CN111057670B - 一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用，它涉及环境微生物技术领域，本发明提供了一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，它是由节杆菌YL1和假单胞菌YL2混合而成，二者按体积比为1：(2‑3)的比例混合。它用于污水中磺胺类抗生素的处理或者污水中有机物的降解。本发明分离的节杆菌YL1和假单胞菌YL2，能够以磺胺类抗生素为唯一碳源生长，并能实现对该类抗生素的快速、高效降解，双菌株互作的菌剂体系相比单一菌种在实际应用的过程中具有更高的去除效率、更彻底的去除量以及更稳定的群落结构，对于实现水体中磺胺类抗生素的生物处理十分关键。本发明应用于抗生素降解领域。

Description

一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及环境微生物技术领域，具体涉及一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
磺胺类抗生素(Sulfonamides，SAs)是一类人工的合成抗菌药物，主要用于预防与治疗细菌感染性的疾病。目前被应用于医学和兽医学临床上的常用磺胺类药物主要有磺胺嘧啶 (SDZ)、磺胺胍(SG)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)等。但由于磺胺类抗生素不能够被动物体完全代谢，大部分仍以原药或代谢物的形式经动物的粪便和尿液排出体外，最终通过多种途径进入到环境中造成污染。
生物处理法具有成本低、环境友好等特点，但是在对磺胺类抗生素的去除能力具有比较大的波动，例如常规污水处理厂采用的活性污泥法并不能有效的去除以磺胺甲基异恶唑为代表的大部分磺胺类抗生素，但经过定性驯化后的活性污泥却能够去除超过90％的磺胺类抗生素。生物处理工艺有望成为废水中去除SAs的一种环保、经济的方法。
第一个磺酰胺降解菌是约在10年前被分离，后续研究分离出了一组能够降解或转化不同种类磺酰胺的细菌(包括磺胺甲恶唑，SMX；磺胺甲嘧啶，SM1；磺胺嘧啶，SDZ；磺胺二甲基嘧啶，SM2)能够降解浓度范围从600ng/L到152mg/L，这些分离菌株降解磺酰胺的能力是动态变化的，筛选获得菌株的来源也有可能不同，但活性污泥和土壤仍然是磺胺降解菌分离获得的主要生境。
专利号：CN201811243115.8报道了一株能降解磺胺二甲基嘧啶的节杆菌S-2，可见节杆菌对于磺胺二甲基嘧啶的降解具有较好的效果。但是相比混合微生物群落，单一微生物的弊端在实际应用中较为明显。通过复合菌剂降解磺酰胺是目前急需解决的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用。
本发明提供的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，它是由节杆菌YL1和假单胞菌YL2混合而成；
所述的节杆菌YL1为产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)YL1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月6日，保藏编号为CGMCC No.18365；
所述的假单胞菌YL2为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月6日，保藏编号为CGMCC No.18366。
本发明的混合菌剂用于污水中磺胺类抗生素的生物处理；也可以用于污水中其他难降解有机物的生物处理，减轻对环境的污染。
为实现上述目的，本发明所采取的的技术措施是发明一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，是由节杆菌YL1和假单胞菌YL2的菌液按1：(2-3)的体积比混合而成。
本发明分离的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2，能够以磺胺类抗生素为唯一碳源生长，并能实现对该类抗生素的快速、高效降解，双菌株互作的菌剂体系相比单一菌种在实际应用的过程中具有更高的去除效率、更彻底的去除量以及更稳定的群落结构，对于实现水体中磺胺类抗生素的生物处理十分关键。
本发明的降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂用于污水中抗生素残留的降解，包含以下有益效果：
1.抗逆性强、复合菌剂在实际应用中更有利于稳定存在。
2.应用两种细菌配比，实现了优势互补,有效地提高了对抗生素的降解率,缩短了降解时间。相比节杆菌YL1的单菌降解作用，双菌系统高出10％～15％的总有机碳去除量。
3.对抗生素污染的污水修复效果良好,能把有毒有害的抗生素在微生物作用下,使抗生素残留物的结构发生改变,从而引起其化学和物理性质发生改变,即通过将抗生素从大分子化合物降解为小分子化合物，实现对环境污染的无害化处理的过程,其转化效率高,环保效果明显。
4.生产采用通用发酵设备,生产工艺简单,生产原料易得,成本低,应用操作方便,无污染产生,易于推广应用。
附图说明
图1是本发明所述降解物磺胺类抗生素：a.代表磺胺嘧啶(SDZ)、b.代表磺胺甲恶唑 (SMX)、c.代表磺胺甲基嘧啶(SM1)、d.代表磺胺二甲基嘧啶(SM2)的分子结构式；
图2是本发明所述磺胺类抗生素降解混合菌剂产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的扫描电镜照片：a.代表产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1的扫描电镜照片，b.代表韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的扫描电镜照片；
图3是本发明所述磺胺类抗生素降解混合菌悬液在36h内对不同初始浓度的磺胺类抗生素的降解图；
