却、埋立、化学薬品、電気分解、膜分離などの物理化学的な方式に依存しているが、この種の方法もやはり経済的、環境的な深刻な問題に直面している。これを解決する最も安全、且つ環境学、保健学、生態学、経済的な方法は生物学的な処理方法を利用することである。現在まで生物学的な技術に対する多くの研究がなされてきており、一部自然生態系(干潟など)を用いた浄化方法が提示されたことはあるが、大量の産業廃棄物処理には限界があった。
【０００４】
（発明の記載）
前記問題点を実際的に解決するために、本発明者は、土壌生態系に微量存在する特殊な有用微生物共同体等を見出し、産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に除去する環境復元技術(Bioremediation)を開発するに至った。
【０００５】
本発明は、難分解毒性化学物質を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質および塩素化合物を生物学的に矯正する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、土壌、廃水から分離され、高濃度の塩素化合物および2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す海洋投棄用医薬産業廃水に含有されたイソプロピルアルコール、塩化メチレン、NaOH、Na2SO4、ジメチルアミン、メタノールなどの廃酸アルカリ廃液性廃棄物と海洋投棄用石油化学産業廃水に含有されたハイドロサルファイトナトリウム、ブタジエン、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム、アクリロニトリル、エチレンジアミン四酢酸二水和物、硫酸第一鉄７水和物、tert-ドデシルメルカプタン、パラメタンヒドロペルオキシド、N-ジエチルヒドロキシルアミン、CH3CNなどの廃酸、廃アルカリ系統の廃液を見事に分解する新規の細菌共同体EBC1000に関する。
【０００６】
本発明者は、塩素化合物を有効に分解するだけでなく、海域に投棄される高濃度の難分解廃棄物質を短時間で分解する特性を有している新菌株共同体のEBC1000(KCTC 0652 BP)を韓国ウルサン工団および石油化学工団などの土壌および廃水から分離した。前記細菌共同体EBC1000は9種の菌株からなっており、各々難分解廃棄物質を分解する能力をもっている。また、細菌共同体EBC1000を処理すると、2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す海洋投棄用医薬産業廃水に含有されたイソプロピルアルコール(isopropyl alcohol: IPA、10,000〜20,000ppm)、塩化メチレン(methylene chloride: MC、100〜7,000ppm)、NaOH(流動的)、Na2SO4(流動的)、ジメチルアミン(dimethylamine: DMA、70〜2,500ppm)、メタノール(MeOH、27,000〜54,000ppm)、有機物および抗生剤残留物40,000〜100,000ppm、Cl- 4,000〜33,000ppm、pH3、pH14などの廃酸アルカリ廃液性廃棄物と、海洋投棄用石油化学産業廃水に含有されたヒドロ亜硫酸ナトリウム(sodium hydrosulfite: SHS、(NaS O2)2、30ppm)、ブタジエン(butadiene:BD、流動的)、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(sodium alkylaryl naphthalene sulfonate:Tamol-SN、4,000〜20,000ppm)、アクリロニトリル(acrylonitrile: AN、流動的)、テトラソジウムエチレンジアミンテトラアセテートジヒドレート(tetra sodium ethylene diamine tetra acetate dihydrate: EDTA、 20〜200ppm)、硫酸第1鉄7水和物(ferrous sulfate heptahydrate: FES、60ppm)、テルトドデシルメルカプタン(tert dodecyl mercaptan: TDDM、4,000ppm)、パラメタンヒドロペルオキシド(para methane hydroperoxide: PMH、400ppm)、N-ジエチルヒドロキシアミン(N-diethyl hydroxyl amine: DEHA、200ppm)、CH3CN(流動的)、pH1.2、 3.0、 5.0 などの廃酸、廃アルカリ系統の廃液を7日後80%、10日後90%分解し、好機的な方式によって240時間以内に80〜90%以上分解するということを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、これに基づき難分解毒性化学物質および塩素化合物を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質および塩素化合物を生物学的に矯正する方法を提供する。
【０００８】
（発明の実施の形態）
以下に、本発明による新菌株共同体の分離、同定および活性を詳細に説明する。
【０００９】
難分解毒性廃廃棄物を分解し得る新規の細菌共同体の分離
(1)ウルサン工団などの土壌、廃水から採集した試料を海域排出用難分解性廃液の混合された液体培地で振とう培養して約40種の微生物を分離する段階
ウルサン工団などの地から採集した土壌各1g、廃水各10mlを、廃酸、廃アルカリ廃水液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質の含有された廃酸廃アルカリ性廃液10%を脱イオン水(deionized water)1lに希釈して形成した培地、pH0〜14)と塩素化合物液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと五塩素化ペノル化合物(pentachlorophenol; PCP)50ppmを脱イオン水1lに溶かして形成した培地、pH 7.2)に順次的に接種し20〜30℃で5日以上振とう培養した。
【００１０】
前記振とう培養液1mlを採って廃酸、廃アルカリ固体培地(廃酸、廃アルカリ液体培地に寒天(agar)のみ1.5%添加して形成した培地、pH中化)と塩素化合物固体培地(塩素化合物液体培地にBTB 20mg、寒天1.5%を添加して形成した培地)に順次的に接種し、20〜30℃で3〜10日間培養した。
【００１１】
純粋分離した各コロニーを前記のような培地に再接種し振とう培養した後、個別的に形成された各々異なるコロニー形態を有し、そのコロニーの継代培養のさい同一コロニーが表れる有用細菌約40種を分離した。
【００１２】
