CN110616179A

CN110616179A - 一株铜绿假单胞菌dgnk-jl2及其应用

Info

Publication number: CN110616179A
Application number: CN201911109914.0A
Authority: CN
Inventors: 胡珊; 梁卫驱; 黄皓; 陈仕丽; 罗华建; 徐匆
Original assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: DONGGUAN RESEARCH CENTER OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2019-12-27
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110616179B

Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DGNK‑JL2，其于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60748。本发明从中药渣堆肥中分离筛选出一株解磷菌，铜绿假单胞菌DGNK‑JL2，并对其进行了鉴定和生防作用的试验，为制备高效生物肥料储备菌株，助力生态农业可持续发展；采用本发明的铜绿假单胞菌DGNK‑JL2最高可将土壤中有效磷含量提升8.6倍，而且本发明的菌株DGNK‑JL2发酵液对辣椒炭疽病和苦瓜枯萎病均有一定的拮抗作用。

Description

一株铜绿假单胞菌DGNK-JL2及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其是一株铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DGNK-JL2及其应用。

背景技术

为高效利用土壤中的“磷库”资源，减少磷肥使用量，减轻由于磷肥使用过多造成的农业污染面源问题和改善土壤。本试验以中药渣堆肥为材料，用有机磷细菌培养基筛选具有溶磷能力的细菌，采用钼锑抗比色法测定发酵液中可溶磷的含量，对溶磷能力最优的解有机磷细菌进行形态学观察、生理生化和16S rDNA鉴定；采用平板对峙法测定解磷细菌对水稻纹枯病、辣椒炭疽病和苦瓜枯萎病的拮抗作用。

磷是植物生长的必需元素之一，它参与了植物生长发育过程中酶系统的活化、碳水化合物的代谢和蛋白质、核酸、磷脂等物质的合成等过程；对植物体新生组织很重要，可以促进根的生长、开花、结果以及种子的形成；可以促进植物体对体内N、K的转化和吸收利用，能增强作物的抗病虫害、抗倒伏、抗旱和抗寒等抗逆能力，从而能提高作物的产量和品质(钟传青，2004；Westheimer，1987)。

我国土壤缺磷的现象严重。土壤缺磷，并不是土壤总磷含量不足，而是指植物可吸收利用的有效磷含量匮乏，土壤中绝大多数的磷都以植物极难吸收的难溶矿物态存在。目前，农业生产中以施入磷肥补充磷元素(曹宁等，2009)。研究表明，中国磷肥的当季利用率仅有5％～25％，导致大量的磷肥残留在土壤中被土壤矿物质吸附成为难溶性磷酸盐，不能被植物吸收利用(Gustafsson et al.,2012；Roberts et al.,2015)。长期施用化学磷肥还易造成磷素磷资源耗竭、环境污染、土壤板结等问题(覃丽金等，2006)，不利于农业的可持续发展。因此，如何转化土壤中的无效磷，提高土壤有效磷的含量，是解决土壤中磷素营养缺乏的有效途径。

解磷微生物(Phosphate solubilizing microorganisms，PSMs)是指能将无效态磷转化为植物可吸收态磷的微生物，通常包括溶磷细菌、真菌和放线菌。除了溶磷作用，解磷微生物对植物还具有促生作用，还能改善因大量施肥而造成的土壤退化等环境问题。因此，解磷微生物的应用成为缓解土壤缺磷问题的有效途径。近年来，解磷微生物的研究及应用已成为国内外土壤肥料及植物营养学界研究的热点之一(秦利均等，2019)。

中药植物以其特殊的药理亦成为解磷菌筛选的研究对象，目前有研究报道主要是在地黄(陈慧等，2007)、当归(江曙等，2008)和连翘(吴伟，2018)等药用植物根际分离获得溶磷菌株，并对其固氮、解钾、产生生长激素和抑病机理等方面进行了有益的探索。对于中成药生产过程中产生的中药渣中解磷微生物筛选未有报道，中药渣包含植物纤维、脂类、蛋白质、多糖、黄酮、生物碱、萜类以及氮、磷、钾等物质，现主要用于生物有机肥的制备。鲁耀雄等(2018)研究中药渣堆肥过程微生物菌群变化，结果表明，堆肥过程中，细菌数量最多，远多于放线菌和真菌的数量。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种可高效解磷的细菌。

为实现上述目的，本申请的发明人通过大量的实验和不懈的探索，最终获得了如下技术方案：

本发明提供了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DGNK-JL2，其于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60748。

本发明的铜绿假单胞菌DGNK-JL2在NA培养基36℃培养24h后进行菌落形态及细胞形态观察，结果显示，菌落呈淡绿色，扁平，湿润，边缘不规则；革兰氏染色反应显微镜观察，结果显示DGNK-JL2为革兰氏阴性杆菌，菌体单个或成双排列。

