CN106424126A - 铜镉复合污染土壤的修复方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种铜镉复合污染土壤的修复方法,具体如下:在污染土壤中种植牛筋草,并联合施加绿木霉F7或灭活绿木霉F7;所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3.17613。绿木霉F7联合牛筋草处理污染土壤,提高了铜镉复合污染土壤的修复效率,微生物与植物之间存在协同促进修复效果的现象;具有良好的生态效应,适用于铜镉复合污染土壤的修复;绿木霉F7发酵液和固体制剂施用方法简单,显著增加牛筋草的生物量,同时可以提高土壤微生物量,改善植物的根际微生态环境。
Description
技术领域
本发明属于生态环保领域,特别是重金属污染土壤治理领域,具体涉及一种铜镉复合污染土壤的修复方法。
背景技术
随着工业的发展和农业生产的现代化,农田重金属污染日益严重,污染面积逐年扩大。重金属由于具有不易降解、易富集等特点受到广泛关注。重金属污染以多种元素共存所造成的复合污染为主要表现形式,土壤中往往同时存在铜和镉的污染,且镉和过量的铜均会影响作物生长发育,导致农作物产量和品质下降,并通过食物链对人体健康造成危害。已有我国很多地区土壤中铜镉含量严重超过当地土壤背景值的报道。因此,铜镉污染土壤的治理和修复越来越受到重视。
用于重金属污染土壤修复的常规方法有化学修复,物理和工程修复,如固定化/稳定化、淋洗法、洗土法、电动力学修复法、化学还原法等,但这些方法成本高,且易造成二次污染。与传统方法相比,植物修复具有投资和维护成本低,不易造成二次污染,环境友好和可持续性等众多优点。尽管植物修复在重金属污染土壤修复中具有极大的优势,但其本身也有局限性,如大部分重金属高累积植物生物量低、生长缓慢且生长周期长,修复效率和速率低。如何在增加修复植物生物量的同时又可大幅度提高植物对重金属的绝对吸收量成为提高植物修复效率的关键环节。
牛筋草是重金属的高累积植物,且可通过增加其收割次数来降低土壤中的重金属含量,因此适合作为铜、镉复合污染土壤生态修复的植物。为进一步提高植物修复效率,可采用微生物-植物联合修复的方法,提高重金属高累积植物的修复效率。作为一种植物生防真菌,木霉属(Trichoderma)能够促进植物种子萌发和植株生长,提高作物产量,同时还能活化土壤中的重金属,促进植物对重金属的吸收。
发明内容
针对生产实践中的实际问题和需求,本发明旨在提供一种微生物-植物联合修复的方法,在增加修复植物生物量的同时提高对铜镉的绝对吸收量,实现对铜镉复合污染土壤高效、快速地修复。
一种铜镉复合污染土壤的修复方法,具体如下:在污染土壤中种植牛筋草,并联合施加绿 木霉F7或灭活绿木霉F7;所述绿木霉F7的分类命名为Trichoderma virens,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.3.17613。
进一步地,所述牛筋草的种植密度为50-80株/m2土地,密度过低根系无法全面覆盖污染土壤造成吸收率低,密度过高牛筋草的营养光照等条件跟不上、生长弱,也会降低对铜镉的吸收率。
进一步地,所述绿木霉F7的施加量为1×1012-9×1013个孢子数/m2土地,如果施加量过低,绿木霉F7无法在短期内有效扩增影响对铜镉的吸收,施加量也不宜过高以有效控制成本。
进一步地,保持污染土壤中含水量为最大田间持水量的60-80%,以便有利于植物生长。
进一步地,牛筋草种植及绿木霉F7联合施加的方式为以下三者之一:(1)先在污染土壤中种植牛筋草再施加绿木霉F7;(2)先施加绿木霉F7再种植牛筋草;(3)用绿木霉F7菌液浸泡牛筋草种子再播种。
进一步地,所述种植的牛筋草可以是直接将牛筋草种子播种到污染土壤中,也可以将牛筋草植株移栽至污染土壤中。
更进一步地,所述种植的牛筋草优选直接将牛筋草种子播种到污染土壤中,直接在原土壤中播种生长,避免移栽损伤根茎,无需缓苗过程,更利于牛筋草的扎根生长,提高生物量,因此吸收铜镉的速度更快。
进一步地,所述绿木霉F7的施加形式为发酵液或固体制剂。
