CN108102984B - 一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌bm18-2及其应用 - Google Patents

一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌bm18-2及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽胞杆菌BM18‑2及其应用。一种富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)BM18‑2，2017年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2017679。所述的巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)BM18‑2制备的杂交狼尾草富集镉促生菌剂。本发明所述的BM18‑2在促进镉污染土壤中杂交狼尾草生长中的应用。利用该菌株浸染杂交狼尾草，能够促进其在镉污染土壤环境中健康成长，提高杂交狼尾草的镉含量和生物量，增强对重金属镉污染土壤的修复效率。

Description

一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌BM18-2及 其应用
技术领域
本发明涉及一株富集镉促生长的杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌BM18-2及其应用，属于农业微生物技术领域。
背景技术
据资料统计，目前全国遭受不同程度污染的耕地面积已接近3亿亩，约占耕地总面积的1/6。根据国家《土壤环境质量标准》(GB15618-1995)，当土壤pH≤7.5时，为保障农业生产，维护人体健康的土壤限制值Cd≤0.3mg/kg，依据这个标准，2010年对湖南省资江流域43个土样和湘江流域72个土壤取样检测结果，重金属镉Cd污染问题尤为突出，资江流域土壤Cd超标率达到88.6％，湘江流域Cd超标率为83.34％(重金属污染评价方法评价资江流域土壤重金属风险，环境化学，2011，30(9)；湘江流域土壤重金属污染及其生态环境风险评价，环境科学，2012，33(1)：260-265)，其他省市也均有不同程度的镉污染土壤。
美国科学家Chaney等1983年首次提出了运用植物去除土壤中重金属污染物的设想，此后，人们逐渐将土壤中重金属污染治理的研究重点转向了植物修复技术。植物修复技术是利用某些可以忍耐和超积累有毒金属元素的植物及其共存微生物体系清除污染物的一种土壤修复技术，被认为是一条从根本上解决土壤污染问题的重要途径。杂交狼尾草为二倍体美洲狼尾草不育系与四倍体象草的三倍体远缘杂交种，为禾本科狼尾草属多年生C4植物，镉耐受性较强、生物产量高，为镉污染土壤潜在的修复作物(Xingfeng Zhang,Hanping Xia,Zhian LiPing Zhuang Bo Gao.Potential of four forage grasses inremediation of Cd and Zn contaminated soils，2010，Bioresource Technology，2063-2066)。同时，由于杂交狼尾草不仅是草木复合产品的理想原料(木材/杂交狼尾草复合人造板制造方法，ZL200610166308.9,三聚氰胺树脂浸渍薄木贴面豆胶杂交狼尾草人造板，ZL201420456683.7)，还是重要的生物质能源转化原料(侯新村，范希峰，武菊英，朱毅，张永侠.草本能源植物修复重金属污染土壤的潜力,中国草地学报，2012，34(1)：59-63)，可避免进入食物链和二次污染，实现镉污染土壤修复改良和高附加值产业化利用。因此，分离和筛选获得富集镉促生长的杂交狼尾草内生菌，对应用杂交狼尾草修复镉污染土壤和产业化应用具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是通过对巨大芽孢杆菌BM18菌株进行镉胁迫离体筛选，获得镉耐受性显著提高的巨大芽孢杆菌BM18-2(Bacillus megaterium BM18-2)。
本发明的目的是提供该菌株的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2，2017年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2017679。
所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2制备的杂交狼尾草富集镉促生菌剂。
所述的杂交狼尾草富集镉促生菌剂优选将所述的BM18-2在LB液体培养基中30℃、200rpm振荡培养16～18h得到。
本发明所述的BM18-2在促进镉污染土壤中杂交狼尾草生长中的应用；优选在促进镉浓度≤75mg/kg的土壤中杂交狼尾草生长中的应用。
本发明所述的BM18-2在增强杂交狼尾草对重金属镉污染土壤的修复效率中的应用。
本发明方法适用于狼尾草属植物修复Cd≤75mg/kg重金属污染土壤。
本发明所述的BM18-2在提高杂交狼尾草富集镉能力，促进杂交狼尾草生长中的应用。
