CN107488618B - 巨大芽孢杆菌h3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用 - Google Patents

巨大芽孢杆菌h3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业和农业技术和芽孢杆菌应用领域，涉及巨大芽孢杆菌H3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用。以芽孢杆菌Bacillus megaterium H3为原料，经细菌活化后制备成菌悬液。在重金属污染土壤中接种Bacillus megaterium H3菌悬液，可以促进水稻生长，降低水稻籽粒中镉含量。在重金属污染土壤中复合使用钝化剂和Bacillus megaterium H3菌悬液时，可以促进蔬菜生长，提高蔬菜品质，降低蔬菜可食用部分镉含量。

Description

巨大芽孢杆菌H3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属 的应用
技术领域
本发明属于农业技术和芽孢杆菌应用领域，涉及巨大芽孢杆菌H3及其在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用。
背景技术
随着工业快速发展、农药及化肥的广泛使用，我国农田土壤镉污染日益严重。水稻是我国重要的粮食作物。重金属镉在水稻根、茎、叶以及籽粒中大量积累，不仅影响水稻产量、品质和整个农田生态系统，还可通过食物链严重危及动物和人类的健康。近年来，以钝化(稳定化)、植物修复、生物修复为代表的农田污染土壤修复技术是目前中轻度污染土壤、重金属超标农田修复的较好选择。目前用于修复重金属污染土壤的改良剂主要包括：石灰性物质、磷酸盐物质、有机物质、黏土矿物、金属氧化物及生物炭等(李剑睿等，2014)。它们的性质结构、对目标重金属元素的选择及钝化机理各不相同。但是由于各种无机和有机改良剂或本身具有一定含量的重金属(如磷肥、堆肥等)、或会对土壤性质、结构造成显著影响(如石灰、粘土类钝化修复剂)，如果大量使用这些钝化修复剂，会产生重金属二次污染、妨碍微量营养元素吸收、影响土壤理化性质等不利影响，并直接影响钝化修复剂的持续应用。
某些植物促生细菌能够通过多种途径促进植物的生长，提高植物对重金属的耐受性；并且可以通过吸附、氧化还原作用、重金属络合作用等改变重金属的赋存形态，从而降低植物对重金属的吸收和转运。Marques等(2013)在盆栽条件下研究了植物促生细菌Chrysiobacterium humi对向日葵生长和耐受富集重金属Zn和Cd的影响，结果表明，供试菌株可以缓解重金属Zn和Cd对向日葵的毒害，向日葵根和茎中的Zn和Cd的吸收与对照相比分别减少了64-67％和27％。Madhaiyan等(2007)报道了分离自水稻的Methylobacteriumoryzae CBMB20和Burkholderia sp.CBMB40在NiCl2和CdCl2存在的溶液中生长时细胞中吸附积累大量的Ni(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)，在盆栽试验中能够促进番茄的生长，并降低番茄对Ni和Cd的吸收量。Wang等(2017)发现菌株Q2-8降低蔬菜可食用部分的As含量(22％-50％)，菌株Q2-13和Q3-11能够降低蔬菜可食用部分Cd含量(21％-53％)。Li等(2017)报道了在盆栽试验中接种菌株H3后的精米Cd含量显著下降。
植物促生细菌-低积累植物阻控修复体系充分利用了土壤-微生物-植物的共存关系，不仅可以提高作物产量，降重农产品重金属含量，并且可以改善土壤生态环境。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术存在的问题，提供巨大芽孢杆菌H3。
本发明的另一目的在于提供H3在促进作物生长和减少作物吸收重金属的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种植物内生细菌H3，分类命名为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月10日，菌种保藏号为CCTCC NO：M2016551。菌落为圆形，不透明，边缘整齐。菌体长杆状，直径1.2-1.4μm，长度2.0-2.5μm，内生芽孢。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在促进作物生长和/或减少作物吸收重金属中的应用。
所述的作物优选粮食作物或蔬菜作物；所述的粮食作物进一步优选水稻，所述的蔬菜作物进一步优选小白菜或生菜。