进一步地,发酵液的制备方式为:将活化的绿木霉F7菌块接种到含有马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面上,28±2℃黑暗条件下培养4-6d后,用无菌水冲洗下分生孢子,将孢子液稀释到1×105-9×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液;取种子液按照1%的接种量接种于PDA液体培养基中,28±2℃,150-200r/min的恒温震荡培养4-6d,即得到绿木霉F7发酵液。
进一步地,发酵液的施加方式为将绿木霉F7发酵液直接施加在牛筋草根部。
进一步地,发酵液在牛筋草出苗后15d、30d和60d,分三次向植物根际部位接种,以加强接种效果。
进一步地,固体制剂的制备方式为将绿木霉F7种子液(1×105-9×105个孢子/mL),加入到麦麸培养基中,28±2℃培养3-5d至长出白色菌丝时,无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀,使绿木霉F7布满整个培养基;隔1.5-3d后再次用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀,直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子,混匀计数孢子量为1×109-9×109个孢子/g,得到绿木霉F7固体制剂。固体制剂的施加方式为按土壤重量的4-6%将固体制剂拌入土壤中。
本发明修复铜镉污染土壤的方法与现有技术相比有如下优点:
(1)绿木霉F7联合牛筋草处理污染土壤,提高了铜镉复合污染土壤的修复效率,微生物与植物之间存在协同促进修复效果的现象;
(2)绿木霉F7发酵液和固体制剂施用方法简单,显著增加牛筋草的生物量,同时可以提高土壤微生物量,改善植物的根际微生态环境;
(3)绿木霉F7联合牛筋草处理修复铜镉复合污染土壤,具有良好的生态效应,适用于铜镉复合污染土壤的修复。
附图说明
图1实施例1不同处理下修复90d后牛筋草地上部Cu、Cd含量;
图2实施例1不同处理下修复90d后牛筋草地上部Cu、Cd累积量;
图3实施例2不同处理下修复75d后牛筋草地上部Cu、Cd含量;
图4实施例2不同处理下修复75d后牛筋草地上部Cu、Cd累积量。
生物材料样品保藏信息:
绿木霉(Trichoderma virens)F7,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏日期:2015年6月29日,保藏编号为CGMCC No.3.17613。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明做进一步详细说明。
实施例1:绿木霉F7发酵液联合牛筋草修复铜镉复合污染土壤
供试土壤采自天津市东丽区污染土壤(砂壤土),其基本理化性质为:pH 7.64(土水比1:2.5),有机质21.1g/kg,阳离子交换量15.9cmol/kg,总铜含量775mg/kg,总镉含量3.05mg/kg。土壤样品自然风干,磨细过2mm(10目)筛,供盆栽模拟试验用。
供试牛筋草种子购自中国农业科学院。
供试菌种为绿木霉(Trichoderma virens)菌株F7(保藏编号:CGMCCNo.3.17613),菌丝白色棉絮状,绿色孢子。
斜面培养基:采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),称取马铃薯200克,洗净切块,加去离子水煮沸30min后,过滤出上清液,加入葡萄糖20克,琼脂15克,用去离子水定容至1000ml,121℃灭菌20min。
液体培养基:采用PDA培养基,组分同上,不加琼脂。
绿木霉F7发酵液制备:将绿木霉F7菌种在PDA斜面培养基上进行活化,28℃黑暗条件下培养5d后,用无菌水冲洗下分生孢子,将孢子液稀释到2×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液;取种子液按照1%的接种量接种于PDA液体培养基中,28℃,180r/min的恒温震荡培养5d,即得到绿木霉F7发酵液。混匀后待用。
绿木霉F7发酵液灭活处理方式为:取绿木霉F7发酵液加入6M盐酸调节pH至2.5并加热至80℃,恒温1h,再用6M氢氧化钠溶液调至原始pH值。