作为本发明的另一个方面，本发明提供了上述铜绿假单胞菌DGNK-JL2在生物肥料制备中的应用。

作为本发明的又一个方面，本发明提供了一种生物肥料，其中含有上述的铜绿假单胞菌DGNK-JL2。

在一些实施方案中，本发明提供了一种提高土壤中有效磷含量的方法，其包括将上述的生物肥料施放到田间。本申请的发明人经多次试验发现，铜绿假单胞菌DGNK-JL2最高可将土壤中有效磷含量提升8.6倍。

在一些实施方案中，本发明提供了上述铜绿假单胞菌DGNK-JL2在制备抗植物真菌病害的农药中的应用。本申请的发明人经多次试验发现，菌株DGNK-JL2发酵液对辣椒炭疽病和苦瓜枯萎病均有一定的拮抗作用，抑制率分别为51.42％和44.48％。

进一步地，所述植物真菌病害为辣椒炭疽病和/或苦瓜枯萎病。

在一些实施方案中，本发明提供了一种抗植物真菌病害农药，其中含有上述的铜绿假单胞菌DGNK-JL2的发酵液。优选为液体发酵液。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明从中药渣堆肥中分离筛选出一株解磷菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DGNK-JL2，并对其进行了鉴定和生防作用的试验，为制备高效生物肥料储备菌株，助力生态农业可持续发展；

采用本发明的铜绿假单胞菌DGNK-JL2最高可将土壤中有效磷含量提升8.6倍，而且本发明的菌株DGNK-JL2发酵液对辣椒炭疽病和苦瓜枯萎病均有一定的拮抗作用。

附图说明

图1是YP5(即铜绿假单胞菌DGNK-JL2)的菌落形态图；

图2是YP5的细胞形态图(×1000倍)；

图3是YP5 16S rDNA的PCR产物电泳结果图；

图4是基于16S rDNA序列的YP5系统发育进化树；

图5是用于测定YP5发酵液的拮抗作用的平板结果照片。

生物保藏信息

一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DGNK-JL2，已于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60748。

具体实施方式

本发明从中药渣堆肥中分离筛选出一株解磷菌，铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DGNK-JL2(注:在实施例中该菌株标记为YP5)，并对其进行了鉴定和生防作用的试验，为制备高效生物有机肥储备菌株，助力生态农业可持续发展。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1解有机磷细菌的分离

在中药渣堆肥2个月后，取其堆肥处中药药渣，采用三点取样法后混合为1份，用无菌袋密封带回实验室解有机磷菌。

在无菌条件下，称取10g药渣溶于90mL的无菌水充分振荡并梯度稀释成10^－3、10^－4、10^－5倍的药渣悬液，然后每个稀释度各取100μL均匀涂布于解有机磷细菌培养基平板上，37℃倒置培养3d，观察有无溶磷圈。将有溶磷作用的分离物进行平板划线纯化，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养。最后将所获得的纯培养菌株转入终浓度为30％的甘油中并密封保存于-80℃冰箱。

实施例2解有机磷细菌的复筛

采用溶磷圈法，将实施例1所得待测菌株点接于有机磷固体培养基，3次重复，36℃的恒温箱中培养3d，根据透明圈直径(D)与菌落直径(d)的比值(D/d)大小初步确定菌株解有机磷能力的强弱。

实施例3解磷能力的测定

将实施例2筛选菌株接种于20mL高温灭菌的营养肉汤培养基中于36℃150r/min下活化培养1d，作为种子液。用移液枪按2％的接种量吸取种子液加入100mL高温灭菌的蒙金娜卵磷脂培养基中，以不接任何菌液的发酵培养基为空白对照组，每个处理设3个重复，于36℃150r/min下培养5d。发酵液4℃，8000r/min，离心15min后取上清液，利用钼锑抗比色法测定发酵液中的有效含磷量，实验组和对照组可溶性磷含量的差值即为待测菌株解磷量，进行菌株溶磷能力强弱的测定。

实施例4解有机磷细菌的鉴定

对实施例3测得溶磷能力最优的细菌进行形态学观察、生理生化和16S rDNA鉴定；对植物病原真菌的拮抗作用测定。

4.1形态学观察观察解有机磷细菌培养基表面生长菌落的形态、颜色等；挑取幼龄培养物，涂片、革兰氏染色，显微镜下观察菌体形态、大小、革兰氏染色反应，以及芽孢的有无、形态和着生位置等。

4.2API系统鉴定使用法国梅里埃公司生产的API 20NE和API 20E系统对菌株进行生理生化鉴定。

4.3 16S rDNA鉴定

引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。

PCR反应体系25.00μL：10×Taq Buffer 2.50μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.00μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，正、反向引物(10μmol/L)各0.50μL，ddH₂O 16.25μL，3.00μL DNA模板。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 90s，进行30个循环；72℃延伸10min。

PCR结束后电泳检测为阳性的PCR产物送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。将测序结果提交GenBank进行BLAST比对，并选取同属内近缘种的16S rDNA基因序列进行同源性分析，利用MEGA-X构建系统发育进化树。

