CN102220246B

CN102220246B - 蓝莓菌根真菌（晶粒鬼伞）及其分离方法和用途

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Publication number: CN102220246B
Application number: CN2011101288900A
Authority: CN
Inventors: 陶承光; 杨涛; 肇莹; 肖军; 王娜; 龚娜; 陈珣; 王红; 贾东贝; 杨镇
Original assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Liaoning Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-05-18
Filing date: 2011-05-18
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2031-05-18
Also published as: CN102220246A

Abstract

本发明涉及蓝莓菌根真菌（晶粒鬼伞）及其分离方法和用途，属于微生物技术领域，主要是涉及一株从长白山野生越橘属植物根系中分离获得的用于接种蓝莓的菌根真菌及其在促进蓝莓生长和提高产量方面的应用。该蓝莓菌根真菌已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名为：晶粒鬼伞（Coprinusmicaceus），通过对该真菌的应用，可以促进蓝莓根系发育，具有提高产量及坐果率、提高抗虫害作用等优点。

Description

蓝莓菌根真菌(晶粒鬼伞)及其分离方法和用途

一、技术领域：

本发明属于微生物技术领域，主要涉及一株从越橘属植物蓝莓根内分离获得的植物菌根真菌及其分离方法及其在促进蓝莓各阶段生长、防虫害和防冷害等方面的应用。

二、背景技术：

植物菌根菌是指植物根系与真菌所形成的互惠共生体即“菌根”（mycorrhizas），是一种极为普遍的生命活动和生态现象。Frank 1885年首次拟创了“菌根”这个术语，之后若干年一直处于平稳发展期，直到20世纪50年代，菌根学在现代分子生物学和生化技术的辅助下进入迅猛共发展期，尤其是近30年，随着新方法、新技术的不断建立，研究内容更加广泛，菌根学研究已成为一项包括多种学科相互渗透的一门边缘生物科学。

菌根菌的侵染能诱导植物根系形态发生明显变化，影响菌根围各成员的相互作用。Duckett和Read (1995)研究发现Hymenoscyphus ericae分离物能促使假根根尖膨大，并在其细胞内形成菌丝团。菌根菌还可通过分泌H⁺和一些酸性化合物，直接影响到土壤化学特性。大量研究表明，菌根真菌能显著促进植物对土壤中营养物质的吸收、提高植物抗病虫害的作用。接种菌根真菌还可促进各类植物生长、提高产量和品质，并促进组培苗的生长，提高移栽成活率。

蓝莓（Semen Trigonellae）又名越桔，是杜鹃花科（Ericaceae）越橘属(Vaccinium spp.)植物，为多年生落叶或常绿灌木，果实为浆果。在我国原产于高海拔的野生灌木，在吉林长白山分布于海拔1500~2400米的地区。其须根部缺少大部分植物所具有的根毛，需借助合适的菌根菌帮助其吸收水分、矿物质营养等。蓝莓的栽培种类有三大类，即高丛蓝莓、矮丛蓝莓和兔眼蓝莓，均于美国、加拿大等地，经过育种者的驯化，其土壤习性中对于气流的要求降低，但对土壤酸性条件要求依然较高。在缺乏菌根菌的条件下，一般选择施用硫粉调节土壤pH在4左右，更适宜蓝莓生长。但硫粉的实施容易破坏土壤的微环境，对土质造成影响。

通过对栽培区蓝莓菌根菌的调查，在原产地种植的蓝莓菌根化率达到80%以上，对生长情况进行调查，菌根化的蓝莓生长好于未菌根化的蓝莓。

本专利提及的菌根真菌晶粒鬼伞菌（Coprinus micaceus），能够侵染蓝莓根系，并促进植株生长，此前还未见报道。

三、发明内容：

1、发明目的：

本发明涉及一种蓝莓菌根真菌及其分离方法和用途，其目的在于解决以往栽培蓝莓时利用硫粉调节土壤pH时所带来的对土壤造成伤害的问题，通过对该真菌的应用，促进蓝莓生长并提高产量。

2、技术方案：

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种蓝莓菌根真菌，其特征在于：该真菌分类命名：晶粒鬼伞（Coprinus micaceus），在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2010年8月18号，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4063，保藏代号为：MF002。

该真菌的扩增DNA序列如下，该序列是蓝莓菌根真菌分类的分子依据：

AGGGGGAATGGAATACCTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTTCAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTAGTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGGCTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCCGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTCGTACTGAGCTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATACCTTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

一种如上所述蓝莓菌根真菌的分离方法，其特征在于：从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌，步骤如下：

（1）清洗：取新鲜完整的健康野生蓝莓的根，用自来水冲洗一小时，然后用无菌水冲洗2～4次，将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。