盆栽试验设置三个处理,处理一:CK,为不接种绿木霉F7发酵液的对照;处理二:接种灭活绿木霉F7发酵液;处理三:接种绿木霉F7发酵液。每处理做四次重复。盆内径为24cm,每盆中装入风干后过2mm筛的土样2.5kg,加入蒸馏水至土壤田间持水量,保持土壤含水量平衡1周后开始播种。选取饱满的牛筋草种子,用1%次氯酸钠溶液浸泡种子10min。取出用去离子水清洗种子5次后,在盆里的土壤中事先挖好深度一致的穴,均匀播种10颗种子,然后将土覆盖在种子上,喷洒去离子水。待植物长出2片真叶时,间苗,保证每盆钵3棵牛筋草,相当于66.4株/m2土地。在牛筋草出苗后15d,在每盆的植株根际施加100ml绿木霉F7发酵液或灭活发酵液。在修复过程中,保持土壤含水量为最大田间持水量的65%左右。在培养30d和60d时,分别向植物根际追加100ml绿木霉F7发酵液或灭活发酵液,三次发酵液总施加量相当于6.63×1012孢子数/m2土地。牛筋草生长90d后,用不锈钢剪刀减去地上部,测定植株鲜重。用去离子水冲洗后,105℃杀青20min,70℃烘至恒重,粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物指标(微生物量碳和氮)分析用。
绿木霉F7发酵液对牛筋草生物量的影响见表1。从表1中可以看出,不同处理的地上部生物量从大到小依次为:绿木霉F7发酵液>灭活绿木霉F7发酵液>对照。其中,施加灭活绿木霉F7发酵液处理和绿木霉F7发酵液处理的鲜重分别比对照高33.0%和51.7%;干重分别比对照高27.3%和51.8%。说明绿木霉F7发酵液能够显著提高牛筋草地上部生物量,尤其是不灭菌的绿木霉F7发酵液作用更加显著。
表1不同处理下修复90d后牛筋草地上部生物量
对照 | 灭活绿木霉F7发酵液 | 绿木霉F7发酵液 | |
地上部鲜重(g/盆) | 52.2±3.23c | 66.4±1.97b | 79.2±1.99a |
地上部干重(g/盆) | 4.17±0.261c | 5.57±0.402b | 6.35±0.162a |
牛筋草铜镉含量的测定:牛筋草样品采用微波消解法(浓HNO3与30%H2O2体积比为7:1)进行消化,随后采用ICP-MS测定Cu、Cd含量,消化以及测定过程中以国家标准物质(GBW07603GSV-2)为内标控制样品分析质量。绿木霉F7发酵液对牛筋草地上部铜镉含量和累积量的影响分别见图1、图2。
图1为修复90d后牛筋草地上部Cu、Cd含量,与未施加绿木霉F7发酵液的对照相比,施加灭活绿木霉F7发酵液处理和绿木霉F7发酵液处理均可以显著增加牛筋草地上部的Cu、Cd含量。施加灭活绿木霉F7发酵液处理组的Cu、Cd含量分别高于对照组16.6%和22.8%,而施加绿木霉F7发酵液组的Cu、Cd含量分别高于对照组33.9%和53.7%。
图2为修复90d后牛筋草地上部Cu、Cd累积量,与未施加绿木霉F7发酵液的对照相比,施加灭活绿木霉F7发酵液和绿木霉F7发酵液处理下牛筋草地上部所提取的Cu总量分别高于对照组39.8%和104%,而Cd总量分别高于对照组47.6%和134%,说明施加绿木霉F7发酵液可以显著提高牛筋草对Cu、Cd复合污染土壤的修复效果。
土壤微生物生物量碳和氮的测定:根际鲜土过2mm筛后于25℃黑暗条件下氯仿熏蒸24h,设置不熏蒸对照处理。24h后用0.5M K2SO4溶液浸提(土水质量比1:4),300r/min振荡30min,过滤。提取液一部分用K2CrO7氧化法测定微生物量碳,另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮,测定结果见表2。土壤微生物量碳和氮是衡量微生物活性和数量的重要指标,从表2可以看出,施加灭活绿木霉F7发酵液和绿木霉F7发酵液能显著增加微生物量碳和氮,提高土壤中微生物的活性。施加灭活绿木霉F7发酵液和绿木霉F7发酵液处理组的土壤微生物量碳分别高于对照15.4%和25.6%,微生物量氮分别高于对照23.3%和31.7%。
表2不同处理下修复90d后土壤微生物量碳和氮
对照 | 灭活绿木霉F7发酵液 | 绿木霉F7发酵液 | |
微生物量碳(mg/kg) | 157±10.8b | 180±6.81ab | 196±11.2a |
微生物量氮(mg/kg) | 17.0±1.01b | 21.0±2.43ab | 22.4±1.65a |
