CN113373066B - 腐植酸降解真菌ha-z3及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一株腐植酸降解真菌HA‑Z3及其应用。该菌株命名为茎点霉(Phoma sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月7日，保藏编号为CGMCC No.22456。该菌株具有优异的腐植酸降解效果，可将其制备成生物活性炭去除腐植酸，还可将其应用于制备土壤修复剂和生物有机肥料中，具有广泛的应用前景。

Description

腐植酸降解真菌HA-Z3及其应用
技术领域
本发明涉及腐植酸降解真菌技术领域，尤其涉及一株来源于腐木土壤中的腐植酸降解真菌HA-Z3及其应用。
背景技术
养殖场的废水主要包含饲料的残渣、残余的粪便、尿液以及冲洗水等，属于中高浓度有机废水，在经过多级生化处理工艺如上流式厌氧污泥床(UASB)、序批式反应器(SBR)等后，其中大部分有机污染物能被去除，但是色度难以达到排放标准，而养殖场废水色度主要由腐殖酸形成，常呈现为黑色、灰棕色或棕黄色。此种有色养殖废水，一旦进入天然水体或农田就会导致严重的污染，使水体的自净功能下降，对生态环境造成破坏。腐植酸的分子结构中含有大量的醌基、羰基、氨基、羧基和甲氧基等基团，这些基团中含有大量可被氧化剂攻击的位点，在加氯消毒过程中，容易被氯攻击而产生消毒副产物，这些消毒副产物通常具有致癌、致突变等作用。并且腐植酸具有亲水性以及吸附性能，易于与重金属离子及其他有机物发生反应生成毒性更大的污染物，从而对生态环境和人类的健康形成巨大的威胁。
近年来利用高级氧化技术处理腐植酸备受关注，虽然能有效去除腐植酸，但成本较高。而微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染等独特的优越性，同时微生物降解有机物还具有来源广泛、选用便利、操作简单等优点。因此在自然界中分离筛选出腐植酸高效降解菌，并对影响高效腐植酸降解菌降解性能的腐植酸初始浓度、初始pH和孢子菌悬液投加量进行探讨有重要的现实意义，以期为建立使高效腐植酸降解菌成为生物活性炭上优势菌的技术提供应用基础。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株来自于自然界尤其是土壤中的能够降解腐植酸的微生物，为其应用于降解腐植酸提供帮助。
第一方面，本发明实施例公开了一株腐植酸降解真菌HA-Z3，命名为茎点霉(Phomasp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月7日，保藏编号为CGMCC No.22456。
第二方面，本发明实施例公开了一种降解腐植酸废水的方法，其特征在于，将第一方面所述的腐植酸降解真菌HA-Z3配制成108CFU/mL的孢子菌悬液，按照0.5％～6％(v/v)的比例加入至腐植酸废水，并调节pH值为3～10，混合处理72h即可。
第三方面，本发明实施例公开了一种生物活性炭，包括活性炭及附着在所述活性炭上的如第一方面所述的腐植酸降解真菌HA-Z3。
第四方面，本发明实施例公开了第三方面所述的生物活性炭的制备方法，包括获得腐植酸降解真菌HA-Z3的孢子菌悬液，将其转接至含有经预处理活性炭的发酵培养基中发酵后，过滤出活性炭颗粒，经过洗涤和干燥处理，即可得到所述生物活性炭。
第五方面，本发明实施例公开了第一方面所述的腐植酸降解真菌HA-Z3或其代谢产物的应用，所述应用包括制备土壤修复剂、生物有机肥料及生物活性炭中的应用。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明中涉及一株腐植酸降解真菌HA-Z3，命名为茎点霉(Phoma sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月7日，保藏编号为CGMCC No.22456。其筛选来自于腐木下方土壤，其具有优异的腐植酸降解效果，可将其制备成生物活性炭进行腐植酸降解处理，还将其应用于制备土壤修复剂和生物有机肥料中，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例初筛得到的5株真菌对腐植酸的降解效果图。
图2为本发明实施例提供的腐植酸降解真菌HA-Z3在PDA固体培养基上的菌落形态图。
图3为本发明实施例提供的高效腐植酸降解真菌HA-Z3的系统发育进化树。
图4为本发明实施例HA-Z3菌株对不同初始浓度腐植酸的降解效果图。
图5为本发明实施例HA-Z3菌株在不同初始pH下的腐植酸降解效果图。
图6为本发明实施例HA-Z3菌株在不同投加量下的腐植酸降解效果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下方实施例中为详细说明的试剂或设备均可从商业途径能够获得。
实施例1、腐植酸降解真菌的筛选
1.1取样：土样采自兰州理工大学彭家坪校区腐木下方5cm处土壤。
1.2培养基
(1)富集培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然；
(2)初筛培养基：腐植酸0.03g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然；
(3)驯化培养基：①去皮马铃薯200g，葡萄糖2g，腐植酸0.005g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然；②马铃薯(去皮)2g，葡萄糖0.2g，腐植酸0.015g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然。