有益效果：巨大芽孢杆菌BM18-2在镉浓度为24μΜ的LB固体培养基中生长；巨大芽孢杆菌BM18-2浸染杂交狼尾草种子苗或种茎苗的根系移栽至镉污染土壤中，植株叶、茎、根镉含量、生物产量和镉总吸收量均高于未接种内生菌的阴性对照。利用该菌株浸染杂交狼尾草，能够促进其在镉污染土壤环境中良好生长，提高杂交狼尾草的镉含量和生物量，增强对重金属镉污染土壤的修复效率。
附图说明
图1、BM18-2扫描电镜照片
图2 17种巨大芽孢杆菌的系统进化树分析
图3、产氨性测定照片，从左至右依次为空白、BM18和BM18-2
图4、BM18-2内生于根部的电镜照片
图5、BM18-2内生于幼穗的电镜照片
图6、镉污染大田生长的杂交狼尾草植株；左：阴性对照，右：BM18-2侵染
生物材料保藏信息
巨大芽孢杆菌BM18-2(Bacillus megaterium BM18-2)，保藏日期为2017年11月10日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2017679。
具体实施方式
实施例1
(1)耐镉固氮内生菌BM18-2的获得
发明人前期从江苏盐城新洋试验站大田取孕穗期杂交狼尾草植株，以小于5cm幼穗为外植体，把幼穗消毒后切断至2-3mm接种于MS培养基，从幼穗离体培养再生植株中筛选到了一个内生菌BM18，该菌株能在镉离子浓度18μM的LB固体培养基上生长。取10μL保藏在-18℃质量浓度为50％的甘油中的巨大芽孢杆菌BM18菌液，接种到25mL的LB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养18h,得到对数生长期的活化菌；取上述活化菌液50μL划线接种于添加不同镉离子浓度的LB固体培养基上，30℃恒温培养24h，观察不同镉浓度LB培养基中菌落生长情况；挑取镉离子浓度18μM的LB固体培养基上生长旺盛的菌落，接种于18μM镉浓度的LB固体培养基，30℃恒温培养24h，再挑取生长旺盛的菌落，仍接种于18μM镉浓度的LB固体培养基；挑取继代培养3次生长旺盛的菌落，接种于镉离子浓度20μΜ的LB固体培养基，30℃恒温培养24h，挑取生长旺盛的菌落在含20μΜ镉浓度的LB固体培养基中继代培养2次，再接种于镉离子浓度22μΜ的LB固体培养基中，挑取生长旺盛的菌落在含22μΜ镉浓度的LB固体培养基中继代培养2次，再接种于镉离子浓度24μΜ的LB固体培养基中，挑取生长旺盛的菌落在含24μΜ镉浓度的LB固体培养基中继代培养2次，再接种于镉离子浓度26μΜ的LB固体培养基中继代培养，发现不能正常生长。取24μΜ镉浓度的LB固体培养基中生长旺盛的菌落，划线接种到不含镉的LB固体培养基中继代培养3次；挑取生长旺盛的纯系菌株划线接种于24μΜ镉浓度的LB固体培养基中，挑取生长旺盛的菌株BM18-2，接种于LB液体培养基，30℃，200rpm振荡培养18h,按菌液700μL加入质量浓度为50％的甘油300μL的混合于1.5ml无菌离心管中，共20份，置于-80℃冰箱中冷冻保存。
(2)内生菌BM18-2的生物学特征
BM18-2在LB培养基上生长良好，最适生长温度为30℃，菌落呈圆形，菌落白色不透明，革兰氏阳性，菌体杆状，单个或呈短链状，0.75～1.2μm×3～8μm(图1)。
(3)内生菌BM18-2全基因组重测序分析
取10μL保藏在-80℃质量浓度为50％的BM18-2甘油菌菌液，接种到25mL的LB液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养16～18h,得到对数生长期的活化菌；取BM18-2活化菌液50μL划线接种于含24μΜ镉离子浓度的LB固体培养基中，挑取单克隆菌落接种于300ml的LB培养基中，30℃、200rpm振荡培养16～18h，直至菌液振荡培养至OD600为0.5左右；无菌环境中将菌液移至50ml无菌离心管中，5000rpm离心5分钟，无菌环境中弃去上清液，反复上述步骤6～7次收集BM18-2菌体，用genomic-Tip 500/G试剂盒提取基因组DNA，产物送北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组重测序，测序结果在NCBI国际Genome数据库中全基因组blast分析，与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium QM B1551(NC_014019.1)相似度最高，相似度为84.25％，分析结果表明，BM18-2为巨大芽孢杆菌,17种巨大芽孢杆菌的系统进化树分析见图2。
(3)巨大芽孢杆菌BM18-2固氮和产氨特性检测
固氮能力检测：将活化的巨大芽孢杆菌BM18-2菌液接种于Ashby培养基中，30℃摇床，125rpm振荡培养7d，取20μL菌液至装有Jensen培养基的培养皿中划线培养，3次重复，以接种无菌水为对照，30℃放置7d，观察到接种菌液的培养基中有菌落长出，表明BM18-2具有固氮能力；其中，Ashby培养基配方为：葡萄糖10.0g/L、K2HPO4 0.2g/L、K2SO4 0.2g/L、NaCl0.2g/L、CaCO3 5.0g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L；Jensen培养基配方为：NaMoO4·2H2O 0.012mg/L、CuSO4·7H2O 0.012mg/L、MgSO4·4H2O 0.5mg/L、Na2·EDTA 5.0mg/L、FeSO4·7H2O0.2mg/L、HBO3 5.0mg/L。调节pH为5.8-6.0。