所述的重金属优选镉。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在减少水稻籽粒中重金属镉中的应用。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在降低蔬菜可食用部分重金属含量的作用。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3与生物炭或赤泥复合在促进蔬菜生长和/或降低蔬菜可食用部分重金属镉含量中的应用。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在提高蔬菜品质中的应用。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在降低土壤可交换态重金属镉含量中的作用。
一种促进生长作物生长，降低重金属含量的组合物，其特征在于由本发明所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3发酵液及生物炭或赤泥中的任意一种组成。
有益效果
本发明所述的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3菌株能够促进水稻籽粒产量增加。
本发明所述的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3菌株在重金属污染土壤中能够阻控水稻积累镉。
本发明所述的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3菌株在重金属污染土壤中能够阻控蔬菜吸收镉。
本发明所述的巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3菌株在促进植物生长或提高钾肥利用率的应用。与现有技术相比有如下优点：
(1)巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3菌株能够高产IAA和铁载体。
(2)在镉污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3，可使水稻籽粒产量增加7.7％～13.3％。
(3)在镉污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3的处理，使得水稻根部、地上部和籽粒镉含量分别降低了51.5％、27.8％和37.1％。
(4)在镉污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3的处理，能使水稻根际土壤pH值显著增高。
(5)在镉污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3的处理，能使水稻根际土可交换态镉的含量显著降低了15％～17％，铁(锰)氧化物结合态镉含量显著增加了8.2％～17.3％，有机质及硫化物结合态镉含量增加了16.4％～32.4％。
(6)在重金属污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3及其与生物炭复合处理，能促进小白菜可食用部分鲜重显著增加42％～43％，生菜鲜重显著增加25％～28％
(7)在重金属污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3及其与生物炭复合处理，能促进小白菜和生菜的Vc含量增加44％～77％，叶绿素相对含量显著增加46％～61％。
(8)在重金属污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3及其与生物炭复合处理，小白菜和生菜Cd含量比对照显著降低29.3％～52.8％。
(9)在重金属污染土壤中接种巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium H3及其与赤泥复合处理，能够显著降低生菜叶片Cd含量分别为58％～88％(P<0.05)，Cd含量低于食品安全国家标准(GB2762-2017)中规定叶菜Cd的限量(0.2mg/kg鲜重)。
生物样品保藏信息
植物促生细菌H3，分类命名为芽孢杆菌属H3Bacillus sp.H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2016年10月10日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2016551。
具体实施方式
实施例1
