CN101993838A

CN101993838A - 具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌h1及其应用

Info

Publication number: CN101993838A
Application number: CN2010102196899A
Authority: CN
Inventors: 张丽丽; 陈建孟; 何丹; 朱润晔; 杨卫兵
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2010-07-08
Filing date: 2010-07-08
Publication date: 2011-03-30

Abstract

本发明提供了提供一株高效、快速降解氯苯胺类物质的菌种——代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis strain)H1及其应用。所述代尔夫特菌H1保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209249，保藏日期2009年11月4日。该菌株可在好氧条件下快速降解氯苯胺类污染物，将在氯苯胺类工业废水治理实践中发挥重要作用。此外，该菌株为野生型，遗传背景清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对氯苯胺类污染物的降解能力。

Description

具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌H1及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株具有氯苯胺降解能力的新菌株——代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis strain)H1及其应用。

(二)背景技术

氯代苯胺类化合物是一类重要的化工原料，被广泛应用于染料、农药、防腐剂的合成和制药工业中。作为氯代芳烃化合物的一族，它们具有“三致效应”与遗传毒性，难于生物降解，持久滞留于环境，并容易生物富集，对生态环境和人体健康造成严重威胁，已被美国环保署(EPA)和欧盟列入优先控制污染物名单。因此，研究氯苯胺类化合物的高效降解对于改善水体环境质量、保障人群健康和生态安全具有重要意义。生物降解技术具有反应条件温和、运行费用低和无二次污染等特点，是降解该类物质最有效的方法之一。

采用生物技术降解氯苯胺类物质的关键之一便是获得具有高效降解氯苯胺能力的优良菌株。目前，国内外研究者对氯苯胺的生物降解已开展了大量研究工作，分离到一些在好氧或厌氧条件下降解氯苯胺的细菌，主要有假单胞菌(Pseudomonas)，不动杆菌(Acinetobacter)，丛毛单胞菌(Comamonas)，克雷白氏杆菌(Klebsiella)，黄杆菌属(Flavobacterium)，莫拉杆菌(Moraxella)，β变形菌(βProteobacteria)等。这些降解菌仅能降解单一的氯苯胺，且大多数菌株的降解效率有待进一步提高。本发明的降解菌株可实现高效降解氯苯胺类物质，因此，在实际应用中可发挥更重要的作用。

经检索专利和其他相关文献，尚未发现在好氧条件下应用代尔夫特菌属Delftia tsuruhatensis降解氯苯胺的报道。该降解菌的发现对工业废水中氯苯胺类污染物的高效净化具有重要意义。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株高效、快速降解氯苯胺类物质的菌种及其应用。

本发明采用的技术方案是：

具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis strain)H1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209249，保藏日期2009年11月4日。

所述的CCTCC No：M 209249来源于中国石化浙江镇海炼化污水处理厂曝气池中的活性污泥中，经驯化、分离、纯化获得，能以氯苯胺为唯一碳源和氮源。

所述代尔夫特菌H1菌落及生化特征如下：菌落呈淡乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；电镜观察，大小为(0.6～0.8)μm×(1.9～2.1)μm，有鞭毛，无芽孢菌；电子显微镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性。该菌株的16S rDNA的Genebank的登录号为GQ868495。

本发明还涉及所述的代尔夫特菌H1在微生物降解氯苯胺及其衍生物中的应用。

具体的，所述代尔夫特菌H1用于降解废水中的氯苯胺及其衍生物。

优选的，所述降解在15～45℃、pH4～10进行。更为优选的，所述降解在30℃、pH7进行。

该菌株在纯培养条件下，能将300mg/L的氯苯胺在33小时内完全降解，对氯苯胺的最高降解浓度可达600mg/L。

本发明的有益效果主要体现在：提供了一株高效、快速降解氯苯胺类物质的新菌株及其应用，该菌株可在好氧条件下快速降解氯苯胺类污染物，将在氯苯胺类工业废水治理实践中发挥重要作用。此外，该菌株为野生型，遗传背景清晰，适于进行遗传改良，有望大幅度提高对氯苯胺类污染物的降解能力。

(四)附图说明

图1为Delftia tsuruhatensis H1显微镜和透射电镜照片(a：革兰氏染色显微镜图片；b：透射电镜图片)；

图2为Delftia tsuruhatensis H1的系统发育树图；

图3为不同温度下菌Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺的降解曲线图；

图4为不同pH下菌Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺的降解曲线图；

图5菌Delftia tsuruhatensis H1对不同初始浓度的邻氯苯胺降解曲线；

图6为菌Delftia tsuruhatensis H1对不同初始浓度的间氯苯胺降解曲线；

图7为菌Delftia tsuruhatensis H1对不同初始浓度的对氯苯胺降解曲线；

图8为菌Delftia tsuruhatensis H1对混合底物的降解曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量)：

