CN104726365A - 道地黄芪固氮菌新菌株t21及发酵液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9677。本发明详细描述了道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列测定结果等。经固氮试验表明，本发明道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的发酵液对道地黄芪有较好的固氮作用，可以有效地为道地黄芪生长提供天然氮源需要，从而对道地黄芪的天然品质提供相应的营养来源。
Description
技术领域
本发明涉及植物固氮细菌的利用领域，具体地说是涉及一种道地中药黄芪固氮菌t21及发酵液的制备方法。
背景技术
近年来，全球种植业过分依赖和大量施用化肥造成的肥料浪费、土壤和地下水污染以及生态失衡已经引起了世界各国的广泛关注。减少化肥的使用、提高氮肥利用率是当前农业生产中急需解决的重要问题。充分发挥固氮细菌的生物固氮作用是减少氮肥使用量最有效的途径，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。生物固氮是自然界中仅次于光合作用的复杂生物反应系统，为全球的植物提供了大约75%的氮素。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用。
固氮细菌根据其生活习性可分为自身固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌三类。自身固氮菌是指在自由生活状态下能够固氮的细菌，其种类不多，分布很广，如圆褐固氮菌和拜叶林克氏固氮菌。联合固氮菌是指定植于植物根表和近根土壤中，有的能侵入表皮和外皮层的细胞间隙，靠根系分泌物生存、繁衍，与植物根系有密切的关系的固氮细菌，如雀稗固氮菌和产脂固氮螺菌。共生固氮菌的细菌只有根瘤菌一类，其广泛存在于土壤中，浸染豆科植物根部形成根瘤，能将空气中的氮气转化为氨提供给植物。上述三类固氮菌中，自身固氮菌由于其固氮效率低，且固氮特殊，不适合在农业方面广泛应用，所以目前农业方面主要应用联合固氮菌和共生固氮菌。
黄芪（Astragalus membranaceus Bunge）是豆科黄芪属多年生草本植物，又名绵芪。在我国产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用，作为药用已有2000多年的历史。由于长期大量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险。在黄芪种植过程中，各项农资投入中化肥尤其是氮肥所占比重很大，其对黄芪的产量和活性成分聚集的影响也最显著。而黄芪作为豆科植物，其根际土壤中也共生有大量固氮菌，发挥着重要的固氮作用。山西浑源县是中药材黄芪的产地。得益于当地水土，浑源所产黄芪甲甙、多糖等含量均为国内之首，并于2011年获批国家地理标志证明商标“正北芪”。根据浑源道地黄芪的正宗药用性和原产地有用成份这一地理标识产物，以其原生地土壤根瘤菌为研究基础，对道地黄芪的固氮根瘤菌进行分离，筛选和鉴定，并对其培养条件和生理生化以及生物信息学方面进行研究。该研究为利用生物固氮在黄芪生产上实现节肥减耗、加强黄芪种植业生态系统的良性循环提供科学基础和技术支持。发明内容
本发明的目的是提供一株道地黄芪固氮菌t21及发酵液的制备方法，该发酵液具有非常明显的固氮作用。
本发明的技术方案如下：
一株道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）t21菌株于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.），保藏号为CGMCC No. 9677，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
所述的道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21是从山西省浑源地区的黄芪生长土壤为材料分离得到的根瘤细菌。
将道地黄芪固氮菌新菌株t21在Ashby无氮培养基培养，菌落形态呈圆形，无色透明（见图1）。在YMA固体培养基上(由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养平板)生长较快，菌落成粘稠状易流动。革兰氏染色，显示新菌株t21为革兰氏阴性杆菌，无芽孢（见图2）；苏丹黑B染色呈阳性，可见菌体内有黑色着色点，为菌体内的PHB颗粒(见图3)；孔雀绿染色呈阴性，提示B图中的着色点不是细胞内芽胞所致(见图4)。根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株t21进行了生理生化鉴定，其特征见表1。
表1 菌株t21的生理生化特征
注：＋表示呈阳性反应；－表示呈阴性反应.