实施例2:绿木霉F7固体制剂联合牛筋草修复铜镉复合污染土壤
供试土壤采自江苏省南京市九华山矿区附近污染土壤(粉沙土),其基本理化性质为:pH7.31(土水比1:2.5),有机质35.6g/kg,阳离子交换量15.1cmol/kg,总铜含量1200mg/kg,总镉含量4.31mg/kg。土壤样品自然风干,磨细过2mm(10目)筛,供盆栽模拟试验用。
供试牛筋草、绿木霉F7、培养基同实施例1。
绿木霉F7发酵液制备:将绿木霉F7菌种在PDA斜面培养基上进行活化,28℃黑暗条件下培养5d后,用无菌水冲洗下分生孢子,将孢子液稀释到2×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液。
以麦麸为绿木霉F7繁殖的载体即培养基,将麦麸洗净烘干粉碎后,调节其含水量为50wt%。分装至15cm培养皿中,每个培养皿约65g,121℃灭菌30min。无菌条件下,吸取绿木霉F7种子液加入到麦麸培养基中,28℃培养4d。待长出少量白色菌丝时,无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀,使绿木霉F7布满整个培养基。隔2d后重复上述操作,直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子,混匀计数孢子量为6×109个孢子/g,得到绿木霉F7固体制剂。
绿木霉F7固体制剂灭活处理方式为:取绿木霉F7固体制剂在温度115℃条件下,进行15min的灭菌处理。
盆栽试验设置三个处理,处理一:CK,为不施加绿木霉F7固体制剂的对照;处理二:施加灭活绿木霉F7固体制剂;处理三:施加绿木霉F7固体制剂。每处理做四次重复。供试土壤风干后过2mm筛,装盆,盆内径为22.5cm,每盆2kg土。绿木霉F7固体制剂施加量为按照供试土壤质量的5%(0.1kg)拌入土壤,相当于1.51×1013孢子数/m2土地。将绿木霉F7固体制剂及灭活绿木霉F7固体制剂按上述方式施加。选取饱满的牛筋草种子,用1%次氯酸钠溶液浸泡种子10min,取出用去离子水清洗种子7次后,在盆里的土壤中事先挖好深度一致的穴,均匀播种10颗种子。然后将土覆盖在种子上。喷洒去离子水。待植物长出2片真叶时,间苗,保证每盆钵3棵牛筋草,相当于75.5株/m2土地。在修复过程中,保持土壤含水量为最大田间持水量的65%左右。植物生长75d后,用不锈钢剪刀减去地上部,测定植株鲜重。用去离子水冲洗后,105℃杀青20min,70℃烘至恒重,粉碎过100目筛。保留部分根际鲜土供土壤微生物指标(微生物量碳和氮)分析用。
绿木霉F7固体制剂对牛筋草生物量的影响见表3,从表3中可以看出,不同处理的地上部生物量从大到小依次为:绿木霉F7固体制剂>灭活绿木霉F7固体制剂>对照。其中,施加灭活绿木霉F7固体制剂处理和绿木霉F7固体制剂处理的鲜重分别比对照高19.9%和52.6%;干重分别比对照高18.7%和50.8%。说明绿木霉F7代谢产物在灭活后仍然对植物产生促进作用,而不灭活的绿木霉F7固体制剂作用更加明显。
表3不同处理下修复75d后牛筋草地上部生物量
对照 | 灭活绿木霉F7固体制剂 | 绿木霉F7固体制剂 | |
地上部鲜重(g/盆) | 49.4±1.27c | 58.7±1.64b | 74.5±3.56a |
地下部干重(g/盆) | 3.92±0.183c | 4.70±0.151b | 5.98±0.290a |
牛筋草地上部铜镉含量及累积量的测定方法同实施例1,结果分别见图3、图4。
图3为修复75d后牛筋草地上部Cu、Cd含量,施加灭活绿木霉F7固体制剂处理和绿木霉F7固体制剂处理可以显著增加牛筋草地上部的Cu、Cd含量。施加灭活绿木霉F7固体制剂 处理组的Cu、Cd含量分别高于对照组16.6%和22.8%,而施加绿木霉F7固体制剂组的Cu、Cd含量分别高于对照组33.9%和53.7%。
图4为修复75d后牛筋草地上部Cu、Cd累积量,施加灭活绿木霉F7固体制剂和绿木霉F7固体制剂处理下牛筋草地上部所提取的Cu总量分别高于对照组39.8%和104%,而Cd总量分别高于对照组47.6%和134%,说明施加绿木霉F7固体制剂可以显著提高牛筋草对Cu、Cd复合污染土壤的修复效果。
