CN105251763A - 一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法 - Google Patents

一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法。通过对紫花苜蓿种子预处理，将植物发芽周期缩短2-3天，增强了植物对PAHs土壤的耐受性，提高了植物对土壤的修复能力。且在紫花苜蓿-木霉菌-根瘤菌联合修复体系中,利用木霉菌与根瘤菌之间产生协同作用促进紫花苜蓿对污染土壤中PAHs的降解。同时也改变了紫花苜蓿根际土壤微生物群体水平的生理轮廓,恢复土壤微生物生态功能多样性和稳定性，改善农作物的生长环境，提高农作物的质量和产量，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法
技术领域
本发明涉及污染土壤的生物修复技术，特别涉及一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法。
背景技术
多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一类由两个或两个以上的苯环以线状、角状和簇状稠合在一起而成碳氢化合物。具有细胞毒性、遗传毒性、免疫毒性、致畸性和致癌性。近年来越来越引起人们的广泛关注。随着现代城市化进程的加速、石油、煤炭等能源的大规模开发使用，多环芳烃(PAHs)的污染也越来越严重，加至许多工厂三废净化处理系统不完善，导致工业废水流入大面积耕地之中，造成多环芳烃等各种致癌物质土壤残留量超标，过量的PAHs在土壤中的残留，不仅影响土壤的正常功能、降低土壤质量，更重要的是PAHs进入土壤后由于其稳定的化学结构和低溶解性与憎水性，很难通过光、氧及微生物等自然环境进行降解，因此很容易通过生物链进入生态系统，并且具有积累效应，严重危及人体健康和生态安全。目前土壤污染的修复措施一般有：物理修复，化学修复、生物修复、植物修复、微生物-植物联合修复。化学修复是向土壤中注入表面活性剂，提高PAHs等多环芳烃的流动性而迁出土壤或形成有机粘土提高污染物的滞留性和稳定性，降低其迁移进入生态环境的能力，但化学修复易造成地下水等环境的二次污染，成本高，难以根治等。微生物修复是利用筛选、驯化的有针对性的微生物降解土壤中的多环芳烃，但是容易和本土微生物进行竞争，有潜在的生态风险，且针对性强，适用面不广。植物修复是选用具有超富集的植物，一方面利用植物根际的作用促进微生物分解多环芳烃，另一方面植物直接吸收多环芳烃，该方法经济实用，并可改善生态环境，但单纯的植物修复对PAHs污染土壤的修复效率难以一步到位。利用单一豆科植物～微生物联合修复土壤是目前研究的热点之一。专利CN200510038453.4提出在污染土壤上种植豆科植物的同时，接种根瘤菌与丛枝菌根真菌，促进土壤中多氯联苯等多环芳烃的降解能力，但是没有提出如何缩短植物生长周期的方法，使得土壤修复效率降低。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法。该方法提高了紫花苜蓿对土壤中PAHs的降解率，降低了修复成本，缩短了紫花苜蓿生长周期且操作简便，适用于大规模推广应用。
本发明采用的技术方案如下：
1、紫花苜蓿种子预处理：净选饱满、无虫蛀、无霉变的紫花苜蓿种子，浸泡于75％无水乙醇0.5～1min，取出后置于0.1mol/LHgCl2溶液中浸泡20～30min,后用灭菌水漂洗5～6遍，用纱布吸干表面水分后转入培养皿中室温下催芽培养；
2、木霉菌孢子悬浮液的制备：将木霉菌菌种接种于种子培养基中，于28℃条件下培养4～5d,产生大量孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml孢子悬液；
3、根瘤菌悬液的制备：将苜蓿根瘤菌接种于琼脂培养基中，于25℃条件下培养30～60h,产生孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml菌悬液；
4、复合菌剂的制备：将步骤2与步骤3分别制得的木霉菌孢子悬液、根瘤菌悬液按10％的接种量接种于同一固体培养基中，于28～30℃条件下培养72h；即得复合菌剂。
进一步，所述的木霉菌菌种为：木霉菌T30(Trichodermakoningii)。
进一步，所述的根瘤菌菌种为：中国农业微生物菌种保藏管理中心(中国农业科学院农业资源与农业区划研究院)提供的苜蓿根瘤菌ACCC17676