提取黄芪固氮菌新菌株t21的基因组DNA，利用PCR反应扩增其16S rRNA部分序列，得到一条约为1500bp左右的DNA片段（图5）。测序后获得序列长度为1311bp（见表2），测序结果使用BLAST软件在GeneBank数据库中进行同源性比对，结果显示，新菌株t21与Sinorhizobium sp. SCAUS141的16S rRNA基因序列同源性为99%（KF836038），结合形态观察及生理生化试验，将新菌株t21确定为中华根瘤菌Sinorhizobium sp.。
表2 本发明新菌株t21的16S测序结果
道地黄芪固氮菌新菌株t21发酵液的制备方法，包括如下步骤：
(1) 种子液制备 从试管斜面上用接种针挑取菌株t21到斜面培养基(由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养斜面)上，恒温28℃培养24h后接种到装有100mL的 LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得道地黄芪固氮菌新菌株t21的种子液；
(2) 发酵液制备 将道地黄芪固氮菌新菌株t21的种子液按照1%的比例接入YMA液体培养基，培养条件是：28℃、初始pH为6.8～7.0、摇床转速180－200r/min震荡培养30h，制得道地黄芪新菌株t21的发酵液。
所述的发酵培养基是由下列质量/体积份的原料组成：YMA液体培养基：甘露醇14份，酵母粉5份，MgSO4·7H2O 0.1份, K2HPO4 0.3-0.4份, NaCl 0.3-0.4份，CaCl2 0.01份，H2O 1000份，所配得的培养基pH 6.8～7.0。
将上述制备的道地黄芪固氮新菌株t21的发酵液进行固氮效果试验
1.试验方法
供试黄芪种子由山西浑源县黄芪种植基地提供。采用全N差值法来测定菌株的固氮能力。将道地黄芪固氮新菌株t21接种到100ml YMA液体培养基中，28℃摇瓶培养后，用血球计数板计数，用去离子水稀释，获得含菌量为106ml-1、107 ml-1、108 ml-1的菌剂。将洗净灭菌的蛭石(粒径为2mm)放入直径8cm、高10cm塑料盆中，作为无氮培养场地。试验分3个处理和1个对照共四组，每组5个样品盆，重复三次，随机排列。各处理组的黄芪种子用上述三个浓度的菌液浸泡3h，对照用去离子水代替。然后将种子播种到装有蛭石的塑料盆中，并把上述菌剂各30ml加入到相应的盆中，在山西农业大学生科院实验室内进行培养。每天浇水30ml，生长一个月后，收获黄芪苗，观察整体形态。小心收集幼苗全株，每组收集100株，洗净后置于烤箱内烘干，测定黄芪苗的含氮量(鲍士旦，2000)。
2.试验结果
(1)黄芪苗高及叶片数试验结果见表3。
表3 黄芪固氮新菌株t21发酵液处理黄芪种子后对黄芪苗的影响
| 组别 | Ck | 106 | 107 | 108 |
| 平均苗高(cm) | 11.8±1.83 | 18±2.72* | 16.5±1.2** | 19.4±2.97** |
| 平均叶数(片/株) | 5.7±1.42 | 10.2±1.08** | 9.9±1.5** | 10.2±2.04** |
注： **跟Ck相比较P<0.01
试验结果表明，用本发明的黄芪固氮新菌株t21的发酵液处理黄芪种子后，对黄芪幼苗生长速度和叶片发育速度均有显著的促进作用，培养30d 后黄芪的苗高和叶片数均显著高于对照（见图6-9），其中含菌量在108ml-1这一浓度处理后的效果要优于另外两个较高浓度的效果。这也表明，在用t21菌液处理种子时，适当提高浓度效果可能更佳。
(2)黄芪苗含氮量试验结果见表4。
表4 黄芪固氮新菌株t21发酵液处理黄芪种子后对黄芪苗的含氮量的影响（mg/株）
| 组别 | Ck | 106 | 107 | 108 |
| 含氮量 | 57.17±0.108 | 67.9±0.5246** | 64.66±1.0706** | 66.68±0.9379** |
注：**跟Ck相比较P<0.01
该结果显示，用t21菌剂处理后的黄芪苗含氮量要显著高于对照组，表明t21具有显著的固氮活性。培养30天后，平均每株黄芪苗的固氮量为7.5-10.7mg左右。根据实际种植情况，每亩地种植15000株幼苗，每公顷的固氮量为0.01*15000*15≈2250g，即t21菌剂在30天的固氮值为2.25kg/km2左右。相当在黄芪栽培地里，每个月可以减少尿素用量5公斤（按照尿素含氮量46%计算），而随着黄芪根茎的延长，根瘤数量也会更多，固氮值还会增加，这能为种植户减少很大一笔支出。
本发明的有益效果
(1) 用本发明的道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，制备出发酵液稀释为108ml-1浓度的菌剂处理黄芪种子后，黄芪苗高和叶片数显著高于对照组(P＜0.01)，固氮效率相当于每公顷每月固氮量在2.5kg以上，表明道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21在黄芪的生长过程中具有非常显著的固氮作用。（2）本发明的道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的菌株发酵条件方便，菌种容易保存，菌剂制备过程简单，容易实现工业化生产。
附图说明
图1为本发明新菌株t21的菌落形态。
图2为本发明新菌株t21革兰氏染色的形态（100×）。
图3为本发明新菌株t21孔雀绿染色后的细胞形态（100×）。
图4为本发明新菌株t21苏丹黑B染色后的细胞形态（100×）。
图5为本发明新菌株t21的16S rRNA扩增结果。
图6为去离子水处理黄芪种子后培养30天黄芪幼苗的生长情况。
图7为本发明新菌株t21发酵液浓度106ml-1处理黄芪种子后培养30天黄芪幼苗的生长情况。
图8为本发明新菌株t21发酵液浓度107ml-1处理黄芪种子后培养30天黄芪幼苗的生长情况。
图9为本发明新菌株t21发酵液浓度108ml-1处理黄芪种子后培养30天黄芪幼苗的生长情况。
具体实施方式
实施例1