图4是本发明所述磺胺类抗生素降解混合菌剂在磺胺类抗生素(以磺胺甲恶唑为例) 初始浓度100mg/L的基础盐培养基中培养时，其生长和磺胺甲恶唑的浓度与TOC变化的规律图；其中，实心方框代表节杆菌单独存在，实心圆形代表混合菌剂同时存在；黑色线条表示菌株的菌浊OD660随时间的变化情况，蓝色线条表示培养体系中磺胺甲恶唑的变化情况，红色线条表示培养体系中TOC的变化情况；
图5是磺胺类抗生素混合菌剂按照不同比例混合的菌悬液在36h内对200mg/L的磺胺甲恶唑的降解图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，它是由节杆菌YL1和假单胞菌YL2混合而成；
所述的节杆菌YL1为产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)YL1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月6日，保藏编号为CGMCC No.18365；
所述的假单胞菌YL2为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月6日，保藏编号为CGMCC No.18366。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：节杆菌YL1和假单胞菌YL2按体积比为1：(2-3)的比例混合。其它与具体实施方式一相同。
本实施方式还提供一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂的制备及优化方法，其制备过程如下：
(一)、抗生素母液的制备：精准称量5g磺胺类抗生素，用二甲基亚砜(DMSO)补至100mL；
(二)、菌落培养：
①、基础盐培养基制备：培养基成分为：0.5g(NH4)2SO4、1.5g KH2PO4、3.5g K2HPO4、0.15g MgSO4·7H2O、0.5g NaCl、1mL微量元素以及2mL储备液，用蒸馏水补至1000mL；所述微量元素液成分为：50g EDTA、5.5g CaCl2·2H2O、5.06g MnSO4·4H2O、5g FeSO4·7H2O、 2.2gZnSO4·7H2O、1.61g CoCl2·6H2O、1.57g CuSO4·5H2O、1.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O，用蒸馏水补至1000mL。LB培养基分为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，用蒸馏水补至1000mL；所述培养基均在配制后调节pH至7.0后，用高温高压灭菌器在121℃的条件下灭菌20min；
固体培养基的配置：向上述液体培养基中加入18g/L的琼脂，调节pH值为7.0，再高压灭菌后冷却至50℃，然后，加入抗生素母液，使其最终浓度为100mg/L，即得到磺胺类抗生素基础盐固体培养基，备用；
②、培养：将市政污水处理厂曝气池的活性污泥用10～107倍比稀释，然后涂布于磺胺甲基异恶唑的筛选培养基的固体培养及平板上，在30℃下，培养4～6天，成为培养菌落，备用；
(三)、菌株分离：在经过培养的固体培养基平板上挑取单菌落，通过平板划线，分离纯化出细菌菌株，经过生理生化和16S rRNA测序鉴定，保留产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2，备用；
(四)、传代驯化：
①、驯化将分离纯化的节杆菌菌株和假单胞菌菌株，分别经磺胺类抗生素基础盐固体培养基和LB固体培养基传代驯化，其具体方法是将节杆菌菌株接种于质量浓度为20mg/L 的磺胺类抗生素固体培养基上，将假单胞菌菌株接种于LB固体培养基上，同时在30℃下培养4天后再分别接种入质量浓度为40mg/L的磺胺类抗生素固体培养基和LB固体培养基上，在30℃下培养4天，……，以此类推，连续传代培养，每次使磺胺类抗生素质量浓度增加，至磺胺类抗生素的最终质量浓度达100mg/L，完成传代驯化，分别成为驯化后的节杆菌菌株和假单胞菌菌株，备用；
②、保存：将驯化后的节杆菌菌株和假单胞菌菌株分别接种于培养基斜面，制成斜面菌种，-20℃保存，备用；
(五)、种菌液制备：在pH值为7.0的条件下，取保存的节杆菌YL1斜面菌种在磺胺甲基异恶唑质量浓度为100mg/L的磺胺甲恶唑基础盐培养基中活化48h，同时取保存的假单胞菌YL2斜面菌种在LB培养基中活化48h。分别转接后进行传代培养，三代过后取对数生长期的菌液，以5000r/min离心10min，收集菌体，经0.1mol/L、pH为7.0的磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，并最终采用磷酸缓冲盐溶液调整菌液浓度，使其菌浊浓度均达到OD660为1.0即可，分别制成节杆菌YL1和假单胞菌YL2种菌液，备用：
(六)、混合菌液制备：将节杆菌YL1种菌液和假单胞菌YL2种菌液按1:(0.1-3)的体积比混合，即成降解污水中抗生素的混合菌剂。
上述含磺胺类抗生素质量浓度不同的磺胺类抗生素基础盐培养基只是磺胺类抗生素的含量和种类有变化，其他组分量均是相同的。
本发明的降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂中的种菌液配比比例的确定过程如下：
(1)、基础盐培养基配置：取(NH4)2SO4 0.05g、KH2PO4 0.15g、K2HPO4 0.35g、MgSO4·7H2O 0.015g、NaCl 0.05g、0.1mL微量元素，用蒸馏水补至100mL，调节pH值至 7.0，成为基础盐培养基，备用。
(2)、磺胺类抗生素降解实验：
①、磺胺类抗生素基础盐液体培养基制备：按照磺胺类抗生素母液配置方法，分别配置得到磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶母液，将磺胺类抗生素母液加入基础培养基，使其浓度质量为100mg/L，即得磺胺类抗生素基础盐液体培养基，备用；
②、接种试验：按1％接种量,将不同组合接种于的磺胺类抗生素基础盐液体培养基中，同时，以不接菌的磺胺类抗生素基础盐培养基为对照，在30℃下培养3～5天后，用液相色谱测定其对磺胺类抗生素的降解率为75％～100％，耐受磺胺类抗生素最高浓度为500mg/L。
