CN109337825B - 一株北京拟青霉菌株lyz7及其应用 - Google Patents

一株北京拟青霉菌株lyz7及其应用 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
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    • C02F2103/20—Nature of the water, waste water, sewage or sludge to be treated from animal husbandry

Abstract

本发明“一株北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7及其应用”，属于微生物领域。所述菌株LYZ7，其保藏号为CGMCC No.16487。本发明意外发现该菌株属于新的菌种，并将这类菌种命名为北京拟青霉Simplicillium pekinense。基于该菌株，本发明还提供一种可降解四环素的菌剂、四环素生物降解剂及四环素生物降解方法。本发明的菌株LYZ7对四环素的降解作用十分显著，处理14d后，降解率高达89.21％。

Description

一株北京拟青霉菌株LYZ7及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株北京拟青霉菌株LYZ7及其应用。
背景技术
近年来，随着我国养殖业的发展，四环素类抗生素因其价格低廉、效果显著等优点被广泛使用。由于该类抗生素在动物体内的吸收率较低，绝大部分会随着动物排泄物进入环境，并在环境中不断积累，对环境安全和人体健康构成威胁。
处理抗生素污染的方法有很多，主要分为非生物降解和生物降解。非生物降解主要是通过物理或化学手段使抗生素降解，如光解、水解和氧化降解等。虽然非生物降解能够快速去除抗生素残留，但应用于抗生素降解的化学材料会对环境产生一定程度的毒副作用。生物降解主要包括微生物降解、植物降解以及植物—微生物复合降解。微生物降解主要是通过微生物的降解作用，将抗生素从大分子物质分解成小分子物质，直至将其分解完全，具有低耗、环保和操作简单等优点，已成为处理抗生素污染的有效途径。
因此，筛选出能够高效降解四环素类抗生素的菌株，是解决四环素类抗生素污染问题的关键。现有技术也筛选出一些用于降解四环素的微生物菌株，例如，专利申请201710753603.2筛选出一株甲基杆菌属的菌株，可同时降解四环素、氧四环素和金霉素三种四环素类抗生素。专利申请201711212339.8找到一株克雷伯氏菌属的细菌菌株，可降解四环素。
但仅依靠上述这些菌株来降解四环素还远远不够，一方面降解效果有限，另一方面选择也受限，因此本领域亟需开发更多的新菌株、甚至发现新的菌种用于有效降解四环素。
发明内容
基于本领域存在的客观问题及上述需求，为降解四环素类抗生素，本发明意外发现一种拟青霉属的新种，将其命名为北京拟青霉(Simplicillium pekinense)，并提供了一株新的北京拟青霉菌株LYZ7，发现它能高效地降解四环素。
本发明的技术方案如下：
一株北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7，其保藏号为CGMCCNo.16487。
所述的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7的其rRNA基因ITS1-5.8S-ITS2区具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
所述的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7具备2种四环素类抗性基因tetS和tetX。
用于降解四环素的菌剂，其特征在于，包括：保藏号为CGMCC No.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7。
所述菌剂还包括，制备菌剂常用的辅料。
所述菌剂还包括，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
一种四环素生物降解剂，其特征在于，包括所述的菌剂。
一种四环素生物降解方法，其特征在于，包括：将保藏号为CGMCC No.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与四环素接触。
所述四环素生物降解方法包括：将保藏号为CGMCC No.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与待处理物料接触。
所述待处理物料选自疑似或确定被四环素污染的物料；优选地，所述待处理物料选自：养殖场废水、废物的氧化塘泥浆和沉积物；和/或，池塘水；和/或，养殖动物粪便；和/或，施用过动物粪肥的农田土壤中；和/或，高温厌氧消化池污泥等。
本发明发现一株拟青霉属菌株LYZ7，经分子生物学鉴定分类方法判定该菌株属于一种拟青霉属新种，并根据真菌命名规则将该新种命名为北京拟青霉(Simplicilliumpekinense)。同时将该北京拟青霉(Simplicillium pekinense)菌株LYZ7送保藏，保藏号为：CGMCC No.16487，保藏日期：2018年9月26日,保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
