CN106947697A - 一种拟茎点酶属真菌菌株e41及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物内生菌降解农药技术领域，具体涉及的是一种拟茎点酶属真菌菌株E41及其在降解除草剂二甲四氯中的应用。一种拟茎点酶属真菌菌株E41，其分类学命名为拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41，于2017年01月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60143。本发明的拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41可降解土壤或水体中除草剂二甲四氯，且成本低，易于工业化，具有良好市场前景，同时也具有重要的工业应用价值。

Description

一种拟茎点酶属真菌菌株E41及其应用
技术领域
本发明属于植物内生菌降解农药技术领域，具体涉及的是一种拟茎点酶属真菌菌株E41及其在降解除草剂二甲四氯中的应用。
背景技术
随着中国农业现代化的发展、农业种植业结构的变化、农业经营模式向规模化、产业化、集约化的方向发展和农村劳动力的减少的现状，农业对除草剂的需求将持续增加。与此同时，农业耕作栽培方法的改变也促进除草剂的需求量大增。
除草剂的使用大量提高了作物产量，减轻了农民负担，为农业省力化、机械化生产提供了保障，与此同时，除草剂的使用也对人和环境产生了严重的影响。有研究表明，过量残留在植物体内的除草剂，通过进食，对人造成癌症、白血病、肾坏死和孕妇易流产等多种疾病，同时也会导致动物流产甚至死亡；除草剂在环境中的富集破坏了自然环境，大量土壤和水体均被除草剂污染和破坏，其含量超过安全数值；残留在土壤的除草剂造成后茬作物药害，进而导致减产，其中，严重地区甚至造成绝产，部分地区，因除草剂的使用导致土壤板结不再适宜耕作。
农药降解主要分为非酶促降解和酶促降解，随着大量农药的开发和使用，由化学农药所造成的危害越来越严重，利用自然途径(即非酶促)降解农药已经不足以达到理想结果，通过微生物降解为主要讲解途径的酶促反应降解农药是农药降解的新方法和新技术，研究发现微生物对土壤和水环境中的除草剂、杀虫剂、杀菌剂、杀线虫剂等农药降解起主要作用的，主要降解农药的微生物有真菌、细菌、放线菌和藻类，目前，人们已经分离出大量可以降解农药的有效微生物，例如Huang等对Boletus edulis、Gomphidius viscidu、Laccaria bicolor和Leccinum scabrum等4种白腐真菌的研究表明，这4种真菌具有降解滴滴涕的能力。
植物内生菌是近些年来在国内外迅速受到关注的微生物类群，利用内生菌降解农药的概念更为新颖。其优点在于，内生菌来自于植物，对植物更为安全，不会对植物的生长造成影响；内生菌种类数量庞大，研究表明，所有植物都含有内生菌，而且，不同植物所含有的内生菌不尽相同；内生菌降解机理多样，在长期的自然选择下，内生菌与宿主植物会形成一定的协同作用，通过协同作用可能会产生新机理、新功能和新物质，具有一定的研究价值。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种拟茎点酶属真菌菌株E41，该菌株可用于降解土壤或水体中的除草剂二甲四氯。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
本发明公开了一种拟茎点酶属真菌菌株E41，其分类学命名为拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41，于2017年01月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60143。
本发明还提供了所述的拟茎点酶属真菌菌株E41在降解苯氧羧酸类除草剂中的应用。
本发明还提供了所述的拟茎点酶属真菌菌株E41在降解除草剂二甲四氯中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
(1)本发明首次从自然界中分离筛选出一种可应用于降解土壤或水体中除草剂二甲四氯的新菌株拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41，进一步拓宽了利用微生物降解除草剂的菌种。
(2)本发明的拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41可降解土壤或水体中除草剂二甲四氯，且成本低，易于工业化，具有良好市场前景，同时也具有重要的工业应用价值。
保藏信息说明
拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41，保藏编号为GDMCC No.60143，保藏日期为2017年01月16日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1为E41号降解菌在平板的生长状态。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中所用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1：拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41的分离、筛选和鉴定
1.1 实验材料
无机盐培养基：硝酸铵1g、磷酸氢二钾1.5g、磷酸二氢钾0.5g、结晶硫酸镁0.1g、硫酸亚铁(7水)45.72mg、1L水、琼脂40g。
LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化钠、1L水、琼脂40g。
PDA培养基：200g土豆，20葡萄糖，500-600mL水，煮烂，大概半个小时，过纱布，定容至1升、加琼脂40g。
降解液为无机盐培养基与二甲四氯混合液。
1.2 分离、鉴定方法