（2）消毒：将步骤（1）中待用的根放入体积分数70%的酒精溶液中灭菌20～40s，无菌水冲洗3次，然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒1～3min，冲洗3次，再立即放入质量百分比为1%的无菌硫化钠水溶液中浸1～3min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干待用。

（3）培养：将步骤（2）消毒后待用的根切成0.5~1cm长的小段，置于PDA培养基平板上，25～28℃下恒温倒置培养，设5个重复培养皿，每个培养皿接3个小段。

（4）纯化：待菌丝生长5～7天后，用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无菌培养基上继续纯化培养，直至每一个平板培养基中只含有单一菌落，得到4个菌落。

（5）筛选优势菌株：将步骤（4）中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根的蓝莓苗，观察蓝莓接菌后的生长，将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来，即为所述的蓝莓菌根真菌。

该菌株侵染蓝莓根部后，在显微镜下观察，是菌根共生结构，可以确定其为蓝莓菌根真菌。

上述步骤（3）中将步骤（2）消毒后待用的根切成0.8cm长的小段，置于PDA培养基平板上，25℃下恒温倒置培养效果较好。

一种蓝莓菌根真菌的用途：该蓝莓菌根真菌用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、防虫害、防冷害以及提高产量。

3、优点及效果：

本发明涉及一株蓝莓菌根真菌，该真菌对蓝莓组培阶段、瓶外生根阶段和大田栽培阶段的各品种蓝莓生长均有明显的促进作用。接菌处理的蓝莓对叶甲和蚜虫等害虫具有明确的诱导取食作用，从而减轻害虫的危害；还可以降低栽培蓝莓对土壤低PH值的要求，可以将PH从4左右提高到6左右，且接种本发明菌根菌也可以将土壤PH值从6降到5甚至更低；而且该蓝莓菌根菌还可以提高蓝莓对低温的抗性，在6～10℃的条件下，蓝莓仍可保持生长状态，而不会进入休眠。总之，本发明的这种菌株可以在蓝莓栽培、防虫害、防冷害等方面得到广泛的应用。

四、附图说明：

图1为本发明蓝莓菌根真菌显微镜下菌丝体形态图；

图2为本发明蓝莓菌根真菌扩增DNA序列图；

图3为温度对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图；

图4为pH值对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图；

图5为碳源对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图；

图6为氮源对本发明蓝莓菌根真菌的生长的影响图；

图7为本发明蓝莓菌根真菌对组培苗阶段生长量的影响图；

图8为本发明蓝莓菌根真菌对驯化阶段生长量的影响图；

图9为本发明蓝莓菌根真菌对蓝莓盆栽阶段生长量的影响图。

专利菌种说明：

本专利所涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该真菌分类命名为：晶粒鬼伞（Coprinus micaceus），保藏代号为：MF002，保藏编号为：CGMCC No.4063，保藏日期为2010年8月18日。

五、具体实施方式：

下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的说明，本发明的保护范围不受实施例的限制：

1、蓝莓菌根真菌的筛选及其鉴定：

（1）、筛选

蓝莓菌根真菌的分离方法，其特征在于：从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌，步骤如下：

（5）筛选优势菌株：将步骤（4）中得到的蓝莓菌根真菌菌落继续接种到瓶外生根的蓝莓苗，观察蓝莓接菌后的生长，将对蓝莓苗促进作用最好的菌株筛选出来，即为所述蓝莓菌根真菌，晶粒鬼伞CGMCC4063（MF002）。

上述菌落的直径约为7.5cm左右，白色绒毛状；显微镜下观察，菌丝纤细，偶有分枝，无隔，菌丝宽25～100μm，无分生孢子，有大量菌丝断，粗×长：25μm×50μm。

该菌株侵染蓝莓根部后，在显微镜下观察，可以看到是菌根共生结构，可确定其为蓝莓菌根真菌。

该蓝莓菌根真菌可用于促进蓝莓各个生长阶段的生长、防虫害、防冷害以及提高产量等方面。

（2）、菌株鉴定

晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063的鉴定：

在PDA板上，28℃培养7天后，菌落的直径为7.5cm，白色绒毛状；显微镜下观察，菌丝纤细，偶有分枝，无隔，菌丝宽25～100μm，无分生孢子，有大量菌丝断，粗×长：25μm×50μm。如图1所示为其在显微镜下菌丝体形态图。

对该菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1，5.8S，ITS2和28S区域部分序列进行扩增鉴定：提取菌株的基因组DNA作为模板，采用两条通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTAGATATGC-3’）进行PCR扩增，获得大小约0.6Kb的扩增产物；扩增片段克隆后送由上海生工进行测序，测序获得680个碱基的ITS序列，序列（如图2所示）如下：

AGGGGGAATGGAATACCTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTTCAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTAGTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTCCGAGGCTTGGATTGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCCGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTCGTACTGAGCTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATACCTTTGTCAATTTGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。