1.3腐植酸溶液的配制：称取1g腐植酸，加入900mL去离子水中，充分搅拌使其完全溶解，调节pH为7.0-7.2，再稀释至1000mL，储存在棕色瓶中备用。
1.4实验仪器及设备：电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)、高压蒸汽灭菌锅(上海力辰邦西仪器科技有限公司)、无菌操作台(苏州安泰空气技术有限公司)、电热恒温培养箱(上海精宏实验设备有限公司)、紫外可见分光光度计(尤尼柯上海仪器有限公司)、pH计(上海正慧工贸有限公司)、光学显微镜(上海精宏实验设备有限公司)、便携式色度测定仪(上海海争电子科技有限公司)、多参数水质测定仪(兰州连华环保科技有限公司)。
1.5土壤稀释度的选择
取10g采集的土样，放入90mL水的锥形瓶中，加入2～3颗玻璃珠，常温下150r/min摇床振荡1小时，静置20min后取上清液，即为10-1的土壤悬液，并依次稀释成10-2、10-3、10-4、10-5的土壤悬液，并将各稀释度的土壤悬液吸取100μL涂布于PDA固体培养基(去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然)，每个梯度设置3个平行样，30℃培养3d，发现10-2稀释度下培养基中各菌落分布较为均匀，容易挑出单菌落，因此选10-2稀释度的土壤悬液做后续真菌筛选实验。
1.6腐植酸降解真菌的初筛
将10-2稀释度的PDA固体培养基上的真菌分离纯化，得到13株真菌，将分离出的菌株按照驯化培养基①、驯化培养基②和初筛培养基的顺序进行依次转接筛选培养(驯化培养基：①去皮马铃薯200g，葡萄糖2g，腐植酸0.005g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然；②去皮马铃薯200g，葡萄糖0.2g，腐植酸0.015g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然；初筛培养基：腐植酸0.03g，琼脂20g，水1000mL，pH值自然)，初步筛选得到菌落较大的5株腐植酸降解真菌，依次编号为HA-Z1、HA-Z2、HA-Z3、HA-Z4、HA-Z5。
1.7腐植酸降解真菌的复筛
将HA-Z1、HA-Z2、HA-Z3、HA-Z4、HA-Z5这5株腐植酸降解真菌分别制备成浓度为108CFU/mL孢子菌悬液，按2％(v/v)加入初始浓度为25mg/L，初始pH为7的腐植酸废水中(腐植酸，上海麦克林生化科技有限公司)，150r/min，30℃摇床培养，设置一个对照组，三个平行样，每隔24h测定其UV254的吸光值。在72h时的降解率最高，分别为20.12％，24.41％，35.15％，15.28％，27.18％，因此最终选取降解率在30％以上的HA-Z3，并将后续实验的测定时间定为72h。
1.8腐植酸降解真菌的鉴定
形态观察可知，其菌落在PDA固体培养基上为白色，基质灰褐色，菌丝稀疏，棉絮状。对HA-Z3进行rDNA-ITS测定，其rDNA-ITS序列如SEQ ID No.1所示，通过BLAST比对发现，HA-Z3与Phoma sp.序列的相似度达到了100％，因此，通过HA-Z3的菌落形态观察及rDNA-ITS测定，HA-Z3鉴定为茎点霉属。
实施例2、腐植酸降解真菌HA-Z3的降解特性
2.1腐植酸初始浓度的影响
分别配制浓度为5mg/L、15mg/L、25mg/L、35mg/L、45mg/L、55mg/L的腐植酸废水，调节pH为7，加入2％(v/v)的HA-Z3孢子菌悬液(108CFU/mL)，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254、VIS400、色度和TCOD。结果如图4所示，在腐植酸初始浓度为25mg/L时，HA-Z3对腐植酸降解率达到最高，UV254、VIS400和色度的去除率分别为40.72％、48.32％、54.53％，TCOD的去除率为45.21％。
2.2初始pH的影响
分别配制腐植酸初始浓度为25mg/L，初始pH为3、4、5、6、7、8、9、10的腐植酸废水，分别加入2％(v/v)的HA-Z3孢子菌悬液(108CFU/mL)，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254、VIS400、色度和TCOD(按照《HJ/T399-2007水质化学需氧量的测定-快速消解分光光度法》进行测定)和色度。结果如图5所示，在初始pH为酸性条件下UV254、VIS400和色度的去除率较高，且在初始pH为3时，UV254、VIS400和色度的去除率最高，分别为73.01％、64.71％、89.99％，但TCOD的去除率仅为12.78％。因此在pH为酸性时，UV254、VIS400和色度的高去除率是由于腐植酸在酸性条件下析出所导致，并不是菌株HA-Z3对腐植酸的降解作用。而在初始pH为8时，UV254、VIS400和色度的去除率分别为41.56％、56.32％、62.34％，TCOD的去除率达到最高，为52.41％。因此菌株HA-Z3的腐殖酸降解效果的适宜pH为8。
2.3孢子菌悬液投加量的影响