(2)(1)段階で分離された細菌を難分解性廃液の濃度を漸次増加させた培地で培養して9種の強力な細菌を分離する段階
前記(1)段階で分離した細菌等を医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質の含有された原液廃液および廃液を50%、80%添加した最小培地と五塩素化ぺノル化合物(PCP)500ppmを添加した最小培地に各々順次的に接種して前記(1)段階での方法と同方法で繰り返し、さらに高い濃度で生存可能な菌株を主としてコロニー形態によって9種を分離した。
【００１３】
ここで得た9種の細菌を一つの共同体として構成してEBC1000と命名したし、前記細菌共同体をなす各々の細菌を各々EBC100、101、103、104、105、106、107、108および109と命名した。
【００１４】
本発明による細菌共同体EBC1000は1999年8月12日韓国生命工学研究所内の遺伝資源センターに寄託番号KCTC 0652 BPとして国際寄託をした。
【００１５】
2. 細菌共同体EBC1000の成長のための最適条件の確立
LB(Luria-Bertani)栄養培地[バクト-トリプトン(bacto-tryptone) 10g、バクト-酵母抽出物(bacto-yeast extract)5g、NaCl 10g/脱イオン水1l]でpH5〜8、温度25〜35℃、振とう(shaking) 分当り回転数50〜100rpmで24〜48時間培養すると最適成長を表し、継代培養時にも同一条件でよく成長する。
【００１６】
3. 細菌共同体EBC1000の同定
細菌共同体EBC1000を構成しているEBC 100、101、103、104、105、106、107、108、109菌株は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の混合状態だったし、各々の形態および大きさが特異だった。LB固体培地で24時間培養時、EBC100は直径1mmの円形コロニー、EBC101は2mm程度の大きい円形、EBC103は2mmの厚い円形、EBC104とEBC105は0.5mm程度の小さい円形、EBC106は3mm程度の厚い形態、EBC107は1.2mm程度の褐色コロニー、EBC108は1mm程度の黄色コロニー、EBC109は2mm程度の二重円形の形態を表した。9種の菌株は好機性および通気性菌株であって、EBC100、101、103、106、107、108は強酸(pH3〜4)、強アルカリ(pH9〜11)条件でも生存力が強かったし、EBC104、105、109は生長が遅かった。運動性はEBC100、104、105、109において表れた。
【００１７】
細菌共同体EBC1000を構成する菌株の属を調べてみれば、EBC100、101、103はクレブシエラ属で、EBC105はプロビデンシア属、EBC104およびEBC109はエスチェリチア属、EBC106はバシラス属に属し、EBC107はグラム陰性細菌、EBC108はグラム陽性細菌である。
【００１８】
前記のような各菌株の特性を下記の表１および表２に示す。
【００１９】
【００２０】
【００２１】
【００２２】
一方、ガスクロマトグラフィを通じて各菌株の脂肪酸メチルエステル(Fatty Acid Methyl Esters: FAMEs)分析をした。
【００２３】
FAMEs分析にはヒューレット・パッカードシリーズIIガスクロマトグラフィモデル5890A(Hewlett Packard series II Gas Chromatograph model 5890A; Microbial ID. Inc., Delaware, USA)が用いられたし、分離カラム(sepation column)は25cm×0.22mm×0.33μmメチルフェニルシリコンが融合された毛細管カラム(HP 19091B-102)を使用した。
【００２４】
前記ガスクロマトグラフィの条件は、運搬ガス(carrier gas)は水素で、カラム上部圧力(column Head Pressure)は10psiで、分割比(split ratio)は100:1であり、分割排気孔(split vent)は50ml/分で、隔膜パージ(Septum Purge)は5ml/分であり、FID水素は30ml/分で、FID窒素は30ml/分であり、FID空気は400ml/分で、初期温度は170℃で、プログラム速度は5℃/分で、最終温度は270℃で、FID 温度は300℃で、注入ポートは250℃で、注入体積は2μlである。
【００２５】
FAMEsグラフは微生物同定システムソフトウェア(Microbial Identification System Software;Microbial ID,Inc., Delaware, USA)を利用したし、標準混合物(standard calibration mixture; Microbial ID, Inc., Delaware, USA)と比較してピーク同定、停滞時間、ピーク領域、ピークパーセントを求めた。
【００２６】
EBC100、101、103各菌株に対するFAMEs分析の結果、EBC100の細胞内脂肪酸組成(cellular fatty acids composition)はC12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C17:0 cyclo、 C14:0 3OHであり、EBC101は、C12:0、C14:0、C15:0、C16:0、C17:0 cyclo、C14:0 3OHである。EBC103は C14:0、C15:0、C16:0、C17:0 cyclo、C14:0 3OHと表れた。
【００２７】
4．細菌共同体EBC1000を構成する各細菌の分離
細菌共同体EBC1000から個別菌株を分離する方法は次の通りである。
【００２８】
EBC106(バシラス属)、EBC107(グラム陰性細菌)およびEBC108(グラム陽性細菌)は、LB寒天(バクト-トリプトン10g、バクト-酵母抽出物5g、NaCl 10g、寒天1.5% + 950ml脱イオン水)の栄養素固体培地で培養すると、EBC106は典型的バシラス形態の厚い皺形状であり、EBC107は褐色コロニー、EBC108は黄色コロニーの形態的特徴で区別されることができる。
【００２９】