一种如上所述的北京拟青霉菌株LYZ7，其特征在于，所述菌株菌落直径8cm，气生菌丝白色，绒毛状至絮状。分生孢子梗发生于营养菌丝，单生，与菌丝形态相似。分生孢子顶生，成团或短链，柱形、长椭圆形，单细胞，无色，光滑，4～7.5x 0.7～1μm。
一种如上所述的北京拟青霉菌株LYZ7，其特征在于，通过荧光定量PCR检测出所述菌株LYZ7携带2种四环素类抗性基因tetS和tetX。tetS为编码核糖体保护蛋白基因，tetX为编码四环素灭活酶基因[5]。
一种如上所述的北京拟青霉菌株LYZ7的应用，其特征在于，所述北京拟青霉菌株LYZ7可用于改善被四环素类抗生素污染的生态环境。
一种如上所述的北京拟青霉菌株LYZ7的应用，其特征在于，所述北京拟青霉菌株LYZ7可用于降解四环素类抗生素。
一种如上所述的北京拟青霉菌株LYZ7的应用，其特征在于，所述北京拟青霉菌株LYZ7对四环素的降解效果显著。
优选地，在第14d，加入北京拟青霉菌株LYZ7的培养基中四环素浓度低至10.79mg/L，降解率高达89.21％。由此表明，北京拟青霉菌株LYZ7能够有效降解四环素，对四环素的削减有促进作用。
本发明的有益效果在于：本发明通过筛选能够以四环素为营养物质的菌株，对其进行ITS分子鉴定及四环素类抗性基因的测定，并对其降解能力进行探究，以期为解决抗生素污染问题提供理论依据。本发明的北京拟青霉菌株LYZ7可降解四环素，且在第14天时，就可达到十分显著的降解效果，且LYZ7携带2种四环素类抗性基因，不仅能够免受四环素的毒害，还能使四环素灭活。因此，本发明菌株在降解四环素类抗生素和改善被四环素类抗生素污染的生态环境领域具有良好的应用前景。
菌种保藏名称：LYZ7
保藏号：CGMCC No.16487
分类命名：北京拟青霉
拉丁名：Simplicillium pekinense
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年9月26日
说明书附图
图1为不同处理的四环素浓度变化；
图2为不同处理的四环素降解情况；
图3为LYZ7菌落形态；
图4为LYZ7扫描电镜图；
图5为LYZ7的系统发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
生物材料的来源
分离菌种的土壤样品取自北京农学院树林下腐殖土。
培养基
基础无机盐培养基：CaCl2，0.02g；(NH4)2SO4，1.0g；NaCl，0.5g；FeCl3，0.05g；K2HPO4，1.0g；NH4NO3，1.0g；KH2PO4，1.0g；pH＝7.0；
微量元素溶液：CoCl2·6H2O，2g；MnCl2·4H2O，8.5g；ZnCl2，0.1g；NiCl2·6H2O，0.2g；CuSO4·5H2O，0.3g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；Na2SeO4·2H2O，0.2g定容至1L容量瓶中待用；
筛选培养基：在灭菌无机盐培养基中加入四环素，根据试验需要配置成不同浓度；微量元素添加量为1mL·L-1；
PDA培养基：去皮土豆200g(加蒸馏水，煮30min，挤出汁液)，葡萄糖20g，琼脂18g，四环素100mg，定容至1L，pH＝6.0。
第1组实施例、本发明的菌株
本组实施例提供一株北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株，其保藏号为CGMCCNo.16487。
在具体的实施例中，所述北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7的rRNA基因ITS1-5.8S-ITS2区具有如SEQ ID NO.1所示的序列。
在进一步的实施例中，所述北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7具备2种四环素类抗性基因tetS和tetX。
tetS和tetX这两类基因并非所有四环素降解菌中都具备。tet(X)是唯一一种研究较为透彻的酶修饰基因,它编码的蛋白可化学修饰和降解四环素，广泛存在于各种环境介质中，含有tet(X)基因的四环素降解菌可应用于实际污染体系的生物修复。tetS基因是核糖体保护基因，为微生物自我保护机制，没有真正降低环境中四环素含量。
第2组实施例、本发明的降解四环素的菌剂
本组实施例提供一种用于降解四环素的菌剂，其特征在于，包括：保藏号为CGMCCNo.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株。
在优选的实施例中，所述菌剂还包括：制备菌剂常用的辅料。
在具体的实施例中，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。
上述各类辅料具备辅料领域技术人员通常理解的技术含义，本文不再一一赘述。
第3组实施例、本发明的四环素生物降解剂
本组实施例提供一种四环素生物降解剂，包括：第2组实施例任一所述的菌剂。
进一步地，所述四环素生物降解剂还可包括四环素降解剂领域常用辅料。
第4组实施例、本发明的四环素降解方法
本组实施例提供一种四环素降解方法，其特征在于，将保藏号为CGMCC No.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与四环素接触。
