CN108097711A - 一种利用微紫青霉菌联合印度芥菜修复锌污染土壤的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用微紫青霉菌联合印度芥菜修复锌污染土壤的方法，属于环境污染治理技术领域。本发明通过在锌污染土壤中种植锌富集植物，并在植物根际接种耐锌微生物，利用微生物的活化作用和对植物的促生作用，使得可利用金属含量增加，植物的生物量得到提高，从而促进超积累植物对锌的富集，实现修复锌污染土壤的目的。

Description

一种利用微紫青霉菌联合印度芥菜修复锌污染土壤的方法
技术领域
本发明涉及一种利用微紫青霉菌联合印度芥菜修复锌污染土壤的方法，本发明属于环境污染治理技术领域。
背景技术
近现代以来，随着工业和农业的迅速发展，重金属也被越来越广泛地使用，随之而来的污染问题也越发凸显，而土壤作为污染物最大的容纳场所，土壤污染也成为全球性的环境问题之一，尤其是农田土壤重金属污染防治与修复问题更加突出。
土壤中锌的来源主要是铅锌矿的开采和冶炼，以及电镀(镀锌)行业工业“三废”的排放。目前，中国耕地受锌、镉等重金属污染的面积约占耕地总面积的1/5，土壤中锌过量会导致土壤退化，影响植物生长，造成作物减产，锌被植物富集后会通过食物链最终在人体内积累，危害人类健康，引起呕吐、腹泻、厌食等消化道症状，并引发贫血等。土壤质量是农产品安全生产的第一道防线，做好土壤中重金属污染的防治与修复工作具有重要的意义。
土壤中的重金属污染具有潜伏性、不可逆性、长期性以及广泛性，且不能通过生物降解去除，只能发生位置迁移和各种形态之间相互转化。目前对于重金属污染土壤的修复方法主要包括物理法、化学法和生物法三种。传统的物理化学修复方法通过各种物理过程或向土壤中添加改良剂、抑制剂等实现土壤中重金属的去除或者钝化，包括客土法、土壤淋洗、电动修复、电热修复、稳定化/固化等，这些技术不仅成本较高、破坏土壤结构，容易引起土壤肥力下降，还有可能导致二次污染。
近年来研究较多的生物修复技术因其投资少、成本低、对土壤环境扰动小、不引起二次污染等特点而备受关注，其中利用植物吸收重金属被认为是解决土壤重金属污染的理想方法之一。印度芥菜是一种超积累植物，能够吸收、富集和转移重金属锌，是一种具有良好修复能力的植物资源。
但是目前已发现的可用于土壤生物修复的植物受到地理条件、气候条件的限制，通常生物量较小、生长缓慢，因而大大影响了它们修复重金属污染土壤的潜力。
发明内容
本发明提供了一种经济高效、不造成二次污染、美化景观的微生物联合植物修复重金属锌污染土壤的方法。通过在锌污染土壤中种植超积累植物印度芥菜，并在其根部接种对锌具有高耐受性的微生物，等到植物成熟之后，将植物整体移走，从而实现去除土壤中的重金属锌污染物的目的。
本发明的第一个目的是提供一种微生物-植物联合修复重金属锌污染土壤的方法，是在锌污染土壤中种植超积累植物，并在植物根系接种耐锌微生物。
在本发明的一种实施方式中，所述耐锌微生物包括但不限于微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)。
在本发明的一种实施方式中，所述耐锌微生物为微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)BC109-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC NO.13561。Zn2+对该菌的最小抑制浓度(MIC)为2100mg·L-1。
在本发明的一种实施方式中，所述超积累植物包括印度芥菜、龙葵、蜈蚣草、大叶井口边草、宝山堇菜、商陆、东南景天、海州香薷和鸭跖草等。
在本发明的一种实施方式中，所述超积累植物为印度芥菜。
在本发明的一种实施方式中，所述印度芥菜种植在锌污染土壤中，可露天栽培，控制水分含量，使土壤含水率保持在55～65％。
在本发明的一种实施方式中，印度芥菜根际接种的耐锌菌群密度≥1×106cfu/g，即每克干土接种不少于106cfu/g的菌种。