それ以外の菌株等はデスオキシコレート寒天[Desoxycholate agar;バクトペプトン10g、バクトラクトース 10g、デスオキシコレートナトリウム1g、塩化ナトリウム5g、二カリウム(dipotassium)2g、クエン酸鉄(Fe citrate)1g、クエン酸ナトリウム(sodium citrate)1g、バクト寒天(bacto agar)15g、ニュートラルレッド(neutral red) 0.03g/脱イオン水(deionized water)1l-Difco manual, 1984]で細菌共同体EBC1000を希釈塗末すると各菌株のコロニー形態を確認することができた。24時間デスオキシコレート寒天に培養した後は、EBC100、101、103は赤い色に白色の粘性が表れ、寸法において微細な差がある。EBC104は赤い色に白い部分が表れ、無粘性であり、EBC105は褐色、 EBC106、 107は薄い褐色、 EBC108は無色、EBC109は赤い色であって粘性を表す(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd, Paul Singleton Diana Sainsbury 1987)。
【００３０】
5. 細菌共同体EBC1000の特性
(1) 細菌共同体EBC1000によるアルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(sodium alkylarylnaphthalene sulfonate: Tamol-SN)の分解速度
K2HPO4 0.065g、KH2PO4 0.017g、 MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gを脱イオン水1lに溶解して作った最小培地(pH 7.2)にTamol-SNを500、1000、2000、4000ppmに漸次増加して投与し、細菌共同体EBC1000を接種した後、時間別に吸光度とTamolの濃度を測定した。結果を表３に表す。
【００３１】
【００３２】
表３に表す如く、時間当りTamolの分解速度は500ppmのとき分解速度は1.3(mg/l/h)で、4000ppmのときは4.0(mg/l/h)だった。
【００３３】
(2) 細菌共同体EBC1000による五塩素化ぺノル化合物の分解速度
前記(1)のような最小液体培地条件にBTB 20mgを脱イオン水1lに溶解して作った後、五塩素化ぺノル化合物を表４のように投与し細菌共同体EBC1000を接種した後、時間別に吸光度と五塩素化ぺノル化合物の濃度を測定した。その結果は表４に表されている。
【００３４】
【００３５】
6. 細菌共同体EBC1000を使用した難分解性産業廃液の処理
<実験例１;細菌共同体EBC1000を石油化学産業廃水中に含有されて排出される難分解性特殊乳化剤に処理>
石油化学工場で使用される代表的な難分解性化学物質であるアルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(Tamol-SN)原液を、K2HPO4 0.065g、KH2PO4 0.017g、 MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gを脱イオン水1lに溶解して作った最小培地(pH 7.2)50mlに1%で混合して添加し、細菌共同体EBC1000を2.0×104/mlで接種した後、25〜30℃、で100rpmに10日間振とう培養した。結果を表５に表す。
【００３６】
【００３７】
表５から分かるように、4日間培養した後のTamol-SNの濃度は850ppmだったし、このとき細菌数は2.5×107(CFU/ml)だった。
【００３８】
<実験例２;石油化学工場の難分解廃水原液に細菌共同体EBC1000を処理>
ウルサン工団などの石油化学工場から海洋に排出される廃酸、廃アルカリ系統の難分解性廃水を収去して実験した。前記廃水は、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(Tamol-SN)4000ppm、ヒドロ亜硫酸ナトリウム[(NaSO2)2]、ブタジエン(BD)、アクリロニトリル(AN)、テトラソジウムエチレンジアミンテトラアセテートジヒドレート(EDTA)、硫酸第1鉄7水和物(FES)、テルトドデシルメルカプタン(TDDM)、パラメタンヒドロペルオキシド(PMH)、N-ジエチルヒドロキシアミン(DEHA)、CH3CNなどが含有された原液廃水であって、前記原液廃水各200mlにEBC1000を1.2×107/mlで接種した後、30℃で80rpmに10日間振とう培養した。その実験結果を表６に表す。
【００３９】
【００４０】
表６に表すように、10日間培養後、原液廃水のCODは750ppmに減少して80%の分解効率を表した。TOCとBODも略同一な傾向を示し、細菌の数は5.1×109(CFU/ml)と100倍以上増加された。
【００４１】
参考として本発明に関する実験で使用された分析方法は次の通りである。
【００４２】
1) COD(マンガン法)分析;水質汚染、廃棄物工程試験方法(環境処告示第1993-42号)と標準方法(APHA、AWWA、WPCF、18th ed.)に基づいてCODマンガン法で化学的酸素要求濃度を測定した。工場の原液廃水または海洋投棄用廃棄物質と微生物による有害物質の分解処理後の廃液を10ml以上ずつ採取して硫酸(H2SO4)と0.025N KMnO4を添加した後100℃で30分間湯煎した。その後、0.025N Na2C2O4を添加しKMnO4で滴決してCODの実際減少を調査した。
【００４３】
2) BOD分析;水質汚染、廃棄物工程試験方法と標準工程(Standard methods)によって20℃で生物学的な作用によって5日間消耗される溶存酸素の量で生化学的酸素要求濃度を調査した。
【００４４】
3) TOC分析;標準工程によって原液廃棄物、廃水および各測定時間別の試料を遠心分離し、その上澄み液として総有機炭素量をTOC分析器(TOC-5000 A, Shimadzu com.)によって調査した。
【００４５】
4) CFU調査;標準工程の微生物調査方法によって各処理区の土着微生物と接種微生物の共同体をプレート計数方法(plate count method)で調査したし、初期および各時間別に有害物質の減少による微生物の増殖現象を確認した。
【００４６】
5) 塩素化合物の抽出、分析は韓国特許第154295号または特許出願番号第98-20706号に記載された内容および本発明者の論文(Journal of Applied Microbiology 85-1-1〜8, 1998;韓国土壌環境学会誌1-1-39〜46, 1996)によって実施した。
【００４７】
<実験例３;医薬品製造工場の難分解廃水を細菌共同体EBC1000で処理>
ウルサン工団および中北部地域の医薬品製造工場から海域に排出される難分解性廃酸廃アルカリ系統の廃液を収去して実験した。前記の廃棄物はイソプロピルアルコール(IPA)、塩化メチレン(MC)、NaOH、Na2SO4、ジメチルアミン(DMA)、メタノール廃液などと薬品残留物が含まれたものであって、CODMnが2万〜10万ppmである高濃度の廃酸廃アルカリ廃液である。前記廃液各200mlにEBC1000を2.0×107/mlで接種した後、室温(20〜25℃)で通気(aeration)させながら14日間培養した。その実験結果を表７に表す。
