CN105907399B - 一种镉污染修复剂及其与植物联合修复农田土壤中的应用 - Google Patents

Abstract

一种镉污染修复剂及其与植物联合修复农田土壤中的应用，所述复合菌剂由紫金牛叶杆菌和里氏木霉组成。本发明修复剂联合紫花苜蓿处理污染土壤，显著提高镉污染农田土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进作用；修复剂施用方法简单，同时可提高土壤微生物生物量，改善土壤的微生态环境；环境友好，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。

Description

一种镉污染修复剂及其与植物联合修复农田土壤中的应用

技术领域

本发明涉及镉污染农田土壤的修复方法，具体涉及一种复合菌剂联合紫花苜蓿在镉污染农田土壤修复中的应用。

背景技术

镉(Cd)是毒性最强的污染物之一，土壤和水体中普遍存在Cd污染，且可通过食物链积累和富集而使毒性增加进入人体，给人体健康带来严重的威胁。近年来，由于工业“三废”的排放，以及不合理的农业管理措施，导致土壤中Cd污染日益严重，造成农产品的质量和品质下降。因此，Cd污染农田土壤的治理和修复引起人们的广泛关注。目前，重金属污染土壤治理技术主要有土壤淋洗、动电修复、填埋和固定稳定化，而这些技术的费用较高，而植物修复技术因具有费用低廉、无二次污染且具有良好的生态效应而被普遍关注。紫花苜蓿因根系发达、生物量大且对Cd有一定的富集作用，可用于重金属污染土壤的修复。为进一步提高植物修复效率，采用植物和微生物联合修复的手段，提高紫花苜蓿对Cd污染土壤的修复效率。研究表明，微生物的代谢过程或其代谢产物可改变根际土壤重金属的生物有效性，植物的根系分泌物可被微生物代谢利用，促进了微生物的生长，有利于提高植物-微生物联合修复的效率。土壤中的重金属因其复合化和多元化很难被微生物降解，有研究报道，木霉属作为一种优良的微生物资源，可强化伴矿景天修复Cd污染土壤；紫金牛叶杆菌是一种根际促生菌，该菌具有较强的重金属抗耐性和吸附能力，可以显著地促进植物的生长，降低重金属对植物的毒性，同时提高土壤中重金属的植物有效性。然而互相不抗拒、共生共存的不同微生物组成的复合菌剂将提高植物修复重金属污染的效率，由于寻找合适的微生物与植物组合存在诸多不确定，并且需要大量的实验摸索，因此现有技术中还没有能够有效活化土壤中Cd的复合微生物菌剂。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种修复剂联合紫花苜蓿在农田镉污染土壤修复中的应用。为进一步强化紫花苜蓿对镉污染土壤的修复效果，寻找一种修复剂与紫花苜蓿联合修复的方式，提高植物对镉的提取效率，以期尽快恢复农田土壤的生产能力。

技术方案：一种镉污染修复剂，为复合肥与复合菌剂的混合物，所述复合菌剂由紫金牛叶杆菌和里氏木霉组成。紫金牛叶杆菌(Phyllobacterium myrsinacearum)，其微生物保藏号为：CGMCC NO.6621，保藏日期为2008年7月3日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；里氏木霉(Trichoderma reesei)，其微生物保藏号为：CGMCCNO.3970，保藏日期为2010年7月1日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

上述菌剂与复合肥的质量比为5:3。

上述菌剂中紫金牛叶杆菌和里氏木霉的质量比为3:4。

上述复合肥为氮肥(Ca(NO₃)₂):磷肥(Ca₃(PO₄)₂-CaSiO₃-MgSiO₃):钾肥(KCl)按照质量比3:3:4的比例混合而成。

上述镉污染修复剂与紫花苜蓿联合修复农田土壤中的应用。

具体修复步骤为：将复合菌剂和复合肥混匀得修复剂，过10目筛后的土壤和上述修复剂拌匀装入盆中，催芽后的紫花苜蓿种子撒播于土壤中，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的60％，植物生长90-100d后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。

所述修复剂占待修复土壤鲜重的0.16％。

有益效果：(1)修复剂联合紫花苜蓿处理污染土壤，显著提高镉污染农田土壤的修复效率，微生物与植物之间存在协同促进作用；(2)修复剂施用方法简单，同时可提高土壤微生物生物量，改善土壤的微生态环境；(3)环境友好，具有良好的生态效应，适用于镉污染农田的修复。