在本发明的一种实施方式中，将所述菌种制备成浓度为1～4×108cfu/mL的菌悬液，分别在播种前和印度芥菜出苗后2、4、6周接种菌悬液5mL。
在本发明的一种实施方式中，所述接种的方式为吸取菌悬液浇灌到植物根系所在位置的土壤中。
在本发明的一种实施方式中，所述印度芥菜生长成熟后收割，继续种植新一批印度芥菜种子并重复上述操作，直至土壤中的锌含量达到土壤环境质量标准。
本发明的第二个目的是提供所述方法在修复重金属锌污染土壤方面的应用。
有益效果：本发明的方法通过接种微紫青霉菌BC109-2，能促进植物根系伸长，伸长率在4.14％～44.83％之间；接种根际促生菌后，植物地上部分(茎)干重与对照组相比增加了10.17％～32.26％，地下部分(根)则增加了0.13％～65.60％，说明菌株BC109-2能够促进印度芥菜干生物量的增加；同时接种微紫青霉菌BC109-2的印度芥菜对土壤中Zn的富集量提升了1.02～1.24倍不等，且印度芥菜的地上部分对土壤中Zn的提取量与不接种菌的对照组相比分别提高了1.34、1.63、1.35、1.22和1.42倍，说明了根际促生菌BC109-2可以促进印度芥菜对土壤中重金属锌的富集与吸收，提高印度芥菜地上部分对Zn的提取效果。本发明技术具有实践性强、高效安全、不破坏土壤结构和性质、不引起二次污染，美化环境等优点，应用前景广泛。
附图说明
图1不同锌浓度下印度芥菜种子5天的根伸长量；
图2不同锌浓度下印度芥菜接种菌前后地上部分对Zn的提取总量。
具体实施方式
以下将通过对耐锌微生物菌株BC109-2的促生潜力研究和在锌污染土壤中种植印度芥菜的盆栽实验为例，对本发明进行进一步的阐述。
实施例1：菌株BC109-2的促生潜力研究
BC109-2的ACC脱氨酶活性测定：1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-Aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC)脱氨酶可以催化乙烯的前体ACC分解成α-丁酮酸和氨，从而降低植物体内乙烯的含量，降低过量乙烯对植物生长产生的毒性作用。
结果如下：由表1中数据可知，菌株在不同Zn2+浓度下均具有ACC脱氨酶活性，且随着Zn2+浓度升高活力逐渐降低，培养基中无Zn2+存在时，酶活力最大为0.582U/mg pro。
表1ACC脱氨酶活性
吲哚乙酸(IAA)的产生能力测定：吲哚乙酸(IAA)是一种天然生长素，其前体是色氨酸。吲哚乙酸对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，但对细胞分裂没有影响。吲哚乙酸作为一种生长激素，在较低浓度会促进植物生长，而浓度较高时则会抑制植物生长，严重时会导致植物死亡。而土壤微生物在自身生长过程中会分泌微量的吲哚乙酸刺激植物根系的发育。
由表2可知，菌株具有分泌植物生长素的能力，其中在培养环境中Zn2+含量较低时产生量最大为1.504mg/L。
表2不同浓度Zn2+胁迫下菌株IAA产生量
铁载体产生量测定：铁载体是一种主要在微生物(真菌、细菌)中合成的一种可以螯合铁的复合物，可以摄取环境中的铁元素。植物在铁胁迫条件下可以将微生物合成的铁载体直接吸收作为铁源利用，因此微生物铁载体在促进植物生长中具有重要意义。菌株铁载体产生量采用通用CAS检测法测定。将新鲜菌种于限铁SA液体培养基中，28℃摇床培养(150rpm)48h；菌悬液经10000rpm离心15min取3mL上清液，将菌液和CAS检测液1：1的体积充分混匀，1h后测定630nm处的吸光度(A)，另取3mL接种死菌的SA培养基上清液与3mL CAS检测液充分混匀，测得的吸光值为参比值(Ar)，A/Ar的比值作为定量指标。
A/Ar值的结果显示，菌株BC109-2在不同浓度Zn2+胁迫下均能产生铁载体，且随着培养基中Zn2+浓度增加，菌株产铁载体能力随之减弱。
表3供试菌株产生铁载体的能力