进一步，所述的高糖培养基原料组成份数为：酒石酸铵1.5～2份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾1～2份、硫酸镁1～2份、三氯化铁0.01～0.05份、马铃薯50～100份、琼脂10～50份、麸皮1～10份、玉米汁1～10份、蛋白胨1～5份，蒸馏水1000ml、pH为7.0。
进一步，所述的琼脂培养基原料组成份数为：400mg/L硝酸稀土溶液1～5ml、甘露醇1.0～5.0份，酵母膏0.8～1.0份，磷酸氢二钾0.5～1.0份，硫酸镁0.2～0.5份，氯化钠0.1～0.5份，硫酸钙0.2～0.5份，1％钼酸钠溶液1～5mL，1％硫酸锰1～5mL，琼脂18～20份，蒸馏水1000mL，pH为7.0。
进一步，所述的固体培养基原料组成份数为：麦麸1～5份、橘皮1～5份、
玉米秸秆粉1～5份、维生素C0.1～0.5份、维生素A0.1～0.5份，蒸馏水50～100ml,pH为7.0。
进一步，所述的复合菌剂添加量每公顷15～20kg。
一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法：将催芽的紫花苜蓿种子播种于多环芳烃污染的土壤中，待种子发芽时，将复合菌剂单施于紫花苜蓿根部，土壤水分维持在田间持水量的60％～70％，培养90天其它田间管理措施如：修剪、浇水、除草、施肥等均一致。
本发明的有益效果如下：通过对紫花苜蓿种子预处理，将植物发芽周期缩短2-3天，增强了植物对PAHs土壤的耐受性，提高了植物对土壤的修复能力。且在紫花苜蓿-木霉菌-根瘤菌联合修复体系中,利用木霉菌与根瘤菌之间产生协同作用促进紫花苜蓿对污染土壤中PAHs的降解。同时也改变了紫花苜蓿根际土壤微生物群体水平的生理轮廓,恢复土壤微生物生态功能多样性和稳定性，改善农作物的生长环境，提高农作物的质量和产量，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、紫花苜蓿种子预处理：净选饱满、无虫蛀、无霉变的紫花苜蓿种子，浸泡于75％无水乙醇0.5min，取出后置于0.1mol/LHgCl2溶液中浸泡20min,后用灭菌水漂洗5遍，纱布吸干表面水分后转入培养皿中室温下催芽培养；
2、木霉菌孢子悬浮液的制备：将木霉菌T30(Trichodermakoningii)菌种接种于高糖培养基中，所述的高糖培养基原料组成份数为：酒石酸铵1.5份、葡萄糖20份、磷酸二氢钾1.0份、硫酸镁1.0份、三氯化铁0.01份、马铃薯50份、琼脂10份、麸皮1.0份、玉米汁1.0份、蛋白胨1.0份，蒸馏水1000ml、pH为7.0。于28℃条件下培养4d,产生大量孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml孢子悬液；
3、根瘤菌悬液的制备：将苜蓿根瘤菌接种于琼脂培养基中，所述的琼脂培养基原料组成份数为:400mg/L硝酸稀土溶液1.0ml、甘露醇1.0份，酵母膏0.8份，磷酸氢二钾0.5份，硫酸镁0.2份，氯化钠0.1份，硫酸钙0.2份、1％钼酸钠溶液1.0mL，1％硫酸锰1.0mL，琼脂18份，蒸馏水1000mL，pH为7.0。于25℃条件下培养30h,产生孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml菌悬液；
4、复合菌剂的制备：将步骤2与步骤3分别制得的木霉菌孢子悬液、根瘤菌悬液按10％的接种量接种于同一固体培养基中，所述的固体培养基原料组成份数为：麦麸1.0份、橘皮1.0份、玉米秸秆粉1.0份、维生素C0.1份、维生素A0.1份，蒸馏水50ml,pH为7.0。于28℃条件下培养72h；即得复合菌剂。
一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法：选取某地0.5亩PAHs污染表层土壤(0-20cm)，将催芽处理的紫花苜蓿种子均匀播种，待种子发芽时，将复合菌剂直接施用于土壤，可按7.5kg/公顷土壤的量在紫花苜蓿根部单施，土壤水分维持在田间持水量的60％，其它田间管理措施如：修剪、浇水、除草、施肥等均一致。
紫花苜蓿-微生物协同处理的PAHs土壤测定试验
1材料与方法
1.1原始土壤
将实施例1处理前PAHs污染表层土壤(0-20cm)剔除石砾等残留物，塑料袋封装，自然避光风干，研磨，过4mm筛，于4℃下保藏备用。经测定16种EPA优先控制的PAHs总质量分数为9.326ug/kg，其中2～3环、4环、5-6环PAHs含量分别占总量的6.01％、45.89％、48.1％。
1.2处理土壤
经过90天培养，将实施例1采用紫花苜蓿-微生物处理之后的土壤剔除植物根系、石砾等残留物，塑料袋封装，自然避光风干，研磨，过4mm筛，于4℃下保藏备用
1.3处理土壤PAHs的提取