本发明的拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41是从广西明阳采样分离筛选得到的，由广东省微生物菌种保藏中心保藏，其保藏编号为GDMCC No.60143，该菌株的分离筛选方法如下：
(1)采样：从广西明阳采集样品；
(2)磨样：将样品根部和茎叶各选取一部分，进行表面消毒并提取内生菌；
(3)培养：讲内生菌提取液在无机盐培养基28℃培养；
(4)纯化：将所得真菌分别转接至PDA培养基培养、纯化，并重复纯化2-3次；
(5)扩大培养：将已纯化的真菌，接入PDA液体培养基中28℃培养，以获得大量菌体进行后续试验。
(6)保存菌种：将已纯化的真菌菌丝及孢子挑入20％甘油，-20℃下保存。
(7)活化：将保存的菌种倒入PDA液体培养基中28℃活化扩大培养；
(8)初筛：将扩大培所得真菌菌丝与拌有农药的无机盐液体培养基混合，28℃培养7天，确定降解情况；
(9)复筛：将扩大培养所得真菌菌丝称重与拌有农药的无机盐液体培养基混合，28℃培养，分别于0，1/4，1/2，1，3，5，7，10，14天取样，确定降解动力学情况；
(10)条件优化：将有效菌进行不同温度、不同pH值、不同底物浓度等降解条件试验，获得其在液体中不同条件下的降解规律；
(11)土壤修复试验：在无机盐培养基中有效的降解菌，将其菌体培养孢子液与带药土壤混合，初步探索其在土壤修复效果；
(12)鉴定：通过对拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41ITS rDNA序列进行扩增，测序得到序列如如SEQ.1所示。测序分析后将获得的序列在NCBI数据库中进行同源性比对。
序列分析结果表明：菌株E41与拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)同源性在99％以上，因此，将该菌株命名为拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41。
实施例2：拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41在降解二甲四氯的效果研究
2.1 降解菌的培养
配制PDB培养基，灭菌，并装于已灭菌的30mL带盖小瓶中，每瓶10mL，用接种环刮取PDA培养基中已纯化的真菌菌丝，分别接入PDA培养基小瓶中，以获得扩大培养菌体，培养条件为28℃下培养3-4d，待用。
2.2 降解菌的筛选
配制降解菌降解试验培养基，分装于灭菌的30mL带盖小瓶，每瓶10mL。将添加水平为0.55g/L(以干重计)扩大培养菌体与已分装的降解菌降解试验培养基混合，混合前用降解菌降解试验培养基清洗3次后与降解试验培养基混合，设置三个平行处理及空白对照，培养条件为28℃下培养7天。
吸取降解液1mL，过水膜，放4℃环境下保存，并进液相色谱检测，确定有效菌株。
2.3 降解真菌降解温度优化试验
处理步骤同2.2，培养温度分别改为20、25、30、35和40℃。确定有效菌株降解最佳温度。
2.4 降解真菌降解pH优化试验
处理步骤同2.2，所用培养基采用50％HCl和1mol/L NaOH，调pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0。确定有效菌株降解最佳pH值。
2.5 降解真菌降解营养源优化试验
处理步骤同2.2，所用培养基分别改为含有淀粉、葡萄糖、蔗糖、酵母提取物、牛肉膏的蛋白胨等碳源或氮源的营养源优化培养基。确定有效菌株降解最佳营养源。
2.6 降解真菌降解降解动力学试验
2.6.1 降解真菌不同底物浓度的降解动力学试验
配制无机盐培养基，分装于灭菌的100mL带盖三角瓶，每瓶30mL。将扩大培养所得真菌菌体与无机盐培养基混合，混合前用无机盐培养基清洗3次后与无机盐培养基混合，降解其实浓度分别设置为25、50和100mg/L，设置三个平行处理，分别于0、1、3、5、7、10和14d取样，每次吸取1mL，过水膜，放4℃环境下保存，并进液相色谱检测，确定降解动力学方程及降解半衰期。
2.6.2 降解真菌不同pH值的降解动力学试验
处理步骤同2.6.1，以50mg/L为研究浓度，培养温度分别改为20、25、30、35和40℃。
2.6.3 降解真菌不同温度的降解动力学试验
处理步骤同2.6.1，以50mg/L为研究浓度，所用培养基采用50％HCl和1mol/LNaOH，调pH为5.0、7.0和9.0。
2.6.4 仪器方法
采用高效液相色谱法检测降解情况，所用仪器为安捷伦液相色谱仪1260配紫外检测器，仪器条件为XDB C18(50mm×4.6mm,1.8μm)色谱柱，流动相为甲醇-水(含0.2％乙酸)＝70：30，检测波长为230nm，流速为1.0mL/min，柱温为室温，进样量为10μL，保留时间为6.7min，所用甲醇为色谱纯。
2.7 结果与分析
2.7.1 E41号降解菌pH优化结果与分析
通过在pH为4、5、6、7、8和9的条件下，28℃下经7d培养，发现，pH在4-9时，E41号降解菌对二甲四氯均有降解效果，见表1。
表1 不同pH下E41号降解菌对二甲四氯降解率
如表1所示，该菌在pH值为4、8和9时降解效果相对较差，分别是65.47、61.34和49.76，而pH值为5、6和7时的降解效果相对较好，分别是87.85、89.21和88.84。综合分析，该菌的降解效果受pH的影响较小，在过酸和过碱的条件下均不利于该菌发挥降解效果，但整体上酸性条件下的降解效果优于中性和碱性条件下的降解效果，该菌在pH值为6时具有最好的降解效果，但与pH值为5和7时的降解效果基本一致，均具有良好的降解效果。空白对照(不加菌体其余处理一致)未降解。
2.7.2 E41号降解菌温度优化结果与分析
通过在20、25、30、35和40℃条件下，pH＝7下经7d培养，发现，温度在20-40℃时E41号降解菌对二甲四氯均有降解效果，见表2。
表2 不同温度下E41号降解菌对二甲四氯降解率
