CN105349456B - 一株中华根瘤菌及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株中华根瘤菌及其用途。该中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC No.11376。本发明提供的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCC No.11376具有较高的固氮酶活性，在农作物拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一株中华根瘤菌及其用途。
背景技术
氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，且化学氮肥价格日益上涨，加重了农民负担。化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，同时，不合理施氮已经形成了严重的污染，如水体富营养造成藻类过量繁殖，城市地下水硝酸盐污染威胁饮用水安全造。
大气中富含氮气，部分微生物可以将游离的氮元素转化为可供植物吸收的氮元素。微生物氮肥施入土壤后，利用微生物的生命活动将空气中的惰性氮素转化为作物可直接吸收的离子态氮素，将土壤中难溶的无机物变成可溶性的无机物增加土壤中的有效氮含量；将作物不能从土壤中直接利用的物质转化成可被吸收利用的物质，制造和协助农作物吸收营养，改善作物营养条件，抑制病原菌的活动，增强作物抗病和抗旱能力；土壤中大量微生物的活动使土壤有机质转化形成腐殖质，促进土壤团粒结构的形成，提高土壤肥力，改善土壤理化形状，增强土壤保肥、保水能力，从而提高中药材的产量和品质。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。
菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种，农业生产迫切需要能够高效固氮的生产用菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有固氮作用的细菌。
本发明提供的是中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11376。
本发明的另一个目的是提供中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4的用途，即用于制备菌剂，或者用于制备生物有机肥，或者用于制备植物栽培拌种剂，或者用于制备叶面喷施剂，或者用于制备育苗接种剂。
以上所述中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4的用途中的菌剂，具体可为下述1)- 5)任一的菌剂：
1)用于固氮的菌剂；
2) 产生固氮酶的菌剂；
3) 促进植物生长的菌剂；
4) 改良培肥土壤的菌剂；
5)提高植物抗逆性的菌剂。
该菌剂除包含活性成分的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCC No.11376外，还可包括辅料，如草炭、人畜粪便、各类作物的秸秆等。所述菌剂还可包括载体，所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物载体为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白炭、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物为聚乙烯醇和或聚二醇。所述液体载体为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂为癸烷和或十二烷。所述菌剂中，所述活性成分可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述组合物的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。该菌剂可用于固氮、改良培肥土壤、促进植物生长、提高植物抗逆性、产生固氮酶等。
本发明的具有固氮作用的细菌是从农田作物根际土壤中分离固氮菌，进一步筛选较高固氮酶活性的菌株，最终筛选到高效固氮菌中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4CGMCC No.11376 ，该菌株固氮酶活性达到 208.14（C2H2，nmol h-1 ml-1），高于微生物肥料常用生产菌种圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)1.178，在接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
保藏说明
菌种名称：中华根瘤菌
拉丁名：Sinorhizobium sp.
菌株编号：GO4
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年9月14日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11376
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所使用的培养基如下：
固氮菌富集培养基：蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，质量分数为1%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁（现配）水溶液各1ml，蒸馏水1000ml，pH6.5-7.0。
阿须贝培养基：甘露醇10g，酵母膏0.4g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。
固氮培养基：磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.8g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，氯化铁微量，钼酸钠 微量，酵母提取物0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000ml，pH7.2。
以上均为液体培养基配方，相应的固体培养基在上述基础上添加琼脂15g，半固体培养基为在上述基础上添加琼脂5g。
下述实施例中所用的圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）1.178，公众可从中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心获得该菌株，以重复本申请的实验。
实施例1、中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCC No.11376的分离及鉴定
一、菌种分离纯化
取5g土样（采自甘肃省岷县）放入三角瓶中，加入50ml无菌水，封口后于摇床震荡20min制成混悬液，吸取5ml加入100ml固氮菌富集培养基中，28℃培养，72h后吸取5ml菌液加入100ml固氮菌富集培养基继续培养，重复培养三次后进行单菌落分离。分离采用平板划线法与梯度稀释法：平板划线法即用接种环蘸取菌液在阿须贝固体培养基上进行划线分离；梯度稀释法是将培养后的菌液按照10-2、10-4、10-6、10-8稀释度用无菌水制成菌悬液后，吸取0.1ml在阿须贝固体培养基上均匀涂布。涂布好的平板于28℃静置培养，5-7d后挑取单菌落用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为GO4。
二、菌种鉴定
从以下几个方面对分离纯化得到的GO4菌株进行鉴定。