4.4解有机磷细菌对植物真菌病害的拮抗试验

按荣良燕等(2011)方法，采用平板对峙法测定所有供试菌株与病原真菌的拮抗作用。将保存在PDA斜面上的病原真菌接种到PDA平板上，25℃培养5-7d。细菌接种在LB液体培养基中，36℃、120r/min培养24h，细菌菌液浓度10⁶mg/L备用。再将真菌与细菌同时接种在PDA平板上，平板中心接种真菌，菌饼直径为6mm，距中心2cm处等距离三点接种菌株发酵液(用加液枪将菌液垂直滴在培养基上)，以不接种细菌的真菌平板为对照，每种组合3个重复。26℃培养，观察生长情况，在对照菌落长满平板时，测量真菌距细菌近端的半径。

抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％

实施例2～4的结果与分析

1)解有机磷细菌的筛选及解磷能力测定

利用有机磷细菌培养基对堆肥2个月中药渣处土壤进行解有机磷细菌筛选，挑取其中5株生长速度快，在培养基上具有较大解磷圈的菌株进行划线纯化后分别命名为YP1、YP2、YP3、YP4、YP5。通过溶磷圈法测定各菌株的溶磷作用。测量各菌株透明圈直径的大小，试验结果参见表1，各菌株D/d值在2.26-4.25之间，D/d值最大的菌株是YP5，其余依次为YP5＞YP2＞YP1＞YP4＞YP3。利用钼锑抗比色法测定各菌株发酵上清液中的有效含磷量在23.6-48.43mg/L之间，其中解磷量最大的菌株是YP5(48.43mg/L)，有效含磷量与对照(5.63mg/L)相比增加8.6倍，解磷能力由强及弱依次为YP5＞YP2＞YP1＞YP4＞YP3，此结果与溶磷圈法测定结果一致。

表1解有机磷细菌的筛选结果

2)解有机磷细菌的鉴定

2.1形态学观察结果

解有机磷细菌YP5在NA培养基36℃培养24h后进行菌落形态及细胞形态观察，结果(参见图2)显示，菌落淡绿色，扁平，湿润，边缘不规则；革兰氏染色反应显微镜观察，YP5为革兰氏阴性杆菌，菌体单个或成双排列。

2.2生理生化试验结果解有机磷细菌YP5经API菌种鉴定系统鉴定，从API数据库中获得和该菌种序列相近种、属。鉴定为Pseudomonas aeruginosa(铜绿假单胞菌)，鉴定率为98.9％，其生理生化试验结果如表2所示。将菌株YP5进行16S rDNA鉴定进一步确认。

表2 YP5的生理生化鉴定结果

注：+表示阳性反应；-表示阴性反应。

2.3 16S rDNA鉴定以解磷菌株YP5的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA基因通用引物进行PCR扩增，扩增出的1.5Kb左右长度的DNA片段(参见图3中泳道YP5)。BLAST比对分析发现，YP5(即DGNK-JL2)与铜绿假单胞菌的同源性达100％。为明确菌株之间的亲缘关系及系统地位，利用MEGA-X构建系统发育进化树(参见图4)，同时结合YP5的形态特征及生理生化试验结果，鉴定菌株YP5为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

菌株(即铜绿假单胞菌DGNK-JL2)的16S rDNA测序结果如下：

AGTCGAGCGGATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTACCACGGA

3)解有机磷细菌对植物真菌病害的拮抗作用

采用平板对峙法测定解有机磷细菌YP5对水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病、苦瓜枯萎病的拮抗作用，试验结果表明，菌株YP5液体发酵液对辣椒炭疽病和苦瓜枯萎病均有一定的拮抗作用(参见图5)，抑制率分别为51.42％和44.48％；对水稻纹枯病没有抑制作用。

参考文献：

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[2]Westheimer F H.Why nature chose phosphates[J].Science,1987,235(4793):1173-1178.

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[11]吴伟,张鹏飞,张桂萍等.连翘根际高效解有机磷细菌的筛选鉴定及促生长特性研究[J].西南林业大学学报，2018，38(3):93-100.

[12]鲁耀雄,高鹏,崔新卫等.中药渣堆肥过程中氮素转化及相关微生物菌群变化的研究[J].农业现代化研究,2018,39(3):527-534.

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最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DGNK-JL2，其于2019年8月22日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075，保藏编号为GDMCC NO：60748。

2.权利要求1的铜绿假单胞菌DGNK-JL2在制备生物肥料中的应用。

3.一种生物肥料，其中含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌DGNK-JL2。

4.一种提高土壤中有效磷含量的方法，其包括将权利要求3所述的生物肥料施放到田间。

5.权利要求1的铜绿假单胞菌DGNK-JL2在制备抗植物真菌病害的农药中的应用。

6.权利要求5的应用，其中所述植物真菌病害为辣椒炭疽病和/或苦瓜枯萎病。

7.一种抗植物真菌病害农药，其中含有权利要求1所述的铜绿假单胞菌DGNK-JL2的发酵液。

8.权利要求7的农药，其中所述植物真菌病害为辣椒炭疽病和/或苦瓜枯萎病。