本发明采用的节杆菌YL1对磺胺类抗生素中磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲基嘧啶的降解率均能够达到95％以上。假单胞菌YL2对磺胺类抗生素的去除无明显效果。
最终筛选出两种种菌液的最佳配比范围为节杆菌YL1：假单胞菌YL2＝1：(2-3)。
具体实施方式三：本实施方式一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂应用，它用于污水中磺胺类抗生素的处理或者污水中有机物的降解。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是：在进行污水中磺胺类抗生素的处理过程中处理温度为30℃，处理过程中进行振荡培养，振荡培养的转速为160r/min。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述的污水中磺胺类抗生素浓度为100mg/L。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式三不同的是：所述的污水中磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶或磺胺二甲基嘧啶。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式三不同的是：将节杆菌YL1种菌液和假单胞菌YL2种菌液混合后，即得到所述的降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式三不同的是：节杆菌YL1种菌液和假单胞菌YL2种菌液的体积比为1:(0.1-3)。其它与具体实施方式三相同。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述清楚说明本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。
本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本实发明的限定。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例1
本发明提供的混合菌剂为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2均是从活性污泥中筛选分离获得，选取磺胺甲恶唑为底物，具体筛选分离步骤如下：
(1)从哈尔滨某污水处理厂二沉池取5g新鲜活性污泥，注入含有100mg/L磺胺甲恶唑的100mL基础盐培养基中，置于250mL的三角瓶中，在30℃的条件下振荡培养，振荡转速为160r/min；
(2)一周后，取20mL步骤(1)的培养物注入到含有100mL的基础盐培养基的250mL锥形瓶中，并添加100mg/L的磺胺甲恶唑，在步骤(1)的条件下培养；
(3)重复进行步骤(2)约40天后，取20mL步骤(2)的培养物注入到含有100mL 的LB培养基的250mL锥形瓶中，并添加100mg/L的磺胺甲恶唑，在步骤(1)的条件下培养；
(4)重复进行步骤(3)约5个月后，取1mL步骤(3)的培养物，用无菌蒸馏水依照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的倍数对培养物进行梯度稀释，分别取100μL各倍数稀释液涂布于添加15％琼脂的LB培养基的平板，将平板置于30℃条件下静置培养；
(5)在步骤(4)中的平板表面有菌落产生后，用接种环挑取所有单菌落，分别接种至10mL的含有100mg/L磺胺甲恶唑的培养基2中，置于250mL锥形瓶中，以无菌过滤透气封口膜封口，在步骤(1)的条件下培养；
(6)在步骤(5)中的培养物产生明显浊度后，分别对各单菌落的培养物中的磺胺甲恶唑浓度进行检测，将浓度低于检测限的培养物反复划线于添加15％琼脂的LB培养基的平板进行纯化。
(7)在步骤(6)中选取具有最优降解磺胺甲恶唑能力的菌落进行分离纯化，获得若干菌株，其中将不同菌落进行复配实验，获得降解速率最快的两株菌，分别为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2；
其中，基础盐培养基成分为：0.5g(NH4)2SO4、1.5g KH2PO4、3.5g K2HPO4、0.15gMgSO4·7H2O、0.5g NaCl、1mL微量元素以及2mL储备液，用蒸馏水补至1000mL；所述微量元素液成分为：50g EDTA、5.5g CaCl2·2H2O、5.06g MnSO4·4H2O、5g FeSO4·7H2O、 2.2gZnSO4·7H2O、1.61g CoCl2·6H2O、1.57g CuSO4·5H2O、1.1g(NH4)6Mo7O2·4H2O，用蒸馏水补至1000mL；所述储备液成分为：5g磺胺二甲基嘧啶，用二甲基亚砜(DMSO) 补至100mL。
LB培养基成分为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl，用蒸馏水补至1000mL。
所述培养基均在配制后调节pH至7.0后，用高温高压灭菌器在121℃的条件下灭菌20min。
本发明所含的菌株产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1的形态特征为：扫描电子显微镜下，该菌株菌体呈杆状(见附图说明2a)；该菌株用涂布或划线法接种在含磺胺甲恶唑的固体基础盐培养基表面，于30℃培养7d后，能形成明显可见菌落，其形态为较小、圆形、黄色、略有凸起、易挑起；将该菌株菌落少量接种在含100mg/L磺胺甲恶唑的液体基础盐培养基内，在30℃的条件下以160r/min振荡培养3d，会形成均一的乳白色菌液。
本发明所含的韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的形态特征为：扫描电子显微镜下，该菌株菌体呈圆柱状(见附图说明2b)；该菌株单独用涂布或划线法接种在含磺胺甲恶唑的固体基础盐培养基表面，并不见菌落生长，但与YL1同时接种于含磺胺甲恶唑的固体基础盐培养基表面，于30℃培养5d后，能形成明显可见菌落；该菌株单独用涂布或划线法接种在LB固体培养基表面，于30℃培养2d后，其形态为粘稠、白色、略有凸起、易挑起；将该菌株菌落少量接种在含100mg/L磺胺甲恶唑的液体基础盐培养基内，在30℃的条件下以160r/min振荡培养，并不会有明显的菌浊变化。