【００４８】
【００４９】
表７に表すように、10日間培養後の原液廃液のCODは4000ppmに減少し薬90%の分解効率を表した。TOCとBODも略同じ傾向を示したし、このときEBC1000の細菌の数は1.6×1010(CFU/ml)と1000倍程度増加した。
【００５０】
7. 塩素化合物で汚染された土壌および木材に対する実験
<実験例４;細菌共同体EBC1000を塩素化合物汚染土壌に処理>
五塩素化ぺノル化合物で汚染された土壌600gを1日間静置して前処理した水道水5lに分散させて投入したスラリー装置でBu34菌株 + 11種類の分解菌株(特許出願第98-20706号で寄託された菌株Bu1と未同定されたPCP分解菌株10種類) +自生菌株(分解菌株と別途の対照区で表れたものであって、土着菌株の分布による相対的な比較によって分離された菌株であり、同定はされなかった)によるPCPの分解結果に比べ、本発明のEBC1000を使用した場合が表８のようにやや高い分解効率を表した。Bu34菌株などを使用した実験では14日後96%の分解効率を表したが、EBC1000の場合は98%の塩素化合物除去効果を表した。
【００５１】
【００５２】
<実験例５>
薄片およびのこくず形態の廃木材各5gに最小液体培地各65mlを添加しEBC1000を添加した後、90〜100rpmに振とうしながら30℃で90時間培養し比較した。その結果は表９に表されている。表９から分かるように、80時間後EBC1000を接種した場合98%のPCPを分解したし、微生物の数も100倍程度増加された。
【００５３】
【００５４】
<実験例６>
のこくず形態の廃木材200gに最小液体培地250mlを添加しEBC1000を2.0×108/g木材を接種した後、のこくず木材塊に水分と菌株を入れ室温に放置する状態(“composting”方法, McBain et al., Biodegradation 6, 47-55,1995)で200日間処理したとき、表１０のようにBu1とBu34を処理した場合に比べてさらに短時間でより高い分解効率を表した。
【００５５】
【００５６】
前記実験例から分かるように、海域排出用高濃度の難分解性毒性廃液を効率的に処理するEBC1000は塩素化合物の分解にも使用され得ることが分かった。
【００５７】
8. EBC1000の各菌株による難分解性廃液の分解[COD(マンガン法)]および五塩素化ぺノル化合物分解の分析試験
EBC100、101、103、104、105、106、107、108、109と純粋分離した各コロニー等を廃酸、廃アルカリ廃水液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質が含有された廃酸廃アルカリ性廃液10%を脱イオン水1lに希釈して形成した培地、pH0〜14)20mlと塩素化合物液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと五塩素化ぺノル化合物50ppmを脱イオン水1lに溶かして形成した培地、pH 7.2)20mlに順次的に接種し20〜30℃で10日以上振とう培養した後、化学的酸素要求濃度と五塩素化ぺノル化合物濃度を測定した。CODと五塩素化ぺノル化合物の実際減少を調査した結果、平均的にEBC100を接種した場合は85%、EBC101とEBC103は各々67%、EBC106、EBC107、EBC108は各々50〜55%、EBC104、EBC105、EBC109は各々20%程度と表れた。したがって、EBC1000の各個別菌株も難分解性化学物質および塩素化合物を分解することが分かった。しかし、細菌共同体EBC1000形態に存在する場合が個別菌株として存在する場合より高い成長率と分解効率を表した。
【００５８】
本発明による細菌共同体EBC1000は、新規のものであって、海域に排出される高濃度の難分解性産業廃水、有害廃棄物を短時間で分解し、塩素化合物で汚染された土壌、木材、沈出水、地下水などを浄化させることができる。したがって、細菌共同体EBC1000は環境汚染の防止効果と汚染された環境の復元再生における優れた機能を有する。
【００５９】
さらに、細菌共同体EBC1000は、好機的な方式であって、新菌株共同体を海洋に投棄される高濃度の難分解性廃棄物、塩素化合物で汚染された土壌、木材、沈出水、地下水などを処理するに使用されることができ、木材も丸太のまま再生することができる。また、本発明は、五塩素化ぺノル化合物の分解菌株である、シュードモナス(Pseudomonas)Bu34(韓国特許第154295号)およびクレブシエラBu1菌株(韓国特許出願第98-20706号)と混合して汚染された木材、土壌を再生することができる。
（発明の属する技術分野）
本発明は、難分解毒性化学物質を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に矯正する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、土壌、廃水から分離され、高濃度の塩素化合物および2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す廃酸、廃アルカリ系統の難分解性有機化学物質(イソプロピルアルコール（IPA）、メチレン、塩化メチレン（MC）、ジメチルアミン（DMA）、アクリロニトリル（AN）、ハイドロサルファイト（SHS）、ブタジエン（BD）、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム（Tamol-SN）、エチレンジアミン四酢酸二水和物（EDTA）、硫酸第一鉄７水和物（FES）、tert-ドデシルメルカプタン（TDDM）、パラメタンヒドロペルオキシド（PMH）、N-ジメチルヒドロキシルアミン（DEHA）、メタノール（MeOH）、NaOH、CH3CNなどの廃液性廃棄物)を見事に分解する新規の細菌共同体EBC1000に関する。
【０００２】
（従来の技術）
難分解性有害物質による環境汚染は、生物圏の食物連鎖による人類食品の不良化、免疫機能の弱化による伝染性疾病の蔓延、慢性疾病の拡散、エネルギーの枯渇など人類生態系を根源的に破壊しており、その回復までは数億年もかかるかもしれない。
【０００３】
海域に排出される難分解性産業廃水、有害廃棄物による海洋汚染の危急性を認識し、その応急方法として焼却、埋立、化学薬品、電気分解、膜分離などの物理化学的な方式に依存しているが、この種の方法もやはり経済的、環境的な深刻な問題に直面している。これを解決する最も安全、且つ環境学、保健学、生態学、経済的な方法は生物学的な処理方法を利用することである。現在まで生物学的な技術に対する多くの研究がなされてきており、一部自然生態系(干潟など)を用いた浄化方法が提示されたことはあるが、大量の産業廃棄物処理には限界があった。