将该菌株的上述rDNA-ITS序列在Genbank数据库中进行BLAST比对，结果显示，其序列与Coprinus micaceus的rDNA-ITS区序列同源性达到99%。

通过上述表性特征和分子特征将其鉴定为Coprinus micaceus属真菌，即晶粒鬼伞（Coprinus micaceus），已于2010年8月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，保藏号为CGMCC No.4063，保藏代号：MF002。

2、蓝莓菌根真菌的使用及其对蓝莓各阶段生长情况的研究结果：

（1）、接种晶粒鬼伞CGMCC4063对生根的蓝莓组培苗的影响：

将己生根的蓝莓组培苗转接在蓝莓与蓝莓菌根真菌的共生培养基上，每瓶一株，试验时尽量挑选生长较为一致的组培幼苗，2个月后记录组培苗生长量，并统计接菌处理及对照处理对瓶内蓝莓组培苗的生长势的影响。

实验表明如图7所示，接种蓝莓菌根真菌CGMCC4063对蓝莓组培苗的生长促进作用稍好于对照，接菌处理的生长量比对照（CK）高出36.11%。

（2）、接菌处理对驯化阶段的蓝莓组培苗的影响：

待2个月后形成菌根，用无菌镊子把培养瓶内的琼脂轻轻捣碎，将已形成菌根的蓝莓组培苗从培养基中拔出，然后放入25℃温水中轻轻洗去琼脂培养基，洗去琼脂后将其移植到0.1MPa压力下灭菌2.5小时的营养土上；移植时先用塑料育苗钵盛装己灭菌的培养基质达2/3容器高时，挖定植坑，接入相应菌种，再栽上组培苗，在根部覆盖2～3cm厚的珍珠岩并浇水透湿；然后，放置在光照培养箱中，温度25℃，光照12 h/d，每周浇WPM营养液一次，并进行常规管理；3个月后记录植株生长量。

实验表明如图8所示，接菌对蓝莓组培苗驯化阶段植株的生长势也表现出明显促进作用，接种MF002处理的植株生长量高出对照（CK）134%。

（3）、接种菌根真菌对2年生盆栽蓝莓的影响：

将扩大繁殖的菌根真菌接种在盆栽蓝莓根际周围，20盆重复，每株接种5ml菌液，接种后覆土遮盖植株根系；接种需重复一次，间隔时间为一个月。按照常规方法进行水肥管理，2个月后记录植株生长量及茎粗。

实验表明如图9所示，接菌对2个月的蓝莓苗盆栽阶段对植株生长的促进作用较明显，接种MF002处理的植株生长量高于对照（CK）24.1%。

3、菌根真菌的基础生物学特性研究

晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063生长最适培养基的确定：

（1）、晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063在PDA和MMN培养基上生长情况的比较：

PDA（马铃薯葡萄糖）培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18g，去皮马铃薯煮沸煮沸30min后用蒸馏水将滤液定容至1000mL；

改良MMN培养基：CaCl₂·2H₂O 0.05g，NaCl 0.025g，K₂HPO₄ 0.025g，(NH₄)₂HPO₄：0.25g，MgSO₄·7H₂O：0.15g，维生素B₁：0.1mg，FeCl₃(1%溶液)：1.2ml，葡萄糖：10g，麦芽汁（12.7Be°）：20g，琼脂：20g，蒸馏水：1000ml，pH 5.5。

上述培养基均为121℃，灭菌20min。

在培养皿中倒入20mL融化的上述固体培养基，凝固后得到等厚度固体平板，在平板中央接种直径7mm大小的相同菌龄的晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063（MF002）打孔菌块，每种培养基设3个重复，28℃倒置培养，7天后测量菌落大小；结果表明，在PDA培养基上生长速度最快，其次为MMN培养基。

（2）、晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063生长温度范围研究：

在灭菌后的培养基中倒入改良MMN培养基，冷却后接种生长一致的，直径7mm菌饼，分别置于5，10，15，20，25，30，35℃条件下的恒温箱内培养，每种温度处理设3个重复，接种后第7天采用十字交叉法测量菌落直径，结果表明，如图3所示，在所采用的7个温度中，25℃为其生长最适温度。

（3）、晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063生长pH值范围检测：

将改良MMN培养基（不加琼脂）的pH值分别用1mol/L HCl或1mol/L NaOH调为3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0之后装入50mL三角瓶（25mL/瓶），在121℃、0.05MPa条件下灭菌20min，冷却后每瓶定量接种1块直径为7mm的菌饼，每处理3个重复，在25℃恒温振荡培养（150r/min）7天后进行生物量测定，结果表明，如图4所示，该菌株在供试pH3～9范围内的最佳生长pH值为6。

