CN106818208B - 一种用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于果树栽培技术领域，具体涉及一种栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法及应用。通过采集杜鹃花菌根的土样，进行菌种的分离纯化、回接到蓝莓植物根系，使菌根侵染率达到52％，而正常栽培的蓝莓菌根不足3％。本发明具有提高蓝莓菌根真菌侵染率的显著效果，同时取材方便、克服了采集野生蓝莓菌根真菌所受到的地理分布的局限性，从而得以更大限度地发挥菌根的有益作用。
Description
技术领域
本发明属于果树栽培技术领域，具体涉及一种栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法及应用。
背景技术
菌根真菌在生态系统营养循环和物质循环过程中扮演着重要的角色，对植物的营养获取和生长等方面具有十分重要的作用。首先菌根真菌能够促进植物的生长，促进植物对氮磷元素的吸收，其次菌根真菌生长及其与植物共生过程中可直接合成或诱导植物产生多种激素类物质，在诱导植物增强抗逆性等方面发挥着重要作用。
土壤中的菌根真菌与寄主根系形成一种互惠共生体称为菌根。研究成果证实VA菌根由于能增加植物对矿质营养特别是磷元素的吸收，提高光合作用速率，对养分平衡和水分利用起重要作用，进而可增强植物抗旱、耐盐碱、抗低温、抗病虫等外部不良环境的能力，促进植物生长并改善其品质。丛枝菌根(AM)是菌根中分布最广泛、最普遍的一类，丛枝菌根具有增加植物对矿质营养的吸收、改善植物生长状况、提高作物产量、改善品质等特性。
菌根真菌的菌丝体能够侵入植物根系的组织和细胞中，通过其侵染达到提高植物对土壤的适应性、促进植物养分吸收、改善植物水分代谢、增强植物耐盐性、提高植物抗病性、改善土壤物理性状、增加植物产量等作用。菌根真菌还可以分泌有机酸，促使一些不易溶解的无机和有机化合物转化为可溶态养分从而被植物吸收。
蓝莓(Vaccinium viti-idaea L.)是杜鹃花科（Ericaceae）越桔属(Vaccinium)多年生灌木。自然条件下蓝莓也会与菌根真菌形成互惠共生关系，它们形成的是一种特殊的菌根结构，即杜鹃花类菌根（又称欧石楠类菌根）。杜鹃花类菌根可以促进宿主植物对营养元素的吸收，缓解环境胁迫，增加植物生长量，增强植物对重金属的抵抗能力等作用。
菌根对蓝莓的营养吸收和生长发育有重要的生理作用。1908年，Wilson在几种越桔属(Vaccinium) 植物的根上发现一种内生菌根的真菌；1910年，Coville首先观察到所有的高丛蓝莓根系均有菌根真菌寄生；Frieslehen于1936 年首次从蓝莓的根系中分离出了菌根真菌；1974年，Read从蓝莓根系分离出一种菌根菌，研究证实菌根对蓝莓生长和生理有着明显的影响； 其后，Darinka在对一年生蓝莓苗移栽时接种菌根菌O. rhodogenum 和O.griseum，发现接种植物生长更为良好，叶面积和干重均有所增加。
在自然条件下野生蓝莓菌根真菌资源丰富，其侵染率可达75%，但在人工栽培条件下蓝莓自身形成菌根比较困难，其菌根真菌侵染率不到3%。然而，由于野生蓝莓分布的地理局限性，利用野生蓝莓培养菌根真菌，进行栽培蓝莓的接种也受到一定的影响。杜鹃花科的植物分布广泛且大多数植物根系都具有菌根真菌。
杜鹃花科( Ericaceae) 约305属3350种植物。分布遍及全世界，除沙漠地区外，广布于南北半球的温带及北半球亚寒带，少数属种分布在环北极或北极，也分布于热带高山。我国有15属，约757 种，分布于全国各地。在我国西南部高山、亚高山的湿润山坡，优势植物群落几乎全为浩瀚的杜鹃灌丛或杜鹃- -苔藓矮曲林。杜鹃花类菌根，也称为欧石楠类菌根，是指杜鹃花科几个属植物根系上形成的菌根，是内生菌根中的一个特殊类型。除野草莓或浆果鹃属(Arbutus)、熊果属( Arctos taphylos) 外，杜鹃花科植物都有明显的杜鹃花类菌根共生。调查研究认为杜鹃花科植物在世界上如此广泛分布，而且大多生境条件恶劣，与其共生真菌有着举足轻重的关系；菌根对杜鹃花类植物的营养吸收、增强对逆境因子的抗性等方面具有重要的作用。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，促进蓝莓植物的生长，增加其对不良环境的抗性，本发明提供一种用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备和应用方法。系采集杜鹃花的根系及土壤样品进行菌种的分离和纯化、并制备成菌根真菌沙土、回接到蓝莓根部的一种方法。从而达到提高菌根真菌侵染率，实现菌根有益效果的目的。