【０００４】
（発明の記載）
前記問題点を実際的に解決するために、本発明者は、土壌生態系に微量存在する特殊な有用微生物共同体等を見出し、産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質を生物学的に除去する環境復元技術(Bioremediation)を開発するに至った。
【０００５】
本発明は、難分解毒性化学物質を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質および塩素化合物を生物学的に矯正する方法に関する。さらに詳細には、本発明は、土壌、廃水から分離され、高濃度の塩素化合物および2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す海洋投棄用医薬産業廃水に含有されたイソプロピルアルコール、塩化メチレン、NaOH、Na2SO4、ジメチルアミン、メタノールなどの廃酸アルカリ廃液性廃棄物と海洋投棄用石油化学産業廃水に含有されたハイドロサルファイトナトリウム、ブタジエン、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム、アクリロニトリル、エチレンジアミン四酢酸二水和物、硫酸第一鉄７水和物、tert-ドデシルメルカプタン、パラメタンヒドロペルオキシド、N-ジエチルヒドロキシルアミン、CH3CNなどの廃酸、廃アルカリ系統の廃液を見事に分解する新規の細菌共同体EBC1000に関する。
【０００６】
本発明者は、塩素化合物を有効に分解するだけでなく、海域に投棄される高濃度の難分解廃棄物質を短時間で分解する特性を有している新菌株共同体のEBC1000(KCTC 0652 BP)を韓国ウルサン工団および石油化学工団などの土壌および廃水から分離した。前記細菌共同体EBC1000は9種の菌株からなっており、各々難分解廃棄物質を分解する能力をもっている。また、細菌共同体EBC1000を処理すると、2万〜10万ppm(CODMn)の化学的酸素要求量を表す海洋投棄用医薬産業廃水に含有されたイソプロピルアルコール(isopropyl alcohol: IPA、10,000〜20,000ppm)、塩化メチレン(methylene chloride: MC、100〜7,000ppm)、NaOH(流動的)、Na2SO4(流動的)、ジメチルアミン(dimethylamine: DMA、70〜2,500ppm)、メタノール(MeOH、27,000〜54,000ppm)、有機物および抗生剤残留物40,000〜100,000ppm、Cl- 4,000〜33,000ppm、pH3、pH14などの廃酸アルカリ廃液性廃棄物と、海洋投棄用石油化学産業廃水に含有されたヒドロ亜硫酸ナトリウム(sodium hydrosulfite: SHS、(NaS O2)2、30ppm)、ブタジエン(butadiene:BD、流動的)、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(sodium alkylaryl naphthalene sulfonate:Tamol-SN、4,000〜20,000ppm)、アクリロニトリル(acrylonitrile: AN、流動的)、テトラソジウムエチレンジアミンテトラアセテートジヒドレート(tetra sodium ethylene diamine tetra acetate dihydrate: EDTA、 20〜200ppm)、硫酸第1鉄7水和物(ferrous sulfate heptahydrate: FES、60ppm)、テルトドデシルメルカプタン(tert dodecyl mercaptan: TDDM、4,000ppm)、パラメタンヒドロペルオキシド(para methane hydroperoxide: PMH、400ppm)、N-ジエチルヒドロキシアミン(N-diethyl hydroxyl amine: DEHA、200ppm)、CH3CN(流動的)、pH1.2、 3.0、 5.0 などの廃酸、廃アルカリ系統の廃液を7日後80%、10日後90%分解し、好機的な方式によって240時間以内に80〜90%以上分解するということを見出した。
【０００７】
したがって、本発明は、これに基づき難分解毒性化学物質および塩素化合物を分解する新規の細菌共同体EBC1000、およびこれを用いて産業廃水、廃棄物、土壌などを汚染させる難分解毒性化学物質および塩素化合物を生物学的に矯正する方法を提供する。
【０００８】
（発明の実施の形態）
以下に、本発明による新菌株共同体の分離、同定および活性を詳細に説明する。
【０００９】
難分解毒性廃廃棄物を分解し得る新規の細菌共同体の分離
(1)ウルサン工団などの土壌、廃水から採集した試料を海域排出用難分解性廃液の混合された液体培地で振とう培養して約40種の微生物を分離する段階
ウルサン工団などの地から採集した土壌各1g、廃水各10mlを、廃酸、廃アルカリ廃水液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質の含有された廃酸廃アルカリ性廃液10%を脱イオン水(deionized water)1lに希釈して形成した培地、pH0〜14)と塩素化合物液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと五塩素化ペノル化合物(pentachlorophenol; PCP)50ppmを脱イオン水1lに溶かして形成した培地、pH 7.2)に順次的に接種し20〜30℃で5日以上振とう培養した。
【００１０】
前記振とう培養液1mlを採って廃酸、廃アルカリ固体培地(廃酸、廃アルカリ液体培地に寒天(agar)のみ1.5%添加して形成した培地、pH中化)と塩素化合物固体培地(塩素化合物液体培地にBTB 20mg、寒天1.5%を添加して形成した培地)に順次的に接種し、20〜30℃で3〜10日間培養した。
【００１１】
純粋分離した各コロニーを前記のような培地に再接種し振とう培養した後、個別的に形成された各々異なるコロニー形態を有し、そのコロニーの継代培養のさい同一コロニーが表れる有用細菌約40種を分離した。
【００１２】
(2)(1)段階で分離された細菌を難分解性廃液の濃度を漸次増加させた培地で培養して9種の強力な細菌を分離する段階
前記(1)段階で分離した細菌等を医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質の含有された原液廃液および廃液を50%、80%添加した最小培地と五塩素化ぺノル化合物(PCP)500ppmを添加した最小培地に各々順次的に接種して前記(1)段階での方法と同方法で繰り返し、さらに高い濃度で生存可能な菌株を主としてコロニー形態によって9種を分離した。
【００１３】