（4）、不同碳源对晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063生长的影响：

以改良MMN固体培养基为基础培养基，将培养基中的碳源（葡萄糖+麦芽汁）分别用20g/L的葡萄糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉代替，每皿接种一块7mm菌饼，置于25℃恒温箱培养，每处理设3个重复，第7天时测量菌落直径，结果表明，如图5所示，该菌株对麦芽糖和乳糖利用稍好。

（5）、不同氮源对晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）CGMCC4063生长的影响：

分别用0.25g/L的无机氮源（(NH₄)₂HPO₄、NH₄NO₃、KNO₃）和3g/L的有机氮源（蛋白胨）替代培养基中的氮源（（NH₄)₂HPO₄+麦芽汁），每处理重复3次，每皿接种一块7mm菌饼，置于25℃恒温箱培养，每处理设3个重复，第7天时测量菌落直径，结果表明，如图6所示，该菌株对无机氮的利用要好于有机氮，最适氮源为硝酸钾。

4、蚜虫对接种菌根菌的蓝莓叶片取食性的观察：

剪取约20cm长的接菌处理的两年生盆栽蓝莓枝条和未接菌的两年生蓝莓枝条，将枝条插入装有WPM液体培养基的锥形瓶中，在每个处理的叶片上放置10只蚜虫，每隔5小时记录蚜虫数量，相机实时监测。

实验发现，5小时后在接菌的蓝莓枝条上蚜虫产量约为对照的2倍，由此可推测，接菌处理的盆栽蓝莓在菌根真菌的影响下能够产生某种敏感气味，诱导蚜虫倾向于处理后的蓝莓枝条。

实施例1：

一种蓝莓菌根真菌的分离方法，其特征在于：从野生越橘属植物的根际获得菌根真菌，步骤如下：

（1）清洗：取新鲜完整的健康野生蓝莓的根，用自来水冲洗一小时，然后用无菌水冲洗3次，将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。

（2）消毒：将步骤（1）中待用的根放入体积分数70%的酒精溶液中灭菌30s，无菌水冲洗3次，然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒2min，冲洗3次，再立即放入质量百分比为1%的无菌硫化钠水溶液中浸2min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干待用。

（3）培养：将步骤（2）消毒后待用的根切成0.8cm长的小段，置于PDA培养基平板上，25℃下恒温倒置培养，设5个重复培养皿，每个培养皿接3个小段。

（4）纯化：待菌丝培养5天后，用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无菌培养基上继续纯化培养，直至每一个平板培养基中只含有单一菌落，得到4个菌落。

实施例2：

（1）清洗：取新鲜完整的健康野生蓝莓的根，用自来水冲洗一小时，然后用无菌水冲洗2次，将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。

（2）消毒：将步骤（1）中待用的根放入体积分数70%的酒精溶液中灭菌20s，无菌水冲洗3次，然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒1min，冲洗3次，再立即放入质量百分比为1%的无菌硫化钠水溶液中浸3min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干待用。

（3）培养：将步骤（2）消毒后待用的根切成0.5cm长的小段，置于PDA培养基平板上，28℃下恒温倒置培养，设5个重复培养皿，每个培养皿接3个小段。

（4）纯化：待菌丝培养6天后，用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无菌培养基上继续纯化培养，直至每一个平板培养基中只含有单一菌落，得到4个菌落。

实施例3：

（1）清洗：取新鲜完整的健康野生蓝莓的根，用自来水冲洗一小时，然后用无菌水冲洗4次，将根转移到灭过菌的玻璃平皿中待用。

（2）消毒：将步骤（1）中待用的根放入体积分数70%的酒精溶液中灭菌40s，无菌水冲洗3次，然后用体积分数0.1%的升汞溶液消毒3min，冲洗3次，再立即放入质量百分比为1%的无菌硫化钠水溶液中浸1min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干待用。

（3）培养：将步骤（2）消毒后待用的根切成1cm长的小段，置于PDA培养基平板上，27℃下恒温倒置培养，设5个重复培养皿，每个培养皿接3个小段。

（4）纯化：待菌丝生长7天后，用接种环挑取不同形态菌落边缘的菌丝移至新的无菌培养基上继续纯化培养，直至每一个平板培养基中只含有单一菌落，得到4个菌落。

Claims

1.一种蓝莓菌根真菌，其特征在于：该真菌分类命名：晶粒鬼伞（Coprinus micaceus），在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期：2010年8月18号，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.4063，保藏代号为：MF002。

2.根据权利要求1所述的蓝莓菌根真菌，其特征在于：该真菌的扩增DNA序列如下：

3.一种如权利要求1所述的蓝莓菌根真菌的用途，其特征在于：该蓝莓菌根真菌用于促进蓝莓各个生长阶段的生长。