溶磷能力测定：磷是植物生长发育所必需的三大营养元素之一，植物吸收磷的主要来源是土壤，而土壤中大部分的磷都以难溶盐的形式存在，导致很多土壤中能被植物直接利用的有效磷缺乏，大量研究证明，土壤中的很多微生物能够通过代谢产物溶解土壤中难溶态磷酸盐，提高土壤中植物容易吸收的可溶性磷元素的含量。
表4显示，菌株BC109-2的溶磷量随着Zn浓度的增加而减小，但是差异较小，说明金属浓度对菌株的溶磷能力的影响不大。
表4供试菌株的溶磷能力
综上，锌抗性菌株BC109-2是一株能够为植物提供矿质营养元素，同时能分泌植物激素、合成特异性酶的促生菌，该菌株的促生特性有可能促进超积累植物生物量的提高，从而提高超积累植物对锌污染土壤的修复效果。
实施例2：锌抗性菌株对印度芥菜根伸长量的影响
将种子浸在乙醇：30％H2O2(1:1)溶液中消毒15min，后用蒸馏水洗涤两次。菌种在含有0.5mg/ml色氨酸的LB培养基中28℃，150rpm培养24h，离心收集菌体后将0.1ml OD600为0.2的菌体培养液悬于9.9ml无菌生理盐水中制成细胞悬液(约2.0×108cfu mL-1)加入滤纸上。放种子之前，不同浓度Zn2+以ZnSO4·7H2O形态(0，1，2，3mmol L-1)加到滤纸上。每天加水保持滤纸湿润，室温黑暗条件下培养5d后测量种子根伸长量。以不接种菌株在相同条件下培养的印度芥菜为对照。
在一般情况下，根伸长有助于提高植物富集土壤中重金属的能力。根伸长量是植物根际促生菌的重要指标。图1为不同锌浓度下是否接种微生物菌株对印度芥菜种子5天的根伸长量的影响。在没有接种菌株的情况下，随着锌浓度的不断增加，培养5天后，印度芥菜种子根伸长量由8cm降至5cm，表明重金属锌胁迫对植物生长有一定的抑制作用，且锌浓度越高该抑制作用越强。
在接种根际促生菌BC109-2后，与对照组相比，接种菌株BC109-2的印度芥菜种子根伸长量在不同锌浓度(0，1，2，3mM L-1)下分别增加了9.3％、4.14％、44.83％和9.78％，这说明根际促生菌BC109-2可以促进印度芥菜种子的根伸长量，并且在锌污染的胁迫下该菌株也可以缓解锌对印度芥菜根伸长的抑制作用。
锌抗性菌株菌株BC109-2在锌污染胁迫下能够产生IAA，而IAA对诱导植物细胞的增殖与分化具有重要作用，因而接种根际促生菌的印度芥菜种子的根伸长量比对照组明显，这不仅可以提高印度芥菜对营养物质的吸收效率，也可以促进印度芥菜对土壤中重金属锌的富集与吸收。
实施例3：锌抗性菌株BC109-2联合印度芥菜修复锌污染土壤
将印度芥菜种子浸在乙醇:30％H2O2(1:1)溶液中消毒15min，后用蒸馏水洗涤两次备用。试验均采用外口直径18cm，内口直径15.5cm，高11cm的花盆种植印度芥菜。每盆装入处理后风干的土壤2kg，播种前，每种浓度土壤做接种菌和不接种菌两种处理，共十种处理，每种处理做三组重复，使形成106cfu g-1的土壤。每盆播种经过消毒处理的饱满的印度芥菜种子10粒，出苗后2、4、6周再各接种一次相同浓度菌悬液5mL，在对照组中加水5mL。生长8周后收获植物，洗涤干净，分为根和茎两部分，80℃条件下烘箱烘24h至恒重，酸(4:1HNO3:HClO4)消解后用火焰原子吸收法测锌含量。结果表示为μg g-1植物干重。
表5锌污染土壤中印度芥菜生长实验
序号中0、2、4、8、16分别为外加0、2、4、8、16mmol·kg-1ZnSO4·7H2O溶液染毒处理且不接种锌抗性菌株BC109-2的盆栽土，带+的为接种锌抗性菌株BC109-2的盆栽土。
表中数据为平均值±标准误差(n＝3)
采用温室盆栽实验观察锌抗性菌株BC109-2联合印度芥菜修复锌污染土壤的效果，结果如表5所示。五组实验接种根际促生菌的地上部分(茎)干重与对照组相比分别增加了14.89％、12.90％、10.17％、11.37％和32.26％，地下部分(根)则分别增加了18.18％、65.60％、3.77％、0.13％和44.24％，说明菌株BC109-2能够促进印度芥菜干生物量的增加。