本发明耐重金属的植物促生细菌H3菌株(CCTCC NO：M 2016551)从生长于铅污染土壤的狼尾草(Pennisetum alopecuroides L.)根际土壤中分离纯化得到，分离鉴定方法如下：将狼尾草从土壤中轻轻拔出，用无菌镊子采取紧密附着在根系表面2mm左右土壤的根际土壤，称重10g，置于盛有90ml无菌水的三角瓶中，充分振荡30min，静置10min，取0.1ml悬液，采用10倍系列稀释法，涂布于肉汤固体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，H2O 1000ml，琼脂20g，pH 7.0-7.2)，28℃培养3d，挑取单菌落在肉汤固体培养基上划线纯化后保存。将菌株接种于肉汤液体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，H2O 1000ml，pH 7.0-7.2)中，30℃150rpm振荡培养16h，取1.5mL菌液于Eppendorf离心管中，5000rpm离心5min收集菌体，按常规方法提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16S rDNA，扩增产物经测序后与GenBank中已知16SrDNA序列进行比对分析，与Bacillus megaterium ATCC 14581的16S rDNA序列相似性达到100％，将其鉴定为这个种。
实施例2菌株H3的活化和菌悬液制备
将H3(CCTCC NO：M 2016551)斜面菌种接种于肉汤固体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，H2O 1000ml，琼脂20g，pH 7.0-7.2)中，30℃培养3d。然后选取饱满、粘稠的T1菌落接种于肉汤液体培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，H2O 1000ml，pH 7.0-7.2)，30℃150rpm振荡培养36h。将发酵液转移至无菌离心瓶中，5000rpm离心5min收集菌体，用无菌去离子水洗涤，重新悬浮，使细胞数量达到5亿CFU/ml以上。
实施例3菌株H3产IAA的能力
根据Gordon和Weber(1951)的测定方法，用试管分装肉汤液体培养基，每管4mL，121℃高温灭菌后加入过滤除菌的2.5mg/mL色氨酸溶液1mL，使培养基中色氨酸的终浓度为0.5mg/mL。将实施例2获得的H3(CCTCC NO：M 2016551)菌悬液接种于上述培养基中，30℃摇床振荡培养3d。发酵液于12000r/min离心5min，取上清液1mL，加入10mM的正磷酸50μL，再加2mL Sackowski's显色剂，充分混合，黑暗下25℃显色30min，于530nm波长下测定吸光值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、40、60mg/L的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。结果表明H3(CCTCC NO：M 2016551)能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达67mg/L。
实施例4菌株H3产铁载体能力
根据王平等的方法测定铁载体。将H3(CCTCC NO：M 2016551)接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，30℃150rpm振荡培养48h。发酵液12000rpm离心5min，取上清液与等体积CAS检测液充分混匀，显色1h后测定630nm波长处的吸光值(A)，以去离子水作对照调零。另以等体积无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基与CAS检测液充分混匀的处理，同法测定吸光值即为参比值(Ar)。A/Ar值<1，可被认为高产铁载体。结果表明H3(CCTCC NO：M 2016551)发酵液的A/Ar为0.1，高产铁载体。
实施例5菌株H3对重金属的抗性
将H3(CCTCC NO：M 2016551)划线接种于含不同重金属浓度的牛肉膏蛋白胨培养基，30℃培养3d，观察其能否生长及生长情况。结果表明，Bacillus megaterium H3能够耐受重金属镉和铜。Cu2+和Cd2+致死浓度均为100mg/L。
实施例6菌株H3对溶液中Cd的去除效果
在三角瓶中加入30mL LB培养基，灭菌后，分别添加过滤灭菌Cd2+储备液，使Cd2+起始浓度为10μM。按1％的接种量将实施例3所获得H3(CCTCC NO：M 2016551)菌悬液接种于含Cd2+浓度为10μM的牛肉膏蛋白胨液体培养基中。设置不接菌和接活菌悬液处理，每个处理设置三个重复。放入30℃恒温培养箱中静置培养，在0、7、14和21d取样。用分光光度计测定样品发酵液在600nm处的吸光度。取7mL发酵液12000rpm离心5min后，用ICP-OES分析上清液中的Cd2+浓度，计算溶液中Cd去除率。由表1可知，H3对溶液中Cd的去除率达到14.0％～90.4％。
表1菌株H3在含镉溶液中的生长及其对镉的去除效果
时间(d) OD<sub>600</sub> Cd去除率(％)
0 0.04±0.00 14.0±1.1
7 2.12±0.13 90.4±2.9