配制腐植酸初始浓度为25mg/L，初始pH为8的腐植酸废水，分别加入0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％(v/v)的HA-Z3孢子菌悬液(108CFU/mL)，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254、VIS400和色度。如图6所示，在HA-Z3孢子菌悬液投加量为1％(v/v)时，HA-Z3对腐植酸降解率达到最高，UV254、VIS400、色度的去除率分别为52.96％、65.34％、70.32％，TCOD的去除率为57.32％。
实施例3、生物活性炭
由于上述实施例得到的腐植酸降解菌HA-Z3具有优异的腐植酸废水降解效果，因而进一步的实施例中，本发明还提供一种生物活性炭，该生物活性炭包括活性炭及附着在所述活性炭上的腐植酸降解真菌HA-Z3。
3.1生物活性炭的制备：
1)载体的预处理：取1000g的35目活性炭颗粒(石家庄蓝豚环保科技有限公司)置于l mol/L的HCl溶液中，于55℃搅拌1h后除去酸液，用去离子水反复冲洗至洗液pH值为7.0-7.2，然后于105℃烘干待用。
2)孢子菌悬液制备：将HA-Z3的孢子用生理盐水冲洗下来，稀释成108CFU/mL孢子菌悬液，4℃保存备用。
3)生物活性炭制备：将HA-Z3的孢子菌悬液转接至发酵培养基中进行发酵，发酵培养基的配方为葡萄糖100g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母膏0.5g/L，KH2PO4 2g/L，(NH4)2SO4 0.66g/L，Na2HPO4 0.43g/L，MgSO4·7H2O0.25g/L，调节pH值为7.2。在121℃，0.105MPa下，高压蒸汽灭菌30min。并向发酵培养基中加入1％(m/v)的上述经过预处理的活性炭，于37℃，150～190r/min摇床振摇，发酵70～85h，取发酵液滤出活性炭颗粒，用去离子水和无机盐培养基反复洗涤3次，自然风干制得生物活性炭。
3.2生物活性炭的腐植酸降解
配制浓度为25mg/L，pH值为8的腐植酸废水，加入2％(m/v)的上述生物活性炭，于30℃，150r/min摇床培养，72小时测其UV254、VIS400和色度，结果UV254、VIS400、色度的去除率分别为43.11％、51.85％、62.13％，虽然降解效果不及直接使用HA-Z3孢子菌悬液进行处理，但是仍然优于现有技术中使用其他真菌的降解效果，例如使用白腐真菌的降解效果(大约25％左右)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 兰州理工大学
<120> 腐植酸降解真菌HA-Z3及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
cttccgtagg ggtggaacct gcggaaggat cattaccaat atgaaagcgg gtggggagct 60
acagaagtcg gggccctcgt ggctctactt ctgccccatc tgtctgaata ttcacccatg 120
tcttttgcgt acccattgtt tccttggcgg gcttgcccgc caacagggac attgttaaac 180
cttttgtaat tgcagtcagc gtcagaaata acttaatagt tacaactttc aacaacggat 240
ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtagtg tgaattgcag 300
aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ccttggtatt ccatggggca 360
tgcctgttcg agcgtcattt gtaccctcaa gctctgcttg gtgttgggtg tttgtctctt 420
ccgggagact cgcctcaaaa caattggcag ccggcatatt ggtatcggag cgcagcacaa 480
gtcgcgcttc tgtccatatt tgttggcatc cagcaagacc atttttcact cttgacctcg 540
gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaaaa gggcgggagg aa 592

Claims (5)

1.一株腐植酸降解真菌HA-Z3，其特征在于，分类命名为茎点霉(Phoma sp.)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月7日，保藏编号为CGMCC No.22456。
2.一种降解腐植酸废水的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的腐植酸降解真菌HA-Z3配制成108CFU/mL，按照0.5％～6％(v/v)的比例加入至腐植酸废水，并调节pH值为3～10，混合处理72h即可。
3.一种生物活性炭，包括活性炭及附着在所述活性炭上的如权利要求1所述的腐植酸降解真菌HA-Z3。
4.权利要求3所述的生物活性炭的制备方法，包括获得腐植酸降解真菌HA-Z3的孢子菌悬液，将其转接至含有经预处理的活性炭的发酵培养基中发酵后，过滤出活性炭颗粒，经过洗涤和干燥处理，即可得到所述生物活性炭。
5.权利要求1所述的腐植酸降解真菌HA-Z3的应用，所述应用包括制备土壤修复剂、生物有机肥料及生物活性炭中的应用。
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