附图说明

图1为紫花苜蓿生物量变化(干重)示意图；

图2为不同处理紫花苜蓿地上部和根部Cd含量示意图；

图3为紫花苜蓿的积累量和Cd提取效率示意图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述：

1材料与方法

1.1供试土壤

采自湖南石门雄黄矿区周边农田土壤，其基本理化性质为：pH5.16(H₂O)，有机质24.8g/kg，速效磷17.5mg/kg，速效钾96.7mg/kg，碱解氮118mg/kg。土壤样品自然风干后过2mm筛，以供盆栽模拟试验用。

1.2供试植物

紫花苜蓿，品种为南全，购于江苏省农业科学院。

1.3供试菌剂

紫金牛叶杆菌保藏号为CGMCC NO.6621；里氏木霉保藏号为CGMCC NO.3970；均可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得。

1.4供试复合肥

氮肥(Ca(NO₃)₂)：钙镁磷肥(Ca₃(PO₄)₂-CaSiO₃-MgSiO₃)：钾肥(KCl)按照质量比3:3:4的比例混合而成。

1.5修复剂的制备

A紫金牛叶杆菌斜面培养基的制备及菌种的培养：

a.琼脂斜面培养基的制备：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、琼脂粉20g、无菌水1000mL，加热溶解后，用1mol/L的氢氧化钠调pH值为7.0-7.2，经121℃蒸汽高压锅灭菌20min，然后在无菌条件下分装于干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.紫金牛叶杆菌种的培养：取紫金牛叶杆菌的母种琼脂斜面菌，在无菌条件下，转种于上述制备的琼脂斜面培养基上，经28℃-32℃、32-48h，即得琼脂斜面菌种，为紫金牛叶杆菌一级菌种；

c.液体培养基的制备：酵母膏5g、蛋白胨10g、NaCl 10g、无菌水1000mL，用1mol/L的氢氧化钠调pH值为7.0-7.2，分装于500mL三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经121℃蒸汽高压锅灭菌20min，冷却后备用；

d.取紫金牛叶杆菌的一级菌种，在无菌条件下，接种于液体培养液中，经28℃-32℃、24-48h，其营养液为二级菌种；

e.取紫金牛叶杆菌的二级菌种再扩大培养，上摇床振荡培养，经振幅100-120r/min、温度28℃-32℃、18-24h培养，其菌液为三级菌种。将紫金牛叶杆菌三级菌种和灭菌后的麦麸按照1:1(ml:g)比例混匀，为固体菌剂。

B里氏木霉FS10-C固体菌剂制备：

a.琼脂斜面培养基的制备:采用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，称取去皮马铃薯切块200g，加水1000mL煮沸半小时后取上清液，向其中加入20g蔗糖，18g琼脂，用去离子水溶解至1000mL，经121℃蒸汽高压锅灭菌20min，然后在无菌条件下分装于干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；

b.液体培养基的制备：马铃薯蔗糖培养基(PDA)，组成同上，不加琼脂；

c.种子液的制备:取里氏木霉的菌种在PDA斜面上进行活化，28℃-32℃培养，约7d后长出孢子；用无菌水将孢子洗下后接种于PDA的液体培养基中，于28℃、150-180r/min的恒温摇床上培养3d，即为木霉种子液。

d.将里氏木霉种子液接入转轴式固体发酵罐中，通气量设为20-30L/min，压力为0.03-0.05Mpa，桔子麦麸质量比为1:1，微生物接种量为5％，发酵培养8-10d后，产孢量可达到1.44×10¹⁰CFU/g，制成里氏木霉固体菌剂。

C.将紫金牛叶杆菌固体菌剂和里氏木霉固体菌剂按照3:4的质量比例混匀，制成复合菌剂。

D.将固体菌剂和复合肥按照5:3的质量比例施于待修复土壤中，制成修复剂。

1.6盆栽试验实施

每盆装供试土壤1.5kg(风干基)，共设置13个处理(见表1)，每个处理3次重复，随机排列，每天浇适量去离子水，保持含水量为最大田间持水量的60％左右。复合肥用量分别为：0、0.15、0.3、0.6g/kg，复合菌剂用量分别为：0、0.5、1.0、2.0g/kg。植物生长90天后，分别采集土壤样品和植物样品。土壤样品经过冷冻干燥后过100目筛，以供Cd含量测试；植物样品采集后，用去离子水洗净，分成根和地上部两部分，75℃烘干称重，粉碎待测。