ここで得た9種の細菌を一つの共同体として構成してEBC1000と命名したし、前記細菌共同体をなす各々の細菌を各々EBC100、101、103、104、105、106、107、108および109と命名した。
【００１４】
本発明による細菌共同体EBC1000は1999年8月12日韓国生命工学研究所内の遺伝資源センターに寄託番号KCTC 0652 BPとして国際寄託をした。
【００１５】
2. 細菌共同体EBC1000の成長のための最適条件の確立
LB(Luria-Bertani)栄養培地[バクト-トリプトン(bacto-tryptone) 10g、バクト-酵母抽出物(bacto-yeast extract)5g、NaCl 10g/脱イオン水1l]でpH5〜8、温度25〜35℃、振とう(shaking) 分当り回転数50〜100rpmで24〜48時間培養すると最適成長を表し、継代培養時にも同一条件でよく成長する。
【００１６】
3. 細菌共同体EBC1000の同定
細菌共同体EBC1000を構成しているEBC 100、101、103、104、105、106、107、108、109菌株は、グラム陰性細菌とグラム陽性細菌の混合状態だったし、各々の形態および大きさが特異だった。LB固体培地で24時間培養時、EBC100は直径1mmの円形コロニー、EBC101は2mm程度の大きい円形、EBC103は2mmの厚い円形、EBC104とEBC105は0.5mm程度の小さい円形、EBC106は3mm程度の厚い形態、EBC107は1.2mm程度の褐色コロニー、EBC108は1mm程度の黄色コロニー、EBC109は2mm程度の二重円形の形態を表した。9種の菌株は好機性および通気性菌株であって、EBC100、101、103、106、107、108は強酸(pH3〜4)、強アルカリ(pH9〜11)条件でも生存力が強かったし、EBC104、105、109は生長が遅かった。運動性はEBC100、104、105、109において表れた。
【００１７】
細菌共同体EBC1000を構成する菌株の属を調べてみれば、EBC100、101、103はクレブシエラ属で、EBC105はプロビデンシア属、EBC104およびEBC109はエスチェリチア属、EBC106はバシラス属に属し、EBC107はグラム陰性細菌、EBC108はグラム陽性細菌である。
【００１８】
前記のような各菌株の特性を下記の表１および表２に示す。
【００１９】
一方、ガスクロマトグラフィを通じて各菌株の脂肪酸メチルエステル(Fatty Acid Methyl Esters: FAMEs)分析をした。
【００２３】
FAMEs分析にはヒューレット・パッカードシリーズIIガスクロマトグラフィモデル5890A(Hewlett Packard series II Gas Chromatograph model 5890A; Microbial ID. Inc., Delaware, USA)が用いられたし、分離カラム(sepation column)は25cm×0.22mm×0.33μmメチルフェニルシリコンが融合された毛細管カラム(HP 19091B-102)を使用した。
【００２４】
前記ガスクロマトグラフィの条件は、運搬ガス(carrier gas)は水素で、カラム上部圧力(column Head Pressure)は10psiで、分割比(split ratio)は100:1であり、分割排気孔(split vent)は50ml/分で、隔膜パージ(Septum Purge)は5ml/分であり、FID水素は30ml/分で、FID窒素は30ml/分であり、FID空気は400ml/分で、初期温度は170℃で、プログラム速度は5℃/分で、最終温度は270℃で、FID 温度は300℃で、注入ポートは250℃で、注入体積は2μlである。
【００２５】
FAMEsグラフは微生物同定システムソフトウェア(Microbial Identification System Software;Microbial ID,Inc., Delaware, USA)を利用したし、標準混合物(standard calibration mixture; Microbial ID, Inc., Delaware, USA)と比較してピーク同定、停滞時間、ピーク領域、ピークパーセントを求めた。
【００２６】
EBC100、101、103各菌株に対するFAMEs分析の結果、EBC100の細胞内脂肪酸組成(cellular fatty acids composition)はC12:0、C14:0、C16:0、C16:1、C17:0 cyclo、 C14:0 3OHであり、EBC101は、C12:0、C14:0、C15:0、C16:0、C17:0 cyclo、C14:0 3OHである。EBC103は C14:0、C15:0、C16:0、C17:0 cyclo、C14:0 3OHと表れた。
【００２７】
4．細菌共同体EBC1000を構成する各細菌の分離
細菌共同体EBC1000から個別菌株を分離する方法は次の通りである。
【００２８】
EBC106(バシラス属)、EBC107(グラム陰性細菌)およびEBC108(グラム陽性細菌)は、LB寒天(バクト-トリプトン10g、バクト-酵母抽出物5g、NaCl 10g、寒天1.5% + 950ml脱イオン水)の栄養素固体培地で培養すると、EBC106は典型的バシラス形態の厚い皺形状であり、EBC107は褐色コロニー、EBC108は黄色コロニーの形態的特徴で区別されることができる。
【００２９】
それ以外の菌株等はデスオキシコレート寒天[Desoxycholate agar;バクトペプトン10g、バクトラクトース 10g、デスオキシコレートナトリウム1g、塩化ナトリウム5g、二カリウム(dipotassium)2g、クエン酸鉄(Fe citrate)1g、クエン酸ナトリウム(sodium citrate)1g、バクト寒天(bacto agar)15g、ニュートラルレッド(neutral red) 0.03g/脱イオン水(deionized water)1l-Difco manual, 1984]で細菌共同体EBC1000を希釈塗末すると各菌株のコロニー形態を確認することができた。24時間デスオキシコレート寒天に培養した後は、EBC100、101、103は赤い色に白色の粘性が表れ、寸法において微細な差がある。EBC104は赤い色に白い部分が表れ、無粘性であり、EBC105は褐色、 EBC106、 107は薄い褐色、 EBC108は無色、EBC109は赤い色であって粘性を表す(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd, Paul Singleton Diana Sainsbury 1987)。
【００３０】
5. 細菌共同体EBC1000の特性