牛筋草修复后土壤微生物生物量碳和氮的测定方法同实施例1,结果见表4,从表4中可以看出,灭活绿木霉F7固体制剂和绿木霉F7固体制剂能显著增加微生物量碳和氮,提高土壤中微生物的活性。这两种处理的土壤微生物量碳分别高于对照19.8%和31.5%,微生物量氮分别高于对照12.0%和25.1%。
表4不同处理下修复75d后土壤微生物量碳和氮
对照 | 灭活绿木霉F7固体制剂 | 绿木霉F7固体制剂 | |
微生物量碳(mg/kg) | 93.8±3.26c | 112±3.06b | 123±5.51a |
微生物量氮(mg/kg) | 11.9±0.379b | 13.4±0.862ab | 14.9±0.681a |
Claims (10)
1.一种铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,具体如下:在污染土壤中种植牛筋草,并联合施加绿木霉F7或灭活绿木霉F7;所述绿木霉F7的分类命名为Trichodermavirens,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCCNo.3.17613。
2.根据权利要求1所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,所述牛筋草的种植密度为50-80株/m2土地,所述绿木霉F7的施加量为1×1012-9×1013个孢子数/m2土地。
3.根据权利要求1或2所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,保持污染土壤中含水量为最大田间持水量的60-80%。
4.根据权利要求1或2所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,牛筋草种植及绿木霉F7联合施加的方式为以下三者之一:(1)先在污染土壤中种植牛筋草再施加绿木霉F7;(2)先施加绿木霉F7再种植牛筋草;(3)用绿木霉F7菌液浸泡牛筋草种子再播种。
5.根据权利要求1或2所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,所述种植的牛筋草直接将牛筋草种子播种到污染土壤中。
6.根据权利要求1或2所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,所述绿木霉F7的施加形式为发酵液或固体制剂。
7.根据权利要求6所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,发酵液的制备方式为:将活化的绿木霉F7菌块接种到PDA培养基斜面上,28±2℃黑暗条件下培养4-6d后,用无菌水冲洗下分生孢子,将孢子液稀释到1×105-9×105个孢子/mL作为发酵接种的种子液;取种子液按照1%的接种量接种于PDA液体培养基中,28±2℃,150-200r/min的恒温震荡培养4-6d,即得到绿木霉F7发酵液。
8.根据权利要求6或7所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,发酵液的施加方式为将绿木霉F7发酵液直接施加在牛筋草根部;发酵液在牛筋草出苗后15d、30d和60d,分三次向植物根际部位接种。
9.根据权利要求6所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,固体制剂的制备方式为将1×105-9×105个孢子/mL的绿木霉F7种子液,加入到麦麸培养基中,28±2℃培养3-5d至长出白色菌丝时,无菌条件下用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀,使绿木霉F7布满整个培养基;隔1.5-3d后再次用玻璃棒将菌丝和培养基充分混匀,直至整个麦麸培养基都长满绿色的绿木霉F7孢子,混匀计数孢子量为1×109-9×109个孢子/g,得到绿木霉F7固体制剂。
10.根据权利要求6或9所述的铜镉复合污染土壤的修复方法,其特征在于,固体制剂的施加方式为按土壤重量的4-6%将固体制剂拌入土壤中。
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