如表2所示，该菌在温度为35和40℃时降解效果相对较差，分别是59.2和30.21，在温度为20℃时次之，降解率为74.19，而温度为25和30℃的降解效果相对较好，分别是80.26和86.89。综合分析，该菌的降解效果受温度影响较大，适当降低温度有助于提高该菌的降解效果，该菌在温度为30℃时具有最好的降解效果。空白对照未降解。
2.7.3 E41号真菌营养源优化结果与分析
通过对淀粉、葡萄糖、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨等碳源或氮源为营养源，28℃和pH＝7下经7d培养，发现，以上六种营养物质作为营养源时E41号降解菌对二甲四氯均有降解效果，见表3。
表3 不同营养源下E41号降解菌对二甲四氯降解率
如表3所示，该菌在营养源为淀粉、牛肉膏、酵母提取物和蛋白胨时降解效果相对较差，分别是59.35、33.63、21.89和24.36，而葡萄糖和蔗糖次之，分别是73.07和65.33，未添加营养源的降解效果最好，其降解率为88.75。综合分析，该菌在不添加营养源处理下的降解效果最好。空白对照未降解。
2.7.4 E41号降解菌降解动力学结果与分析
2.7.4.1 E41号降解菌在不同底物浓度下的降解动力学结果
表4 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(25mg/L-28℃-pH＝7)
表5 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(50mg/L-28℃-pH＝7)
表6 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(100mg/L-28℃-pH＝7)
如表4-6所示，分别以25、50和100mg/L为起始浓度，培养条件在28℃和pH＝7时，经0、1、3、5、7、10和14d采样，确定其降解动力学方程为y＝20.182e-0.369x、y＝63.997e-0.411x和y＝82.818e-0.089x，半衰期为1.9、1.7和7.8。
2.7.4.2 E41号降解菌在不同温度下的降解动力学结果
表7 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(50mg/L-20℃-pH＝7)
表8 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(50mg/L-40℃-pH＝7)
如表7-8所示，以50mg/L为起始浓度，培养条件在分别在20、28和40℃，pH＝7时，经0、1、3、5、7、10和14d采样，确定其降解动力学方程为y＝40.439e-0.153x、y＝63.997e-0.411x和y＝43.446e-0.036x，半衰期为4.5、1.7和19.3。
2.7.5 E41号降解菌在不同pH值下的降解动力学结果
表9 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(50mg/L-28℃-pH＝5)
表10 不同时间下E41号降解菌对二甲四氯降解率(50mg/L-28℃-pH＝9)
如表9-10所示，以50mg/L为起始浓度，培养条件在28℃，pH分别为5、7和9时，经0、1、3、5、7、10和14d采样，确定其降解动力学方程为y＝32.122e-0.227x、y＝63.997e-0.411x和y＝42.186e-0.06x，半衰期为3.0、1.7和11.6。
2.7.6 E41号降解菌降解动力学结果分析
表11 E41号降解菌降解动力学方程统计表
综上所述，随着底物浓度增大，E41号降解菌的降解速率随之减慢，适当降低温度和酸性条件下，对E41号降解菌的降解效果具有一定促进作用，见表11。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一种拟茎点酶属真菌菌株E41及其应用
<130> ZYWS
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 527
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgctggaacg cgccccaggc gcacccagaa accctttgtg aacttatacc ttttgttgcc 60
tcggcgcatg ctggtctcta gtaggcccct caccccggtg aggagaaggc acgccggcgg 120
ccaagttaac tcttgttttt acactgaaac tctgagaaaa aacacaaatg aatcaaaact 180
ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta 240
atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gccctctggt 300
attccggagg gcatgcctgt tcgagcgtca tttcaaccct caagcattgc ttggtgttgg 360
ggcactgcct gtaaaagggc aggccctgaa atctagtggc gagctcgcca ggaccccgag 420
cgtagtagta aaaccctcgc tctggaaggc cctggcggtg ccctgccgtt aaacccccaa 480
cttctgaaaa tttgacctcg gatcaggtag gaatacccgc tgaactt 527

Claims (3)

1.一种拟茎点酶属真菌菌株E41，其分类学命名为拟茎点酶属真菌(Phomopsis sp.)E41，于2017年01月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No.60143。
2.根据权利要求1所述的拟茎点酶属真菌菌株E41在降解苯氧羧酸类除草剂中的应用。
3.根据权利要求1所述的拟茎点酶属真菌菌株E41在降解除草剂二甲四氯中的应用。
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