(1) 細菌共同体EBC1000によるアルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(sodium alkylarylnaphthalene sulfonate: Tamol-SN)の分解速度
K2HPO4 0.065g、KH2PO4 0.017g、 MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gを脱イオン水1lに溶解して作った最小培地(pH 7.2)にTamol-SNを500、1000、2000、4000ppmに漸次増加して投与し、細菌共同体EBC1000を接種した後、時間別に吸光度とTamolの濃度を測定した。結果を表３に表す。
【００３１】
表３に表す如く、時間当りTamolの分解速度は500ppmのとき分解速度は1.3(mg/l/h)で、4000ppmのときは4.0(mg/l/h)だった。
【００３３】
(2) 細菌共同体EBC1000による五塩素化ぺノル化合物の分解速度
前記(1)のような最小液体培地条件にBTB 20mgを脱イオン水1lに溶解して作った後、五塩素化ぺノル化合物を表４のように投与し細菌共同体EBC1000を接種した後、時間別に吸光度と五塩素化ぺノル化合物の濃度を測定した。その結果は表４に表されている。
【００３４】
6. 細菌共同体EBC1000を使用した難分解性産業廃液の処理
<実験例１;細菌共同体EBC1000を石油化学産業廃水中に含有されて排出される難分解性特殊乳化剤に処理>
石油化学工場で使用される代表的な難分解性化学物質であるアルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(Tamol-SN)原液を、K2HPO4 0.065g、KH2PO4 0.017g、 MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gを脱イオン水1lに溶解して作った最小培地(pH 7.2)50mlに1%で混合して添加し、細菌共同体EBC1000を2.0×104/mlで接種した後、25〜30℃、で100rpmに10日間振とう培養した。結果を表５に表す。
【００３６】
表５から分かるように、4日間培養した後のTamol-SNの濃度は850ppmだったし、このとき細菌数は2.5×107(CFU/ml)だった。
【００３８】
<実験例２;石油化学工場の難分解廃水原液に細菌共同体EBC1000を処理>
ウルサン工団などの石油化学工場から海洋に排出される廃酸、廃アルカリ系統の難分解性廃水を収去して実験した。前記廃水は、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(Tamol-SN)4000ppm、ヒドロ亜硫酸ナトリウム[(NaSO2)2]、ブタジエン(BD)、アクリロニトリル(AN)、テトラソジウムエチレンジアミンテトラアセテートジヒドレート(EDTA)、硫酸第1鉄7水和物(FES)、テルトドデシルメルカプタン(TDDM)、パラメタンヒドロペルオキシド(PMH)、N-ジエチルヒドロキシアミン(DEHA)、CH3CNなどが含有された原液廃水であって、前記原液廃水各200mlにEBC1000を1.2×107/mlで接種した後、30℃で80rpmに10日間振とう培養した。その実験結果を表６に表す。
【００３９】
表６に表すように、10日間培養後、原液廃水のCODは750ppmに減少して80%の分解効率を表した。TOCとBODも略同一な傾向を示し、細菌の数は5.1×109(CFU/ml)と100倍以上増加された。
【００４１】
参考として本発明に関する実験で使用された分析方法は次の通りである。
【００４２】
1) COD(マンガン法)分析;水質汚染、廃棄物工程試験方法(環境処告示第1993-42号)と標準方法(APHA、AWWA、WPCF、18th ed.)に基づいてCODマンガン法で化学的酸素要求濃度を測定した。工場の原液廃水または海洋投棄用廃棄物質と微生物による有害物質の分解処理後の廃液を10ml以上ずつ採取して硫酸(H2SO4)と0.025N KMnO4を添加した後100℃で30分間湯煎した。その後、0.025N Na2C2O4を添加しKMnO4で滴決してCODの実際減少を調査した。
【００４３】
2) BOD分析;水質汚染、廃棄物工程試験方法と標準工程(Standard methods)によって20℃で生物学的な作用によって5日間消耗される溶存酸素の量で生化学的酸素要求濃度を調査した。
【００４４】
3) TOC分析;標準工程によって原液廃棄物、廃水および各測定時間別の試料を遠心分離し、その上澄み液として総有機炭素量をTOC分析器(TOC-5000 A, Shimadzu com.)によって調査した。
【００４５】
4) CFU調査;標準工程の微生物調査方法によって各処理区の土着微生物と接種微生物の共同体をプレート計数方法(plate count method)で調査したし、初期および各時間別に有害物質の減少による微生物の増殖現象を確認した。
【００４６】
5) 塩素化合物の抽出、分析は韓国特許第154295号または特許出願番号第98-20706号に記載された内容および本発明者の論文(Journal of Applied Microbiology 85-1-1〜8, 1998;韓国土壌環境学会誌1-1-39〜46, 1996)によって実施した。
【００４７】
<実験例３;医薬品製造工場の難分解廃水を細菌共同体EBC1000で処理>
ウルサン工団および中北部地域の医薬品製造工場から海域に排出される難分解性廃酸廃アルカリ系統の廃液を収去して実験した。前記の廃棄物はイソプロピルアルコール(IPA)、塩化メチレン(MC)、NaOH、Na2SO4、ジメチルアミン(DMA)、メタノール廃液などと薬品残留物が含まれたものであって、CODMnが2万〜10万ppmである高濃度の廃酸廃アルカリ廃液である。前記廃液各200mlにEBC1000を2.0×107/mlで接種した後、室温(20〜25℃)で通気(aeration)させながら14日間培養した。その実験結果を表７に表す。
【００４８】
表７に表すように、10日間培養後の原液廃液のCODは4000ppmに減少し薬90%の分解効率を表した。TOCとBODも略同じ傾向を示したし、このときEBC1000の細菌の数は1.6×1010(CFU/ml)と1000倍程度増加した。
【００５０】
7. 塩素化合物で汚染された土壌および木材に対する実験
<実験例４;細菌共同体EBC1000を塩素化合物汚染土壌に処理>
五塩素化ぺノル化合物で汚染された土壌600gを1日間静置して前処理した水道水5lに分散させて投入したスラリー装置でBu34菌株 + 11種類の分解菌株(特許出願第98-20706号で寄託された菌株Bu1と未同定されたPCP分解菌株10種類) +自生菌株(分解菌株と別途の対照区で表れたものであって、土着菌株の分布による相対的な比較によって分離された菌株であり、同定はされなかった)によるPCPの分解結果に比べ、本発明のEBC1000を使用した場合が表８のようにやや高い分解効率を表した。Bu34菌株などを使用した実験では14日後96%の分解効率を表したが、EBC1000の場合は98%の塩素化合物除去効果を表した。