实施例1：Delftia tsuruhatensis H1(CCTCC No：M 209249)的分离、纯化及其鉴定

1.Delftia tsuruhatensis H1的分离及纯化

Delftia tsuruhatensis H1是从浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

(1)污泥定向驯化

取浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥。在SBR反应器中对活性污泥进行氯苯胺类物质的定向驯化，每36h为一驯化周期，驯化4个月，直至活性污泥对氯苯胺类物质实现稳定高效降解。

(2)菌株的筛选与纯化

从SBR反应器中取出5mL污泥，加入50mL无菌水于锥形瓶中，置于摇床160rpm，30℃振荡1小时。然后利用氯苯胺降解菌筛选培养基对活性污泥进行菌株筛选。氯苯胺降解菌筛选培养基成分：KH₂PO₄，0.24g/L；Na₂HPO₄，0.24g/L；MgSO₄·7H₂O，0.0696g/L；CaCl₂·2H₂O，0.022g/L；FeCl₃，0.005g/L；CuSO₄·H₂O，0.00003g/L；MnSO₄·H₂O，0.00013g/L；ZnCl₂，0.00023g/L；CoCl·6H₂O，0.00042g/L；NaMoO₄·2H₂O，0.00015g/L；AlCl₃·6H₂O，0.00005g/L；琼脂，15g/L；溶剂为水，pH 7～7.5。氯苯胺类物质另外分别添加：邻氯苯胺，100mg/L；间氯苯胺，100mg/L；对氯苯胺，100mg/L。氯苯胺降解菌筛选培养基接种活性污泥，在恒温培养箱28℃培养2～3天，挑取平板上长出的单菌落，得到多株纯菌落。

将筛选到的多株氯苯胺降解菌在含有氯苯胺类物质为唯一碳源和氮源的无机盐培养基中考察菌株对氯苯胺类物质的去除效果，通过同空白实验的对照，结果得到了一株高效降解氯苯胺类物质的菌株H1。所用的培养基成分为：KH₂PO₄，0.24g/L；Na₂HPO₄，0.24g/L；MgSO₄·7H₂O，0.0696g/L；CaCl₂·2H₂O，0.022g/L；FeCl₃，0.005g/L；CuSO₄·H₂O，0.00003g/L；MnSO₄·H₂O，0.00013g/L；ZnCl₂，0.00023g/L；CoCl·6H₂O，0.00042g/L；NaMoO₄·2H₂O，0.00015g/L；AlCl₃·6H₂O，0.00005g/L；邻氯苯胺，100mg/L；间氯苯胺，100mg/L；对氯苯胺，100mg/L；溶剂为水，pH 7～7.5。

2.Delftia tsuruhatensis H1的16S rDNA鉴定

通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定系统鉴定，确定H1菌为Delftia tsuruhatensis strain。具体步骤如下：

采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取Delftia tsuruhatensis H1的DNA，4℃保存。然后作为PCR反应的模板，设计引物，扩增Delftia tsuruhatensis H1的全序列DNA，上下游引物序列分别如下：

BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′

BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3′

PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(上海英骏)，测序结果见SEQ No.1。

将H1的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号GQ868495，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Delftia属，然后通过系统发育树的建立，H1可能为Delftia tsuruhatensis，图2为该菌的系统发育树图。为了进一步确定鉴定结果，通过各项生理生化实验以及Biolog微生物鉴定系统的分析，最终确定H1为Delftiatsuruhatensis。

实施例2：Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺类物质的降解特性

1.不同温度下菌Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺的生物降解性能

在不同温度下实施Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺的降解实验，发现其在25～35℃具有较高的降解氯苯胺系混合物的能力，从实际应用角度看，30℃为最为适宜的温度，此时去除率最高，具体实施步骤如下：

在无机培养基(无机盐培养基组成为：KH₂PO₄，0.24g/L；Na₂HPO₄，0.24g/L；MgSO₄·7H₂O，0.0696g/L；CaCl₂·2H₂O，0.022g/L；FeCl₃，0.005g/L；CuSO₄·H₂O，0.00003g/L；MnSO₄·H₂O，0.00013g/L；ZnCl₂，0.00023g/L；CoCl·6H₂O，0.00042g/L；NaMoO₄·2H₂O，0.00015g/L；AlCl₃·6H₂O，0.00005g/L；溶剂为水，pH7～7.5)中，添加氯苯胺类物质作为唯一碳源，氯苯胺类物质的终浓度为：邻氯苯胺，100mg/L；间氯苯胺，100mg/L；对氯苯胺，100mg/L。加入新鲜培养的H1的菌悬液，OD₆₀₀为0.2，接种量为2mL/100mL。分别置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的摇床中160rpm培养；另外准备6个同样的未接菌的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照。培养30h后，取样液相色谱检测氯苯胺类物质的浓度，同时测定菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制氯苯胺类物质的去除率曲线图及H1的生长曲线图。