在一些实施例中，所述四环素生物降解方法包括：将保藏号为CGMCC No.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与待处理物料接触。
在另一些实施例中，所述待处理物料选自疑似或确定被四环素污染的物料；
在优选的实施例中，所述待处理物料选自：养殖场废水、废物的氧化塘泥浆和沉积物；和/或，池塘水；和/或，养殖动物粪便；和/或，施用过动物粪肥的农田土壤中；和/或，高温厌氧消化池污泥等。
实验例、本发明菌株的筛选、验证过程
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种来源
实验所用土壤样品取自北京农学院树林下腐殖土。
1.1.2培养基
基础无机盐培养基：CaCl2，0.02g；(NH4)2SO4，1.0g；NaCl，0.5g；FeCl3，0.05g；K2HPO4，1.0g；NH4NO3，1.0g；KH2PO4，1.0g；pH＝7.0；
微量元素溶液：CoCl2·6H2O，2g；MnCl2·4H2O，8.5g；ZnCl2，0.1g；NiCl2·6H2O，0.2g；CuSO4·5H2O，0.3g；Na2MoO4·2H2O，0.2g；Na2SeO4·2H2O，0.2g定容至1L容量瓶中待用；
筛选培养基：在灭菌无机盐培养基中加入四环素，根据试验需要配置成不同浓度；微量元素添加量为1mL·L-1；
PDA培养基：去皮土豆200g(加蒸馏水，煮30min，挤出汁液)，葡萄糖20g，琼脂18g，四环素100mg，定容至1L，pH＝6.0。
1.2方法
1.2.1降解菌的筛选、纯化及鉴定
取2.0g土壤样品，加到含有20mg·L-1四环素的无机盐培养液中，于25℃下在150r·min-1的摇床中黑暗培养7d；取0.5mL培养液，加到四环素浓度为40mg·L-1的筛选培养基中，于25℃下在150r·min-1的摇床中黑暗培养7d。重复以上操作，直至四环素类抗生素浓度为100mg·L-1。然后在四环素浓度为100mg·L-1的PDA培养基上，用稀释涂布法和平板划线法分别进行降解菌的分离、纯化。
参照《真菌鉴定手册》对筛选所得的降解菌进行形态特征观察和初步鉴定。分子生物学鉴定采用ITS rRNA测序分析。PCR扩增和序列测定：提取菌株总RNA为模板，PCR扩增其ITS序列。由中国科学院微生物研究所对纯化后的PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST，然后用MEGA 7.0软件进行系统发育树的构建。
1.2.2四环素降解实验
将筛选得到的降解菌接种到四环素浓度为100mg/L的筛选培养液中，28℃，在150r·min-1的摇床中黑暗培养14d，不添加降解菌的筛选培养液为空白对照组，分别在第2d，4d，6d，8d，10d，12d，14d进行取样，共取7次样；利用高效液相色谱法对样品中的四环素浓度进行测定。
1.2.3四环素类抗性基因的测定
鉴于筛选所得的降解菌对四环素具有一定的利用和降解效果，通过测定该菌是否携带四环素类抗性基因，来判断其对四环素的降解机制和途径。本研究测定了4种常见的四环素类抗性基因，分别为tetO，tetM，tetS和tetX，待测抗性基因的引物序列如表1所示，PCR反应体系如表2所示。
表1引物序列表
Figure BDA0001860316030000061
表2 PCR反应体系
Figure BDA0001860316030000071
2结果与分析
2.1降解能力的测定
本实验从高浓度四环素培养基中分离纯化出一种真菌LYZ7，并对其降解四环素的能力进行了测定。实验结果如图1所示，加入LYZ7的培养液中的四环素浓度显著低于空白对照组；四环素的降解情况如图2所示，LYZ7的降解效果显著，在第14d，加入LYZ7的培养基中四环素浓度低至10.79mg/L，降解率高达89.21％。由此表明，LYZ7能够有效降解四环素，对四环素的削减有促进作用。
2.2四环素降解菌LYZ7的鉴定
2.2.1降解菌LYZ7的形态特征
通过筛选试验，得到1株能够降解四环素的菌株LYZ7，其菌落形态如图3所示，其扫描电镜图如图4所示。LYZ7菌株在缺少碳源和氮源的情况下，可以将四环素作为营养物质来维持正常的生命活动。菌落直径8cm，气生菌丝白色，绒毛状至絮状。分生孢子梗发生于营养菌丝，单生，与菌丝形态相似。分生孢子顶生，成团或短链，柱形、长椭圆形，单细胞，无色，光滑，4～7.5x 0.7～1μm。
2.2.2降解菌LYZ7的ITS序列片段分析
降解菌株LYZ7的rRNA基因ITS1-5.8S-ITS2区序列测定结果如下：
CCAGGTCACCTGAAAAAAGTTGGGGTTTTACGGCGTGGCCGCTCTGAGCTTTCCGGTGCGAGAACAAGTTACTACGCAGAGGTCGCCTCGGAGGGCCGCCACTAGATTTCGGGGGCGGCGTCCCCGGCGAGATGCCGGGGGGAGTCTGCCGTCCCCCAACGCCGAGCCGTCCTCAAAAGAGTCGGGCTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGTATTTTTGCCTTTCGGCCACTCAGAAATGCTTATAAAAACAAAGAGTTTAAGTGTCCTCGGCGGCGCCGAAGCGCGCGCCGAAGCAACAAGTGGTAAGTTCACATAGGGTTTGGGAGTTGAATAACTCGATAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTTACTTCCCATGTGAACTTACCACTTGTTGCTTCGGCGCGCGCTTCGGCGCCGCCGAGGACACTTAAAACTCTTTGTTTTTATAAGCATTTCCGGAGTGGGCGAAAAGCGAAATTCAATGCATAATCTTTTCTAA