14 2.30±0.22 80.5±2.2
21 2.06±0.23 73.8±8.3
实施例7菌株H3促进水稻生长及降低籽粒中镉含量的作用
土壤取自南京农业大学牌楼试验站水稻田耕层土壤。采用盆栽试验进行，盆内径25cm，高30cm，每盆装土9kg。设置土壤Cd添加量分别为0、2.5和5.0mg/kg，记作Cd 0、Cd 2.5和Cd5.0，外源重金属镉以CdSO4·8H2O水溶液的形式加入土壤中，充分混合后将重金属土壤装入盆中，加入蒸馏水至土层以上2cm，使土壤处于淹水状态，将盆置于温室中田间条件下平衡一个月后栽种植物。
水稻品种武运粳23号稻种用5％次氯酸钠溶液表面消毒15min后，置于0.4％水琼脂上，放入30℃、80％相对湿度的恒温恒湿培养箱中催芽72h。露白后的水稻种子散播于经稀硝酸处理的沙床，培养7d后选取健康、大小均匀一致的苗移植至盆中(每盆4株)，每天绕水至土层表面以上2cm以补充土壤水分的损失。所有处理均放置在网室中随机排位，并间歇性轮换，以保证生长条件一致。等水稻苗生长到三叶一心时，用无菌注射器接种200mL培养至对数生长期的细菌菌悬液接种至距土层表面8cm以下。每间隔30天接种一次细菌菌悬液。以接种等量的无菌水处理为对照，每个处理设3个重复。在水稻抽穗期每盆追施氮磷钾复合肥(N:P2O5:K2O＝15:15:15)1g。收获时，从盆中小心取出植物，根部用去离子水充分洗净，将植物根部浸泡于0.01M EDTA-2Na溶液中10min，以去除植物根表面吸附的重金属离子及沉淀。样品置于烘箱中105℃烘干至恒重，沿根茎结合处分离根部、地上部和籽粒，称取植物干重。将植物干样磨碎后准确称取样品0.200g于消煮管中，用HClO4：HNO3(优级纯，V:V＝13:87)的混合酸液浸泡过夜，消煮后的样品加5％(体积比)HNO3于80℃温浴溶解1h，冷却后定容至10mL，电感耦合等离子发射光谱仪ICP-OES测定溶液中的Cd含量。
从表2可以看出，随着土壤重金属浓度的增加，水稻的生物量呈递减趋势，土壤中5.0mg/kg镉的添加使武运粳23号根部、地上部生物量以及籽粒产量分别比无污染对照组下降了17.5％、9.9％和2.9％。与不接菌对照组相比，在不同重金属浓度下接种菌株H3均能增加水稻各部分器官的生物量，能在一定程度上缓解重金属对水稻的胁迫。在土壤镉含量为2.5和5.0mg/kg时，接种H3可以使籽粒产量分别增加7.7％和13.3％。
表2菌株H3促进水稻武运粳23号生长的作用
Figure BDA0001426194540000061
由表3可知，在不同镉污染处理下，供试菌株H3均能够显著降低水稻武运粳23号各部分器官镉含量，如在土壤Cd浓度为5.0mg/kg时，分别使根部、地上部和籽粒镉含量降低了51.5％、27.8％和37.1％，均达到显著性水平(p<0.05)。
表3菌株H3阻控水稻武运粳23号吸收镉的作用
Figure BDA0001426194540000071
实施例8菌株H3固定土壤镉的作用
以实施例6中的土壤样品为材料，取根际和非根际土壤按1：2的土水比加入煮沸后冷却的去离子水，摇床中150rpm振荡6h，12000rpm离心10min，取上清液用pH计测定pH值。
土壤重金属Cd形态测定釆用Tessier等(1979)提出的重金属形态连续浸提法，并有少许改良。用ICP-OES测定提取液中的Cd含量。
步骤如下：
⑴水溶态：称1.50g过0.25mm筛的土壤样品于50mL离心管内，加入15mL煮沸过的蒸馏水，25℃振荡2h，5000rpm离心6min，收集上清待测其中的重金属含量。
⑵交换态：上述离心后的土壤样仍保留于离心管内，加入15mL 1mol/L的氯化镁(MgCl2)，把管口塞紧密封。25℃振荡2h，5000rpm离心6min，并收集提取液于塑料离心管中，待测其中的重金属含量。往残渣中添加20mL的去离子水后振荡15min进行清洗，离心倒掉上清液，保留固体残渣。
⑶铁(锰)氧化物结合态：上述离心后的土壤样仍保留于离心管内，加入10mL0.04mol/L的羟基盐酸(用25％HAc做溶剂)进行第三步提取。96℃水浴6h，间歇搅拌，5000rpm离心6min，收集上清液于塑料离心管中，待测重金属含量。往残渣中添加20mL的去离子水后振荡15min进行清洗，离心倒掉上清液，保留固体残渣。
⑷有机质及硫化物结合态：上述离心后的土壤样仍保留于离心管内，先加入3mL0.02mol/LHNO3，5mL 30％的过氧化氢溶液，于85℃的水浴锅中水浴2h进行有机质消化；上述消化液快蒸干时，再加3mL 30％的过氧化氢继续消化2h，直到土壤样品中的溶液不冒气泡并且蒸干为止。消化完毕后，冷却离心管内的样品，再按1:50固液比加入5mL 3.2mol/L的醋酸铵(NH4OAc)，并于振荡仪上25℃振荡0.5h。最后，离心并收集提取液，待测备用。
由表4可知，武运粳23号根际和非根际土壤pH范围在7.37-7.99之间，对于所有处理组而言，与无污染对照相比，外源添加镉均使水稻根际和非根际土壤pH值显著升高。在不同浓度镉污染条件下，接种菌株H3均能使水稻武运粳23号根际土壤pH值显著增高。