表1盆栽试验处理方案

1.7植物及土壤样品

植物样品用H₂O₂-HNO₃(优级纯2mL:6mL)的混合酸液高压罐消煮，土壤样品用HCl-HNO₃(优级纯5mL:5mL)混合酸液高压罐消煮。上述重金属含量均用石墨炉原子吸收分光光度计(Varian SpectrAA-220FS)进行测定。

1.8土壤pH

用去离子水浸提，1:2.5的水土质量比提取后用pH电极测定。

2研究结果

2.1修复剂对紫花苜蓿生物量的影响

根据1.6所述的盆栽试验，图1为收获时紫花苜蓿的生物量，从图中可以看出，施用修复剂后，紫花苜蓿生物量(以干重计)显著增加(p<0.05)。与不施用修复剂的对照组相比，不同处理组的紫花苜蓿地上部生物量是对照组的1.18-1.58倍。其中施用复合肥0.6g/kg和复合菌剂1g/kg(即复合肥90kg/亩和复合菌剂150kg/亩)的处理组植物的生物量最大，达到9.99g/pot，较对照组提高57.6％。施用不同剂量修复剂处理组间，植物生物量无明显差别，但随着施用修复剂的增大，其生物量有增大的趋势，表明修复剂可以促进紫花苜蓿的生长。

2.2修复剂对紫花苜蓿地上部和根部镉含量的影响

从图2可以看出，与对照组相比，施用修复剂的处理组紫花苜蓿地上部和根部Cd含量显著增加(P<0.05)，比对照组增加了27.6％-164％。其中，施用复合肥0.6g/kg和复合菌剂1g/kg(复合肥90kg/亩和复合菌剂150kg/亩)的处理，紫花苜蓿地上部和根部Cd含量最高，分别为3.03mg/kg和3.88mg/kg，是对照组的2.64倍和2.26倍。施用复合肥后，紫花苜蓿地上部和根部Cd含量均先增加后减小，即复合肥可以在一定程度上促进紫花苜蓿对Cd的吸收，但随着其量的增加，复合肥中的钙镁磷肥对Cd的抑制效果开始显现处理。不同剂量复合菌剂可以促进紫花苜蓿对Cd的吸收，其中用量为1.0g/kg(150kg/亩)的处理紫花苜蓿地上部和根部的Cd含量最高。复合菌剂中的微生物可以通过自身作用改变土壤中Cd的化学形态，提高其活性，促进紫花苜蓿对Cd的吸收。

2.3修复剂对紫花苜蓿提取效率的影响

从图3中可以看出，施用修复剂处理的紫花苜蓿中Cd的积累量显著高于对照组(p<0.05)，为25.89-66.26μg/pot，为对照组的1.4-3.7倍。其中施用复合肥0.6g/kg和复合菌剂1g/kg(复合肥90kg/亩和复合菌剂150kg/亩)的处理紫花苜蓿Cd的积累量达到最大。

植物积累的重金属总量与污染土壤中重金属总量的比值直接反映了植物修复的效果和应用潜力。植物提取修复效率＝植物中重金属积累量/(每盆土壤重量×修复前土壤重金属浓度)×100％。从图3可以看出，与对照组相比，施用修复剂处理的紫花苜蓿Cd的提取效率显著提高，其中施用修复剂(复合肥0.6g/kg和复合菌剂1g/kg)提取效率达到最大，为9.69％。可见，修复剂极大促进了紫花苜蓿对Cd的积累和吸收。

Claims (3)

1.镉污染修复剂与紫花苜蓿联合修复农田土壤中的应用，所述镉污染修复剂为复合肥与复合菌剂按质量比5:3的混合物，所述复合菌剂由紫金牛叶杆菌和里氏木霉按质量比3:4组成；所述复合肥为氮肥Ca(NO₃)₂:磷肥Ca₃(PO₄)₂-CaSiO₃-MgSiO₃:钾肥KCl按照质量比3:3:4的比例混合而成。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于修复步骤为：将复合菌剂和复合肥混匀得修复剂，过10目筛后的土壤和上述修复剂拌匀装入盆中，催芽后的紫花苜蓿种子撒播于土壤中，修复过程中，保持土壤含水量为最大田间持水量的60%，植物生长90-100d后，沿土面剪取植株，即完成一次修复过程。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述修复剂占待修复土壤鲜重的0.16%。