1.形态学鉴定
将处于对数生长期且菌落大小稳定，上述步骤分离纯化得到的GO4进行单菌落状态观察，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、凸起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。通过生物染色剂染色后进行显微镜镜检。
结果表明，分离纯化后得到的菌株GO4菌落：菌落直径3-4mm，菌落颜色为浅乳白色，菌落半透明，菌落表面湿润、微凸起，菌落边缘整齐。镜检结果菌体为杆状，革兰氏阴性，无芽孢。
2. 16s rDNA 序列同源性分离
常规方法培养上述步骤分离纯化得到的菌株GO4，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27F ： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3
1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3在PCR 扩增仪上进行PCR 反应。反应完成后，取2ulPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR 扩增片段。PCR 产物用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取各个菌种纯化后的PCR 产物，使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。与NCBI GenBank 中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。
PCR基因扩增得到菌株GO4的16s rDNA基因片段约1.3kb，测定序列后与NCBI数据库中已公开的16s rDNA序列进行在线同源性比较，结果显示GO4与中华根瘤菌属Sinorhizobium sp.的同源性最高，达到99%。
菌株GO4的16s rDNA 序列相见序列表中的序列1。
3. 生理生化特征分析
参考《伯杰氏细菌鉴定手册》（R.E.布坎南，N.E.吉本斯.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版).科学出版社，1984.）测定上述菌株GO4的生理生化特征。
所述菌株GO4的生理生化特征测定结果如下：
生长温度：4℃不生长，28℃生长，37℃不生长；
耐盐性实验：0.5% NaCl生长，1% NaCl生长，2% NaCl不生长；
糖发酵实验：葡萄糖阳性，蔗糖阳性，甘露醇阳性，乳糖阳性，纤维素阴性；
水解淀粉实验：阴性；
利用柠檬酸盐：阳性；
水解酪蛋白：阴性；
接触酶反应：阳性；
氧化酶反应：阳性。
4. 生长特性分析
进行了菌株GO4最适pH生长实验。采用阿须贝培养基，以5%接种量接种后调整pH值，分别测定GO4在pH4、pH5、pH6、pH7、pH8条件下培养72h后的活菌数量。
结果表明，GO4在pH7-8的培养条件下单位菌液中的活菌数量最高，达到8.6cfu/ml，最适生长pH为pH7-8。
鉴于上述形态、16s rDNA序列同源性分析、生理生化特征分析结果，将实施例1中分离纯化得到的居住GO4鉴定为细菌域中华根瘤菌属（Sinorhizobium sp.）。该中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4已于2015年9月14日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCCNo.11376。
实施例2、中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCC No.11376的固氮酶活性测试
对实施例1分离纯化得到的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCCNo.11376进行固氮酶活性测试，采用乙炔还原法，具体方法如下所述：制备获得GO4菌株的悬浮液（细胞，1×108ml-1），取1ml接种于盛有5ml半固体阿须贝培养基的血清瓶中， 28℃下培养48h。将血清瓶瓶盖换成橡胶塞，并用无菌注射器抽出10%的气体，然后注入10%乙炔，再在28℃下培养36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。N=hxCV/(24.9hst)。其中N为固氮酶活性，即产生乙炔的浓度（C2H2，nmol h-1 ml-1），hx为样品峰值，C为标准乙烯浓度（nmol ml-1），V为培养容器体积(ml)，24.9为常数，hs为标准乙烯峰值，t为样品培养时间(h)。以固氮培养基培养圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)1.178，以同样的方法测定其固氮酶活性作为参照。以上实验均设三组重复。
结果显示，实施例1中分离纯化得到的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4CGMCC No.11376 的固氮酶活性为208.14（C2H2，nmol h-1 ml-1），而圆褐固氮菌1.178的固氮酶活性仅为124.60（C2H2，nmol h-1 ml-1）。这一结果表明，本发明的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 CGMCC No.11376具有比传统生物固氮肥料中所使用的菌株圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)1.178更高的固氮能力，在拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
<110> 专利申请人 甘肃省科学院生物研究所
<120> 一株中华根瘤菌及其用途
<160> 1
<210> 1
<211> 1349
<212> DNA
<213> 中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4
<400>
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Claims (7)
1.一株固氮酶活性为208.14C2H2，nmol h-1ml-1的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11376。
2.权利要求1所述的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4用于制备菌剂。
3.权利要求1所述的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 用于制备拌种剂。
4.权利要求1所述的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 用于制备生物有机肥。
5.权利要求1所述的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4用于制备育苗接种剂。
6.权利要求1所述的中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4 用于制备叶面喷施剂。
7.权利要求2所述中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.）GO4的用途，其特征在于所述的菌剂为下述1)- 5)任一菌剂：
1) 用于固氮的菌剂；
2) 产生固氮酶的菌剂；
3) 促进植物生长的菌剂；
4) 改良培肥土壤的菌剂；
5) 提高植物抗逆性的菌剂。
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