将获得的ITS序列在NCBI上进行BLAST，然后使用软件MEGA 7.0将LYZ7与同源性较高的10株菌进行系统发育树的构建，如图5所示。经分子生物学鉴定，确定LYZ7为拟青霉属的一个新种，初步定名为Simplicillium pekinense。将该LYZ7菌株送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：LYZ7
保藏号：CGMCC No.16487
分类命名：北京拟青霉
拉丁名：Simplicillium pekinense
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018年9月26日
2.3真菌LYZ7四环素类抗性基因的测定
如表3所示，通过荧光定量PCR检测出LYZ7携带2种四环素类抗性基因tetS和tetX。tetS为编码核糖体保护蛋白基因，tetX为编码四环素灭活酶基因[5]，由此推断，LYZ7对四环素的降解机制可能是其合成了核糖体保护蛋白，在免于四环素毒害的同时，合成了四环素灭活酶，加速样品中四环素的降解。
表3 tetS和tetX的检测值
Figure BDA0001860316030000081
Figure BDA0001860316030000091
3结论
本发明筛选到1株能够降解四环素的菌株LYZ7，通过ITS rRNA基因测序，并结合菌落形态及显微特征观察，确定LYZ7属于一种新发现的拟青霉属菌种，并将其命名为北京拟青霉Simplicillium pekinense。LYZ7携带2种四环素类抗性基因，不仅能够免受四环素的毒害，还能使四环素灭活。降解实验结果表明，LYZ7对四环素的降解作用十分显著，处理14d后，降解率高达89.21％。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京农学院
<120> 一株北京拟青霉菌株LYZ7及其应用
<130> P180739/BNX
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<170> PatentIn version 3.5
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<223> 菌株LYZ7的rRNA基因ITS1-5.8S-ITS2区序列
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tccccggcga gatgccgggg ggagtctgcc gtcccccaac gccgagccgt cctcaaaaga 180
gtcgggctcg agggttgaaa tgacgctcga acaggcatgc ccgccagaat gctggcgggc 240
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<213> Artificial Sequence
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Claims (9)

1.一株北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7，其保藏号为CGMCC No.16487。
2.用于降解四环素的菌剂，其特征在于，包括：保藏号为 CGMCC No.16487 的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，还包括，制备菌剂常用的辅料。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，还包括，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂二者之一、助滤剂、释放阻滞剂。
5.一种四环素生物降解剂，其特征在于，包括权利要求2-4任一所述的菌剂。
6.一种四环素生物降解方法，其特征在于，包括：将保藏号为CGMCC No.16487 的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与四环素接触。
7.根据权利要求6所述的四环素生物降解方法，其特征在于，包括：将保藏号为CGMCCNo.16487的北京拟青霉Simplicillium pekinense菌株LYZ7与待处理物料接触。
8.根据权利要求7所述的四环素生物降解方法，其特征在于，所述待处理物料选自疑似或确定被四环素污染的物料。
9.根据权利要求8所述的四环素生物降解方法，其特征在于，所述待处理物料选自：养殖场废水、废物的氧化塘泥浆和沉积物；和/或，池塘水；和/或，养殖动物粪便；和/或，施用过动物粪肥的农田土壤；和/或，高温厌氧消化池污泥。
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