本发明提供的产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2经宝生物工程(大连)有限公司通过16S rRNA进行鉴定，具体步骤如下：
(1)挑取菌株，置于50μL的TaKaRa可直接用于PCR的微生物裂解缓冲液(Code No.9164)中，80℃变形15min后，离心取上清作为PCR模板；
(2)使用TaKaRa 16S rDNA细菌鉴定PCR试剂盒(Code No.RR176)进行PCR扩增目的片段，反应条件为：94℃5min，一个循环；94℃1min，55℃1min,72℃1.5min，共30个循环；72℃5min，一个循环。
(3)上述PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳后，用ShAP法经37℃反应30min、70℃反应15min进行纯化；
(4)上述纯化后的PCR以SEQ Forward、SEQ Internal和SEQ Reverse为引物进行DNA 测序；
(5)上述测序结果通过Blast程序进行同源性比较，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明菌株YL1与异养产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)YL1 的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株YL1被鉴定为异养产脲节杆菌 (Paenarthrobacter ureafaciens)YL1，属于革兰氏阳性菌。菌株Paenarthrobacterureafaciens YL1的16S rRNA的序列如序列表Seq ID No：1所示。
(6)上述测序结果通过Blast程序进行同源性比较，得到与相关菌株的基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明菌株YL2与异养产脲节杆菌(Pseudomonas koreana)YL2的基因序列的同源性在99％以上，分离菌株YL2被鉴定为异养产脲节杆菌(Pseudomonaskoreana)YL2，属于革兰氏阴性菌。菌株Pseudomonas koreana YL2的16S rRNA的序列如序列表Seq ID No：2所示。
实施例2
本实施例提供一种在以磺胺类抗生素为唯一碳源培养基中对其混合降解菌株的生长状况研究的应用，其步骤如下：
(1)挑取生长在含有100mg/L磺胺甲恶唑并添加了15％琼脂的基础盐培养基的平板上的YL1菌落，接种于100mL含100mg/L磺胺甲恶唑的基础盐液体培养基中，用250mL 锥形瓶盛装，30℃振荡培养至OD660＝0.086，作为YL1试验的细菌母液；
(2)挑取生长在LB培养基的平板上的YL2菌落，接种于LB液体培养基中，用250mL锥形瓶盛装，30℃振荡培养至OD660＝0.581，作为YL2试验的细菌母液；
(3)休眠细胞的制备：上述细菌母液待其生长到对数生长期，分别将菌液接种到富集培养基中，振荡培养48h后，将菌液倒入无菌的离心管中，离心10min(4℃，10000 r/min)，弃去上清液，倒入无菌的PBS冲洗2-3次后，用PBS制成OD600约为1.0的菌悬液，4℃保藏。
(4)将上述细菌YL1和YL2各1mL的休眠细胞菌液接种至100mL含有初试浓度100mg/L的磺胺嘧啶的基础盐液体培养基中，置于250mL锥形瓶中，以无菌过滤透气封口膜封口，置于30℃、160r/min的条件下振荡培养，分时段取样并检测样品的OD660、TOC 和磺胺甲恶唑浓度。同时对照组为同等实验条件下，接种2mL的YL1休眠细胞菌液至 100mL含有初试浓度100mg/L的磺胺嘧啶的基础盐液体培养基中。
所述的样品OD660的检测，是用紫外分光光度计在紫外波长660nm的条件下对样品的浊度进行测量。
所述的样品TOC的检测，是将10mL样品用孔径为0.45μm的有机膜过滤后上样，用Multi N/C 2100S分析仪对样品的TOC进行检测。
所述的样品磺胺嘧啶浓度的检测，是用waters e2695高效液相色谱仪并配置waters 2489(紫外可见检测器)进行检测，色谱柱为C18(150×4.6nm，5μm)，柱温30℃；流动相为甲醇：1％乙酸水＝25:75，流速1.0mL/min；检测波长265nm；进样量10μL；保留时间为5min。
附图说明3为混合菌剂在以磺胺甲恶唑为唯一碳源培养基中生长和对磺胺甲恶唑降解的情况。由图可知，混合菌剂对磺胺甲恶唑的快速降解主要发生在双菌的对数生长期；反应体系中的TOC随着磺胺甲恶唑的浓度的降低不断减少，表明磺胺甲恶唑被混合菌株降解；在适宜的生长条件下，混合菌株可将初试浓度100mg/L的磺胺甲恶唑在2d内降解至浓度低于检测限一下。相比降解菌YL1单一存在的情况，混合菌剂系统具有更快的降解速率，更高的TOC去除率。
实施例3
本实施例提供一种在不同磺胺甲恶唑初始浓度条件下，混合菌剂对磺胺甲恶唑的降解率，具体步骤如下：
(1)利用产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的休眠细胞菌液，等比例混合，接种到含有50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L的磺胺甲恶唑在30℃的条件下以160r/min反应 36h；
(2)取出上述反应物，检测反应后磺胺二甲基嘧啶的浓度。
附图说明4是磺胺甲恶唑混合菌剂菌悬液在36h内对不同初始浓度的磺胺二甲基嘧啶的降解情况。由图可知，该菌株可以耐受超过300mg/L的磺胺甲恶唑，在反应36h后，菌悬液可以将初始浓度不超过100mg/L的磺胺甲恶唑降解至浓度低于检测限。
实施例4