土壤PAHs提取采用二氯甲烷索氏提取法，提取液使用GC-MS测定。
1.4土壤降解率的测定
土壤PAHs降解率(％)＝(原始污染土壤PAHs质量分数-处理后PAHs质量分数)/原始污染土壤PAHs质量分数×100％
1.5数据统计分析方法
本研究中所有图形均采用Origin8.0制作完成，显著性分析使用SPSS19.0进行。
2结果与分析
2.1紫花苜蓿-微生物协同降解土壤的效果
经过90d的培养，经过处理土壤中PAHs的去除情况如表1所示。由表1数据可知，接种木霉菌和根瘤菌的紫花苜蓿能够进一步促进PAHs的降解。土壤中l6种PAHs质量分数为6.896ug/kg。与原始土壤相比具有显著差异(p<0.05)，经试验数据得出，其中处理土壤中2～3环、4环、5-6环PAHs的降解率分别为20.98％、30.12％、35.63％。
表1紫花苜蓿-微生物协同降解土壤的效果
实施例2
1、紫花苜蓿种子预处理：净选饱满、无虫蛀、无霉变的紫花苜蓿种子，浸泡于75％无水乙醇1.0min，取出后置于0.1mol/LHgC12溶液中浸泡25min,后用灭菌水漂洗5遍，纱布吸干表面水分后转入培养皿中室温下催芽培养；
2、木霉菌孢子悬浮液的制备：将木霉菌T30(Trichodermakoningii)菌种接种于高糖培养基中，所述的高糖培养基原料组成份数为：酒石酸铵1.6份、葡萄糖18份、磷酸二氢钾0.8份、硫酸镁0.5份、三氯化铁0.05份、马铃薯40份、琼脂15份、麸皮0.8份、玉米汁0.5份、蛋白胨0.8份，蒸馏水1000ml、pH为7.0。于28℃条件下培养5d,产生大量孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml孢子悬液；
3、根瘤菌悬液的制备：将苜蓿根瘤菌接种于琼脂培养基中，所述的琼脂培养基原料组成份数为:400mg/L硝酸稀土溶液3.0ml、甘露醇2.0份，酵母膏0.95份，磷酸氢二钾0.75份，硫酸镁0.2份，氯化钠0.3份，硫酸钙0.4份，1％钼酸钠溶液2.5mL，1％硫酸锰3.0mL，琼脂18份，蒸馏水1000mL，pH为7.0。于25℃条件下培养30h,产生孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml菌悬液；
4、复合菌剂的制备：将步骤2与步骤3分别制得的木霉菌孢子悬液、根瘤菌悬液按10％的接种量接种于同一固体培养基中，所述的固体培养基原料组成份数为：麦麸1.5份、橘皮2.0份、玉米秸秆粉3.5份、维生素C0.2份、维生素A0.3份，蒸馏水100ml,pH为7.0。于28℃条件下培养72h；即得复合菌剂。
一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法：选取某地3亩PAHs污染表层土壤(0-20cm)，将催芽处理的紫花苜蓿种子均匀播种，待种子发芽时，将复合菌剂直接施用于土壤，可按60kg/公顷土壤的量在紫花苜蓿根部单施，土壤水分维持在田间持水量的65％，其它田间管理措施如：修剪、浇水、除草、施肥等均一致。
PAHs土壤测定试验同实施例1一致
经紫花苜蓿-微生物协同处理，土壤中l6种PAHs质量分数6.783ug/kg。其中土壤中2～3环、4环、5-6环PAHs的降解率分别为21.02％、31.63％、38.62％。
实施例3
1、紫花苜蓿种子预处理：净选饱满、无虫蛀、无霉变的紫花苜蓿种子，浸泡于75％无水乙醇0.8min，取出后置于0.1mol/LHgCl2溶液中浸泡30min,后用灭菌水漂洗6遍，纱布吸干表面水分后转入培养皿中室温下催芽培养；
2、木霉菌孢子悬浮液的制备：将木霉菌T30(Trichodermakoningii)菌种接种于高糖培养基中，所述的高糖培养基原料组成份数为：酒石酸铵1.6份、葡萄糖23份、磷酸二氢钾1.5份、硫酸镁1.5份、三氯化铁0.03份、马铃薯60份、琼脂40份、麸皮6.0份、玉米汁0.6份、蛋白胨2.8份，蒸馏水1000ml、pH为7.0。于28℃条件下培养5d,产生大量孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml孢子悬液；
3、根瘤菌悬液的制备：将苜蓿根瘤菌接种于琼脂培养基中，所述的琼脂培养基原料组成份数为:400mg/L硝酸稀土溶液2.5ml、甘露醇1.2份，酵母膏0.8份，磷酸氢二钾0.5份，硫酸镁0.3份，氯化钠0.4份，硫酸钙0.4份，1％钼酸钠溶液2.6mL，1％硫酸锰3.8mL，琼脂18.5份，蒸馏水1000mL，pH为7.0。于25℃条件下培养30h,产生孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml菌悬液；