一株道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为中华根瘤菌（Sinorhizobium sp.），保藏号为CGMCC No. 9677，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明的道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21是从山西省浑源地区的黄芪生长土壤为材料分离得到。将道地黄芪固氮菌新菌株t21在Ashby无氮培养基培养，菌落形态呈圆形，无色透明（见图1）。在YMA固体培养基上(由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养平板)生长较快，菌落成粘稠状易流动。革兰氏染色，显示新菌株t21为革兰氏阴性杆菌，无芽孢（见图2）；苏丹黑B染色呈阳性，可见菌体内有黑色着色点，为菌体内的PHB颗粒(见图3)；孔雀绿染色呈阴性，提示B图中的着色点不是细胞内芽胞所致(见图4)。根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株t21进行了生理生化鉴定，其特征见表1。
提取黄芪固氮菌新菌株t21的基因组DNA，利用PCR反应扩增其16S rRNA部分序列，得到一条约为1500bp左右的DNA片段（图5）。测序后获得序列长度为1311bp（见表2），测序结果使用BLAST软件在GeneBank数据库中进行同源性比对，结果显示，新菌株t21与Sinorhizobium sp. SCAUS141的16S rRNA基因序列同源性为99%（KF836038），结合形态观察及生理生化试验，将新菌株t21确定为中华根瘤菌Sinorhizobium sp.。
实施例2
本发明的道地黄芪固氮菌新菌株t21发酵液的制备方法，包括如下步骤：
(1) 种子液制备 从试管斜面上用接种针挑取菌株t21到斜面培养基(由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养斜面)上，恒温28℃培养24h后接种到装有100mL的 LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得道地黄芪固氮菌新菌株t21的种子液；
(2) 发酵液制备 将道地黄芪固氮菌新菌株t21的种子液按照1%的比例接入YMA液体培养基，培养条件是：28℃、初始pH为6.8～7.0、摇床转速180－200r/min震荡培养30h，制得道地黄芪新菌株t21的发酵液。
所述的发酵培养基是由下列质量/体积份的原料组成：YMA液体培养基：甘露醇14份，酵母粉5份，MgSO4·7H2O 0.1份, K2HPO4 0.3-0.4份, NaCl 0.3-0.4份，CaCl2 0.01份，H2O 1000份，所配得的培养基pH 6.8～7.0。
用本发明新菌株t21发酵液浓度108ml-1处理黄芪种子后培养30天后，黄芪苗高和叶片数显著高于对照组(P＜0.01)，固氮效率相当于每公顷每月固氮量在2.25kg以上。
Claims (5)
1.一株道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9677。
2.根据权利要求1所述的道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，其特征在于，道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21是从山西省大同市浑源县黄芪基地土壤中分离得到的细菌；将道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）t21在YMA培养基上生长较快，菌成粘稠状易流动，革兰氏阴性，菌体呈短杆状，无芽孢，有PHB颗粒；根据《常见细菌系统鉴定手册》对菌株t21进行了生理生化鉴定，结果如下表所示：
本发明新菌株t21的生理生化特征
注：＋表示呈阳性反应；－表示呈阴性反应.
提取新菌株t21的DNA，经PCR反应扩增其16S rRNA序列，测序后获得序列1309bp，将其序列在NCBI网站Blast比对， t21菌株与Sinorhizobium sp. SCAUS141的16S rRNA基因序列同源性为99%（KF836038），结合形态观察及生理生化试验，确定新菌株t21为Sinorhizobium sp.。
3.根据权利要求1所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21，其发酵液的制备方法包括如下步骤：
(1) 种子液制备 从试管斜面上用接种针挑取菌株t21到斜面培养基上，恒温28℃培养24h后接种到装有100mL的 LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得道地黄芪固氮菌新菌株t21的种子液；
(2) 发酵液制备 将解淀粉芽孢杆菌新菌株t21的种子液按照1%的比例接入发酵培养基，培养条件是：28℃、初始pH为6.8～7.0、摇床转速180－200r/min震荡培养30h，制得道地黄芪新菌株t21的发酵液。
4.根据权利要求3所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21发酵液的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基是由下列质量/体积份的原料组成：YMA液体培养基：甘露醇14份，酵母粉5份，MgSO4·7H2O 0.1份, K2HPO4 0.3-0.4份, NaCl 0.3-0.4份，CaCl2 0.01份，H2O 1000份，所配得的培养基pH 6.8～7.0。
5.根据权利要求1所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21的使用的方法是：将含菌浓度为108ml-1的发酵液浸种3h后播种。
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