产NH3能力检测：将活化的巨大芽孢杆菌BM18-2菌液接种于蛋白胨水中，3次重复，以接种无菌水为对照，30℃放置48-72h，观察到菌液变浑浊，加入奈斯勒试剂0.5ml于10ml发酵液中，观察到颜色变黄(图3)，说明巨大芽孢杆菌BM18-2具有产氨能力；其中，蛋白胨水配方为：蛋白胨10.0g/L，NaCl 5.0g/L。
实施例2巨大芽孢杆菌BM18-2富集镉促生长大田评价
2017年5月20日，在湖南省种植结构调整的农田，其中0-20cm土层Cd含量0.6564mg/kg、pH值为4.36，20-40cm土层Cd含量为0.5625mg/kg、pH值为4.87，将含8片叶以上的杂交狼尾草种子苗的根系浸泡在OD600值0.5左右的BM18-2菌液和无菌水中2-3h，株行距40cm×50cm移栽至Cd污染的农田中，随机区组设计，每个小区18平方米，每个处理3个重复，苗期施尿素75kg/hm2，生长30d后，施尿素150kg/hm2，2017年10月15日，每个小区随机取2个单株刈割称鲜重，对取样单株进行根、茎、叶分离，75℃烘箱烘干称重，计算干物质产量，分别粉碎叶、茎和根样品，用石墨炉原子吸收分光光度法测定叶、茎、根中的镉含量，计算叶、茎、根的镉吸收总量。结果表明(表1)，与未接内生菌的阴性对照杂交狼尾草相比，接种巨大芽孢杆菌BM18-2的杂交狼尾草平均干物质产量分别提高207.76％、271.92％和178.41％，叶、茎、根中Cd含量分别提高74.24％、15.95％和25.39％；叶、茎、根Cd平均吸收总量分别提高428.98％、249.89％和234.67％；这表明，巨大芽孢杆菌BM18-2增强了杂交狼尾草对镉胁迫抗性能力，促进杂交狼尾草生长和植株不同部位对镉的吸收。
表1内生菌BM18-2浸染对杂交狼尾草富集镉促生长的影响
实施例3巨大芽孢杆菌BM18-2在杂交狼尾草体内定殖鉴定
取实施例2中所述的巨大芽孢杆菌BM18-2浸染和未处理阴性对照的孕穗期杂交狼尾草植株6株，剪取白色2cm左右根和5cm左右的幼穗，用纯水反复冲洗3～4次后，使用2mol/L磷酸缓冲液反复清洗样品表面，样品4℃避光浸泡于2～3％的戊二醛固定液中2小时后，样品分别在50％、70％、80％、90％的酒精中浸泡15min，在100％的酒精浸泡1小时,反复3次，样品彻底脱水后，电子扫描电镜观察，发现内生菌处理的根和幼穗中均有巨大芽孢杆菌BM18-2(图4和图5)，阴性对照根和幼穗中均未发现内生菌。
实施例4巨大芽孢杆菌BM18-2耐镉促生长盆栽鉴定
盆栽原土取自江苏省农业科学院本部农田土壤，土壤容重1.32g/cm3，pH为6.79，Cd含量为0.2004mg/kg，采用氯化镉人工染毒方法设定杂交狼尾草盆栽试验土壤Cd浓度为25,50,75mg/kg，分别记为Cd25、Cd50、Cd75，加上盆栽原始土为对照，记为Cd0，试验在江苏省农业科学院玻璃温室进行，2017年8月31日移栽8-10片叶的杂交狼尾种子苗至盆钵中，土层厚度40cm，每盆1株，3次重复，11月13日取植株地上部分称重，75℃烘箱烘干称重，计算干物质产量，分别粉碎植株地上部分样品，用石墨炉原子吸收分光光度法测定植株中的镉含量，计算植株地上部分的镉吸收总量。结果表明(表2)，与未接种内生菌的阴性对照相比，内生菌BM18-2浸染过的杂交狼尾草植株地上部分干物质产量均显著提高，Cd0、Cd25、Cd50、Cd75分别提高112.22％、64.49％、26.20％和43.99％，植株地上部分镉浓度提高46.11％、12.21％、13.75％和1.34％，植株地上部分镉吸收总量提高233.33％、64.37％、43.28％和60.84％。
表2内生菌BM18-2浸染对杂交狼尾草生物量和镉含量及积累总量的影响

Claims (7)

1.一株杂交狼尾草内生巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2，其特征在于2017年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2017679。
2.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2制备的杂交狼尾草富集镉促生菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于将权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2在LB液体培养基中30℃、200rpm振荡培养16～18h得到所述的杂交狼尾草富集镉促生菌剂。
4.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2在促进镉污染土壤中杂交狼尾草生长中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)BM18-2在促进镉浓度≤75mg/kg的镉污染土壤中杂交狼尾草生长中的应用。
6.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2在增强杂交狼尾草对重金属镉污染土壤的修复效率中的应用。
7.权利要求1所述的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)BM18-2在提高杂交狼尾草富集镉能力，促进杂交狼尾草生长中的应用。
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