不接种菌株BC109-2时，印度芥菜富集土壤中重金属锌的结果显示地上部分(茎)Zn含量远远高于地下部分(根)，说明印度芥菜富集的锌大部分集中于地上部分。接种菌株后，印度芥菜地上部分和地下部分锌含量均有不同程度增加，这可能是因为菌株BC109-2对土壤中难溶态锌的促溶作用，是土壤中有效态锌的含量增加，促进了印度芥菜对锌的吸收富集，并且使印度芥菜生物量有所增加，从而使印度芥菜增富集污染土壤中重金属锌的量增加。
另外，接种根际促生菌BC109-2之后，与未接种的对照组相比，接种了促生菌的整株印度芥菜所富集的锌含量(整株印度芥菜所富集的锌含量＝根富集的锌含量+茎富集的锌含量)分别是对照组的1.10、1.24、1.02、1.16和1.14倍，说明了菌株BC109-2对提高印度芥菜富集土壤中的锌有明显的促进作用。一般来说，植物根际促生菌具有溶磷作用，能产生IAA和铁载体，具有ACC脱氨酶活性，降低植株体内乙烯的生成，提高植物对锌的抗逆性。
实施例4
在不同锌浓度下种植印度芥菜并接种菌株BC109-2，其它实施方式同实施例3。结果如图2所示，在不同浓度Zn染毒处理的土壤中生长的印度芥菜接种根际促生菌BC109-2之后，印度芥菜的地上部分对土壤中Zn的提取量与不接种菌的对照组相比分别提高了1.34、1.63、1.35、1.22和1.42倍，说明了根际促生菌BC109-2可以显著提高印度芥菜地上部分对Zn的提取效果。菌株BC109-2的促生实验和盆栽试验结果证明该菌株能够促进印度芥菜对铁、磷的同化作用，促进印度芥菜的生物量增加和对土壤中锌的富集。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种微生物-植物联合修复重金属锌污染土壤的方法，其特征在于，是在锌污染土壤中种植超积累植物，并在所述植物根系接种耐锌微生物；所述耐锌微生物包括微紫青霉菌(Penicilliumjanthinellum)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述耐锌微生物为微紫青霉菌(Penicillium janthinellum)BC109-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号为CGMCC NO.13561。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超积累植物包括印度芥菜、龙葵、蜈蚣草、大叶井口边草、宝山堇菜、商陆、东南景天、海州香薷或鸭跖草。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述超积累植物为印度芥菜。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述印度芥菜种植在锌污染土壤中，露天栽培，控制土壤含水率保持在55～65％。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，印度芥菜根际接种的耐锌菌群密度≥1×106CFU/g。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述菌种制备成浓度为1～4×108CFU/mL的菌悬液，分别在播种前和印度芥菜出苗后2、4、6周接种菌悬液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述接种的方式为吸取菌悬液浇灌到植物根系所在处的土壤中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，一批超积累植物生长成熟后收割，继续种植新一批超积累植物并重复接种耐锌微生物的操作，直至土壤中的锌含量达到环境质量标准。
10.权利要求1～9任一所述方法在修复重金属锌污染土壤方面的应用。
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