4、复合菌剂的制备：将步骤2与步骤3分别制得的木霉菌孢子悬液、根瘤菌悬液按10％的接种量接种于同一固体培养基中，所述的固体培养基原料组成份数为：麦麸2.5份、橘皮3.5份、玉米秸秆粉4.0份、维生素C0.35份、维生素A0.4份，蒸馏水100ml,pH为7.0。于28℃条件下培养72h；即得复合菌剂。
一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法：选取某地10亩PAHs污染表层土壤(0-20cm)，将催芽处理的紫花苜蓿种子均匀播种，待种子发芽时，将复合菌剂直接施用于土壤，可按150kg/公顷土壤的量在紫花苜蓿根部单施，土壤水分维持在田间持水量的70％，其它田间管理措施如：修剪、浇水、除草、施肥等均一致。
PAHs土壤测定试验同实施例1一致
经紫花苜蓿-微生物协同处理，土壤中l6种PAHs质量分数6.621ug/kg。其中土壤中2～3环、4环、5-6环PAHs的降解率分别为25.30％、32.02％、39.30％。

Claims (8)

1.一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)、紫花苜蓿种子预处理：净选饱满、无虫蛀、无霉变的紫花苜蓿种子，浸泡于75％无水乙醇0.5～1min，取出后置于0.1mol/LHgC12溶液中浸泡20～30min,后用灭菌水漂洗5～6遍，用纱布吸干表面水分后转入培养皿中室温下催芽培养；
2)、木霉菌孢子悬浮液的制备：将木霉菌菌种接种于高糖培养基中，于28℃条件下培养4～5d,产生大量孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml孢子悬液；
3)、根瘤菌悬液的制备：将苜蓿根瘤菌接种于琼脂培养基中，于25℃条件下培养30～60h,产生孢子，用无菌水冲洗孢子，制成浓度为1×108/ml菌悬液；
4)、复合菌剂的制备：将步骤2与步骤3分别制得的木霉菌孢子悬液、根瘤菌悬液按10％的接种量接种于同一固体培养基中，于28～30℃条件下培养72h；即得复合菌剂。
2.一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法，其特征在于：将催芽的紫花苜蓿种子播种于多环芳烃污染的土壤中，待种子发芽时，将复合菌剂单施于紫花苜蓿根部，土壤水分维持在田间持水量的60％～70％，培养90天其它田间管理措施如：修剪、浇水、除草、施肥等均一致。
3.根据权利要求1所述的利用紫花苜蓿-微生物协同修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于步骤2)中木霉菌菌种为：木霉菌T30(Trichodermakoningii)。
4.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于：步骤3)中根瘤菌菌种为：中国农业微生物菌种保藏管理中心(中国农业科学院农业资源与农业区划研究院)提供的苜蓿根瘤菌ACCC17676。
5.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于：步骤2)中高糖培养基原料组成份数为：酒石酸铵1.5～2份、葡萄糖20～25份、磷酸二氢钾1～2份、硫酸镁1～2份、三氯化铁0.01～0.05份、马铃薯50～100份、琼脂10～50份、麸皮1～10份、玉米汁1～10份、蛋白胨1～5份，蒸馏水1000ml、pH为7.0。
6.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于：步骤3)中琼脂培养基原料组成份数为：400mg/L硝酸稀土溶液1～5ml、甘露醇1.0～5.0份，酵母膏0.8～1.0份，磷酸氢二钾0.5～1.0份，硫酸镁0.2～0.5份，氯化钠0.1～0.5份，硫酸钙0.2～0.5份，1％钼酸钠溶液1～5mL，1％硫酸锰1～5mL，琼脂18～20份，蒸馏水1000mL，pH为7.0。
7.根据权利要求1所述的一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤的方法，其特征在于：步骤4)中固体培养基原料组成份数为：麦麸1～5份、橘皮1～5份、玉米秸秆粉1～5份、维生素C0.1～0.5份、维生素A0.1～0.5份，蒸馏水50～100ml,pH为7.0。
8.根据权利要求2所述的一种紫花苜蓿协同复合菌剂修复多环芳烃污染土壤应用方法，其特征在于：复合菌剂添加量每公顷15～20kg。
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