(1)利用产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1和韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的休眠细胞菌液，按照1：(1-3)的比例接种到含200mg/L的磺胺甲恶唑在30℃的条件下以160r/min反应36h；
(2)取出上述反应物，检测反应后磺胺二嘧啶的浓度。
附图说明5是磺胺甲恶唑混合菌剂按照不同比例混合的菌悬液在36h内对200mg/L的磺胺甲恶唑的降解情况。由图可知，当混合菌液中产脲节杆菌(Paenarthrobacterureafaciens)YL1：韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2的比例在1：(2-3)时，对磺胺甲恶唑的去除效率达到最优。
序列表
<110> 哈尔滨工业大学
<120> 一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂及其制备方法和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 1352
<212> DNA
<213> 产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens) YL1。
gtcgaacgat gatccggtgc ttgcgccggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60
agtaacctgc ccttgactct gggataagcc tgggaaactg ggtctaatac cggatatgac 120
tcctcatcgc atggtggggg gtggaaagct ttttgtggtt ttggatggac tcgcggccta 180
tcagcttgtt ggtggggtaa tggcctacca aggcgacgac gggtagccgg cctgagaggg 240
tgaccggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300
atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcgacgccgc gtgagggatg acggccttcg 360
ggttgtaaac ctctttcagt agggaagaag ccctctttgg gggtgacggt acttgcagaa 420
gaagcgccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggcgca agcgttatcc 480
ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggtttgtcgc gtctgctgtg aaagaccggg 540
gctcaactcc ggttctgcag tgggtacggg cagactagag tgcagtaggg gagactggaa 600
ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa caccgatggc gaaggcaggt 660
ctctgggctg taactgacgc tgaggagcga aagcatgggg agcgaacagg attagatacc 720
ctggtagtcc atgccgtaaa cgttgggcac taggtgtggg ggacattcca cgttttccgc 780
gccgtagcta acgcattaag tgccccgcct ggggagtacg gccgcaaggc taaaactcaa 840
aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgcgg attaattcga tgcaacgcga 900
agaaccttac caaggcttga catggaccgg aaagacctgg aaacaggtgc cccgcttgcg 960
gccggtttac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt1020
cccgcaacga gcgcaaccct cgttctatgt tgccagcggt tcggccgggg actcatagga1080
gactgccggg gtcaactcgg aggaaggtgg ggacgacgtc aaatcatcat gccccttatg1140
tcttgggctt cacgcatgct acaatggccg gtacaaaggg ttgcgatact gtgaggtgga1200
gctaatccca aaaagccggt ctcagttcgg attggggtct gcaactcgac cccatgaagt1260
cggagtcgct agtaatcgca gatcagcaac gctgcggtga atacgttccc gggccttgta1320
cacaccgccc gtcaagtcac gaaagttggt aa 1352
<210> 2
<211> 1410
<212> DNA
<213> 韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana) YL2。
accatgcagt cgagcggatg aaggagcttg ctcctggatt cagcggcgga cgggtgagta 60
atgcctagga atctgcctgg tagtggggga caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca 120
tacgtcctac gggagaaagc aggggacctt cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt 180
cggattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag 240
aggatgatca gtcacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 300
gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc 360
ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag gaagggttgt agattaatac tctgcaattt 420
tgacgttacc gacagaataa gcaccggcta actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga 480
gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgcg cgtaggtggt ttgttaagtt 540
ggatgtgaaa tccccgggct caacctggga actgcatcca aaactggcaa gctagagtat 600
ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac 660
cagtggcgaa ggcgaccacc tggactgata ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc 720
aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcaactag ccgttgggag 780
ccttgagctc ttagtggcgc agctaacgca ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc 840
aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 900
ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggc cttgacatcc aatgaacttt ccagagatgg 960
attggtgcct tcgggagcat tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg1020
agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc aacccttgtc cttagttacc agcacgtcat1080
ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag1140
tcatcatggc ccttacggcc tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggttg1200
ccaagccgcg aggtggagct aatcccacaa aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca1260
actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt aatcgcgaat cagaatgtcg cggtgaatac1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca ccagaagtag1380
ctagtctaac cttcgggagg acggtaccac 1410

Claims (8)

1.一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，其特征在于它是由节杆菌YL1和假单胞菌YL2混合而成；
所述的节杆菌YL1为产脲节杆菌(Paenarthrobacter ureafaciens)YL1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月14日，保藏编号为CGMCC No.18365；
所述的假单胞菌YL2为韩国假单胞菌(Pseudomonas koreana)YL2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年8月14日，保藏编号为CGMCC No.18366。
2.根据权利要求1所述的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂，其特征在于节杆菌YL1和假单胞菌YL2按体积比为1：(2-3)的比例混合。
3.如权利要求1或2所述的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂的应用，其特征在于它用于污水中磺胺类抗生素的处理或者污水中有机物的降解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于在进行污水中磺胺类抗生素的处理过程中处理温度为30℃，处理过程中进行振荡培养，振荡培养的转速为160r/min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的污水中磺胺类抗生素浓度为100mg/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的污水中磺胺类抗生素为磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺甲基嘧啶或磺胺二甲基嘧啶。
7.如权利要求1或2所述的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂的制备方法，其特征在于将权利要求1所述产脲节杆菌YL1种菌液和权利要求1所述韩国假单胞菌YL2种菌液混合后，即得到所述的降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂。
8.根据权利要求7所述的一种降解污水中磺胺类抗生素的混合菌剂的制备方法，其特征在于节杆菌YL1种菌液和假单胞菌YL2种菌液的体积比为1:(0.1-3)。
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