表4菌株H3对水稻武运粳23号土壤pH的影响
Figure BDA0001426194540000081
由表5可知，在土壤Cd浓度为2.5mg/kg条件下，与不接菌对照相比，菌株H3使武运粳23号根际土可交换态镉的含量显著降低了16.7％(p<0.05)，铁(锰)氧化物结合态镉含量显著增加了17.3％(p<0.05)，有机质及硫化物结合态镉含量增加了16.4％；在土壤Cd浓度为5.0mg/kg条件下，菌株H3使根际土可交换态镉含量显著降低了15.1％，铁(锰)氧化物结合态镉含量显著增加了8.2％(p<0.05)，有机质及硫化物结合态镉含量显著增加了32.4％(p<0.05)。
表5菌株H3对水稻武运粳23号根际土壤不同形态镉含量(mg/kg)的影响
Figure BDA0001426194540000082
实施例9菌株H3与钝化剂联合阻控叶菜吸收重金属的作用
采集江苏省南京市栖霞山矿区周围农田表层土(0-20cm)(32°9′N，118°57′E)，土壤类型为黄棕壤，重金属含量为：总铅含量为325±2.9mg kg-1，总锌含量为278±6.6mg kg-1，总铜含量为77±1.7mg kg-1，总镉含量为2.9±0.12mg kg-1，有机质含量为4.67±0.36g/kg，pH值为6.14±0.19。土样采集后去除植物残体，风干后过5目筛备用。土样采集后去除植物残体，风干，过5mm筛备用。每盆分装1.5kg。选用赤泥和生物炭作为钝化剂，添加量为2％。将表面消毒后的小白菜和生菜种子播种于盆钵中。接种实施例2所得的H3菌悬液10ml，以添加等量121℃灭菌1h的H3菌液作为对照(CK)，设置以下6种不同处理：对照、钝化剂处理(赤泥、生物炭)、菌株H3处理、菌株H3+钝化剂处理(菌株H3+赤泥、菌株H3+生物炭)。盆栽设置时间为60天。
盆栽试验完成后，将叶菜从土壤中小心取出，根部用自来水洗净后用0.01mol/L的EDTA-Na2溶液浸泡10min。将蔬菜分离成2个部分：根部和可食用部分(地上部)。样品分离完成后每部分分成两份，第一份烘干测定干重和重金属含量；第二份保存于4℃，测定鲜样重量和Vc含量。
由表6可知，与CK相比，H3、钝化剂、H3+钝化剂处理均能促进小白菜和生菜的生长，其中生物炭和生物炭+H3处理的小白菜可食用部分鲜重比对照分别显著增加42％和43％，处理生菜鲜重显著增加25％和28％(P<0.05)，赤泥和H3+赤泥处理并没有显著变化。
与对照相比，H3和生物炭+H3处理分别显著增加小白菜Vc含量44％和77％，H3还能促进生菜Vc含量显著增加70％(P<0.05)。赤泥和赤泥+H3处理组Vc含量与CK没有变化。
表6结果表明，与对照相比，各处理均能显著增加小白菜和生菜叶片的叶绿素相对含量，小白菜叶片的叶绿素相对含量增加幅度为生物炭+H3>赤泥+H3>H3>生物炭>赤泥，生菜叶片的叶绿素相对含量增加幅度为生物炭+H3>赤泥+H3>H3>赤泥>生物炭，生物炭+H3处理促进小白菜和生菜叶片的叶绿素相对含量显著增加61％和46％(P<0.05)。
表6菌株H3及其与钝化剂复合对小白菜和生菜鲜重、Vc含量和叶绿素含量的影响
Figure BDA0001426194540000091
与对照相比，各处理均能显著降低小白菜生菜可食用部分Cd含量(见表7)，小白菜Cd含量降低幅度为H3>赤泥>生物炭+H3>生物炭>赤泥+H3，生菜Cd含量降低幅度为赤泥+H3>赤泥>生物炭>生物炭+H3>H3。赤泥和生物炭具有颗粒细小、多孔隙、比表面积大等特征，是良好的吸附材料。生物炭+H3处理促进小白菜和生菜叶片Cd含量分别显著降低29.3％和52.8％。赤泥和赤泥+H3处理能够显著降低生菜叶片Cd含量，降低率分别为58％和88％(P<0.05)，Cd含量分别为0.12mg/kg鲜重和0.07mg/kg鲜重，低于食品安全国家标准(GB2762-2017)中规定叶菜Cd的限量(0.2mg/kg鲜重)，因此赤泥和赤泥+H3处理的生菜已可以安全食用。表7菌株H3及其与钝化剂复合对小白菜和生菜可食用部分Cd含量的影响
Figure BDA0001426194540000101

Claims (1)

1.巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3在提高生菜鲜重、小白菜或生菜Vc含量和叶绿素含量中的应用；所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)H3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年10月10日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2016551。
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