【００５１】
<実験例５>
薄片およびのこくず形態の廃木材各5gに最小液体培地各65mlを添加しEBC1000を添加した後、90〜100rpmに振とうしながら30℃で90時間培養し比較した。その結果は表９に表されている。表９から分かるように、80時間後EBC1000を接種した場合98%のPCPを分解したし、微生物の数も100倍程度増加された。
【００５３】
<実験例６>
のこくず形態の廃木材200gに最小液体培地250mlを添加しEBC1000を2.0×108/g木材を接種した後、のこくず木材塊に水分と菌株を入れ室温に放置する状態(“composting”方法, McBain et al., Biodegradation 6, 47-55,1995)で200日間処理したとき、表１０のようにBu1とBu34を処理した場合に比べてさらに短時間でより高い分解効率を表した。
【００５５】
前記実験例から分かるように、海域排出用高濃度の難分解性毒性廃液を効率的に処理するEBC1000は塩素化合物の分解にも使用され得ることが分かった。
【００５７】
8. EBC1000の各菌株による難分解性廃液の分解[COD(マンガン法)]および五塩素化ぺノル化合物分解の分析試験
EBC100、101、103、104、105、106、107、108、109と純粋分離した各コロニー等を廃酸、廃アルカリ廃水液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと医薬品産業廃液および石油化学廃液の難分解性化学物質が含有された廃酸廃アルカリ性廃液10%を脱イオン水1lに希釈して形成した培地、pH0〜14)20mlと塩素化合物液体培地(K2HPO4 0.65g、KH2PO4 0.17g、MgSO4 0.1g、NaNO3 0.5gと五塩素化ぺノル化合物50ppmを脱イオン水1lに溶かして形成した培地、pH 7.2)20mlに順次的に接種し20〜30℃で10日以上振とう培養した後、化学的酸素要求濃度と五塩素化ぺノル化合物濃度を測定した。CODと五塩素化ぺノル化合物の実際減少を調査した結果、平均的にEBC100を接種した場合は85%、EBC101とEBC103は各々67%、EBC106、EBC107、EBC108は各々50〜55%、EBC104、EBC105、EBC109は各々20%程度と表れた。したがって、EBC1000の各個別菌株も難分解性化学物質および塩素化合物を分解することが分かった。しかし、細菌共同体EBC1000形態に存在する場合が個別菌株として存在する場合より高い成長率と分解効率を表した。
【００５８】
本発明による細菌共同体EBC1000は、新規のものであって、海域に排出される高濃度の難分解性産業廃水、有害廃棄物を短時間で分解し、塩素化合物で汚染された土壌、木材、沈出水、地下水などを浄化させることができる。したがって、細菌共同体EBC1000は環境汚染の防止効果と汚染された環境の復元再生における優れた機能を有する。
【００５９】
さらに、細菌共同体EBC1000は、好機的な方式であって、新菌株共同体を海洋に投棄される高濃度の難分解性廃棄物、塩素化合物で汚染された土壌、木材、沈出水、地下水などを処理するに使用されることができ、木材も丸太のまま再生することができる。また、本発明は、五塩素化ぺノル化合物の分解菌株である、シュードモナス(Pseudomonas)Bu34(韓国特許第154295号)およびクレブシエラBu1菌株(韓国特許出願第98-20706号)と混合して汚染された木材、土壌を再生することができる。
Claims (2)
- 脱イオン水 1l 当り、バクト - トリプトン (bacto-tryptone) 10g 、バクト - 酵母抽出物 (bacto-yeast extract)5g および NaCl 10g を含む LB(Luria-Bertani) 栄養培地でpH5〜8、温度25〜35℃、振とう(shaking) 分当り回転数50〜100rpmで24〜48時間培養すると成長し、継代培養時にも同一条件で成長する細菌共同体EBC1000(KCTC 0652 BP) で、前記の新菌株共同体 EBC1000 は、クレブシエラ属 EBC100(Klebsiella sp. EBC100) 菌株 , クレブシエラ属 EBC101(Klebsiella sp. EBC101) 菌株 , クレブシエラ属 EBC103(Klebsiella sp. EBC103) 菌株 , エスチェリチア属 EBC104(Escherichia sp. EBC104) 菌株 , プロビデンシア属 EBC105(Providencia EBC105) 菌株 , バシラス属 EBC106(Bacillus sp. EBC106) 菌株 , グラム陰性細菌の EBC107 菌株、グラム陽性細菌の EBC108 菌株およびエスチェリチア属 EBC109(Escherichia sp. EBC109) 菌株を含むことを特徴とする、細菌共同体 EBC1000。
- 細菌共同体 EBC1000を用い、海洋投棄用医薬産業廃水とは土壌に含有されたイソプロピルアルコール(isopropyl alcohol)、塩化メチレン(methylene chloride)、NaOH、Na2SO4、ジメチルアミン、メタノールを含む廃酸アルカリ廃液性廃棄物と海洋投棄用石油化学産業廃水とは土壌に含有されたヒドロ亜硫酸ナトリウム(sodium hydrosulfite、(NaSO2)2)、ブタジエン(butadiene)、アルキルアリールナフタレンスルホン酸ナトリウム(sodium alkylaryl naphthalene sulfonate)、アクリロニトリル(acrylonitile)、エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム二水和物(tetra sodium ethylene diamine tetra acetate dihydrate)、 硫酸第一鉄七水和物(ferrous sulfate heptahydrate)、tert-ドデシルメルカプタン(tert dodecyl mercaptan)、パラメタンヒドロペルオキシド(para methane hydroperoxide)、N-ジエチルヒドロキシルアミン(N-diethyl hydroxyl amine)、CH3CNを含む廃酸、廃アルカリ系統の廃液性難分解性有害物質、またはPCP(pentachlorophenol)を含む塩素化合物を処理する方法。
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