结果如图3所示，表明在温度为15℃时，菌株对氯苯胺类物质的去除率较低。随着温度的逐渐提高，菌株对氯苯胺类物质的去除率也随之提高；在温度为25～35℃时为该菌株较为适宜生长的温度，菌株的生长和对氯苯胺类物质的去除率都达到了较高的值；温度30℃时达到了最大值，30h对氯苯胺类物质的去除率分别为邻氯苯胺，79.4％；间氯苯胺，100％；对氯苯胺，100％。随着温度的进一步提高，菌株的生长和降解能力开始下降。

2.不同pH下菌Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺类物质的降解特性

在不同pH下实施Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺类物质的降解实验，结果表明其最佳的生长降解pH值为7，具体实验方案如下：

在7个500mL的盐水瓶中加入100mL等量的无机盐培养基，氯苯胺类物质作为唯一碳源，初始浓度为100mg/L，分别调节pH至4、5、6、7、8、9、10；同时准备7瓶相同的培养基作为空白对照。均接种2mL新鲜培养的H1菌悬液，OD₆₀₀为0.2，在30℃，160rpm下培养。分别在0h，30h取样，检测培养基中的氯苯胺类物质的浓度变化和菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制氯苯胺类物质的去除率曲线图及H1的生长曲线图。

结果如图4所示，在pH为4、5、9、10时，H1对氯苯胺类物质的去除效果较差。在pH为4、10的培养液中，溶液较澄清，表明菌株生长十分不好。在pH为5～9的条件下，细菌都能以氯苯胺类物质为唯一碳源生长，只是生长和降解速率有所不同，在pH为7时，菌株H1的生长和降解速率最快，对邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺30h的去除率分别为78.6％、100％、100％。

3.菌Delftia tsuruhatensis H1对不同初始浓度的氯苯胺类物质的降解特性

在不同氯苯胺类物质初始浓度下，实施H1对邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺四种物质的降解，结果发现H1对邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺的耐受浓度为100mg/L、600mg/L、600mg/L。具体实施方案如下：

在500ml的盐水瓶中加入100mL的无机盐培养基，氯苯胺类物质作为唯一碳源。邻氯苯胺的最终浓度为10、25、50、75、100mg/L；间氯苯胺的终浓度为50、100、200、400、600mg/L；对氯苯胺的终浓度为50、100、200、400、600mg/L。分别接种等量2mL OD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养，间隔一段时间取样，绘制H1对氯苯胺类物质的降解曲线图。

从图5～图7可以看出在H1对邻氯苯胺的降解速率明显要慢于间氯苯胺和对氯苯胺，当邻氯苯胺浓度低于100mg/L时，H1可快速地降解邻氯苯胺，细菌生长良好，而在100mg/L时，菌株受到强烈抑制；当间氯苯胺浓度在600mg/L以内时，H1都可快速地降解间氯苯胺，细菌生长良好；当对氯苯胺浓度达到600mg/L时，菌株生长降解受到抑制，不能高效降解。

4.菌Delftia tsuruhatensis strainH1对混合底物的降解情况

在以邻氯苯胺、间氯苯胺、对氯苯胺三种物质为混合底物，实施菌Delftia tsuruhatensis H1对氯苯胺类物质的降解特性，结果表明其对三种物质的降解难易程度为：间氯苯胺＞对氯苯胺＞邻氯苯胺。具体实施方案如下：

在500mL的盐水瓶中加入100mL的无机盐培养基，加入氯苯胺类混合物作为唯一碳源，总浓度300mg/L，各物质浓度分别为100mg/L。接种2mL OD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养。每隔一段时间取样，检测培养基中的氯苯胺类物质的浓度和菌密度(OD₆₀₀)，直到降解完全。绘制氯苯胺类物质的降解曲线和菌株生长图。

结果如图8所示，在降解初期，菌株对氯苯胺的降解有5～10h左右的延滞期，同时菌株生长缓慢；在12h后，菌株开始适应该环境，进入对数生长期，氯苯胺类物质被快速降解，从图中可以看出H1对间氯苯胺和对氯苯胺的去除速率要明显快于邻氯苯胺；在20h时，间氯苯胺被完全降解，对氯苯胺、邻氯苯胺先后在22h、33h降解完。菌株的菌密度在18～20h达到最大值，20h后菌株进入衰退期。

Claims

1.具有氯苯胺降解能力的代尔夫特菌(Delftia tsuruhatensis strain)H1，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209249，保藏日期2009年11月4日。

2.如权利要求1所述的代尔夫特菌H1，其特征在于所述代尔夫特菌H1菌落及生化特征如下：菌落呈淡乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润；电镜观察，大小为(0.6～0.8)μm×(1.9～2.1)μm，有鞭毛，无芽孢菌；电子显微镜下观察该菌体的形态为稍粗杆菌，革兰氏染色阴性，氧化酶阳性。

3.如权利要求1所述的代尔夫特菌H1在微生物降解氯苯胺及其衍生物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述代尔夫特菌H1用于降解废水中的氯苯胺及其衍生物。

5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述降解在15～45℃、pH4～10进行。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述降解在30℃、pH7进行。