为实现上述目的，本发明采用如下方案，一种用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，包括如下步骤：
（1）、菌根真菌的取样：选取生长健壮的杜鹃花树，在树干周围20cm处向下挖至主要根系分布处，在菌根周围取带有直径小于2mm细根的土样。
（2）、制备土壤稀释液：过滤所取土样，将过滤后土样连同细根一起放入装有无菌水的三角瓶中，振荡摇晃使土与水充分混合，用无菌吸管从中吸取土壤悬液注入盛有无菌水的试管中，制成10-1、10-2、10-3…不同稀释倍数的土壤溶液。
（3）、倒平板：将预先制备的马丁氏培养基熔化，待冷却至55℃~60℃时，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每1ml马丁氏培养基中含有链霉素30-60ug；在无菌操作下向培养皿内注入培养基，平置于桌面上，待凝固后成平板。
（4）、涂布真菌：将步骤（3）中所得的平板分别标上不同稀释倍数，用无菌吸管从土壤稀释液中吸取0.2~0.4ml不同稀释倍数10-1、10-2、10-3…加入到对应稀释倍数的平板中，用无菌玻璃棒在培养基平板表面轻涂均匀。
（5）、培养及挑菌：将上述培养基平板倒置于28℃培养箱培养60~72h；将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到培养基的斜面上于28℃培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，如有其它杂菌混杂，再次进行分离纯化，直至把真菌分纯为止。
（6）、无菌河沙土的制备：向河沙土中加入10wt%稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中的有机质；倒去酸水，用水冲洗至中性；烘干，40目过筛去掉粗颗粒；装入小试管，塞上棉塞，进行灭菌、烘干。
（7）、菌根真菌土的培养：选择培养成熟的优良菌株，用无菌水洗，制成孢子悬液；向每个装有河沙土小试管中加入1.0~1.2ml孢子悬液，以接种针拌匀；放入真空干燥器内，抽干水分，存放备用。
优选的，所述土样含有直径小于2mm细菌根，该土样采用20目筛网过滤，每10g土样用90ml无菌水混合。
优选的，所述链霉素的浓度为10~12mg/ml。
作为本发明一个优选的实施例，所述马丁氏培养基组成为：KH2PO4 1g， MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂 15-20g，水 1000ml，pH 自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml。
优选的，所述步骤（6）中每100ml小试管装2g河沙土。
本发明另一个目的是请求保护上述方法制备的真菌土在蓝莓栽培中的应用，具体应用方法为：在蓝莓生长季，以蓝莓主根基部为中心，直径20~30cm的区域挖坑，使用接种匙将菌根真菌土接入到蓝莓根系附近。
优选的，接种时间每年4-8月份，每株蓝莓只接种一次即可。
有益效果
本发明的有益效果是：该菌根真菌土取材方便，能够方便地采集到分布广泛的杜鹃花植物根系土壤的菌根真菌样品，克服了采集野生蓝莓菌根真菌所受到的地理分布的局限性。菌根接种侵染率高，经过菌种的分离纯化并制备成菌根真菌沙土、回接到蓝莓根系从而大幅提高菌根真菌的侵染率，菌根侵染率达到52%，而正常栽培的蓝莓菌根不足3%。本发明方法通过提高菌根真菌侵染率以更大限度地发挥菌根的有益作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明不以任何形式受限于实施例内容。实施例中所述试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
1、菌根真菌的取样：在大连大黑山选取生长健壮的杜鹃花树，在树干周围20cm处向下挖至主要根系分布处（视树体大小而定，一般30-40cm深度，树体越大主要根系分布越深），观察是否长有菌根（多数杜鹃花都有欧石楠类菌根）。在菌根周围取含有部分2mm以下细根的土样。
2、制备马丁氏培养基，马丁氏培养基组成如下：KH2PO4 1g,MgSO4·7H2O 0.5g ,蛋白胨 5g ,葡萄糖10g ,琼脂 15g，水 1000ml，pH 自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml。该培养基利于菌根真菌的生长。
3、制备土壤稀释液：使用20目筛网过滤所取土样，称取过滤土样连同细根10g，放入装有90ml无菌水的三角瓶中，振荡摇晃20min，使土与水充分混合。使用1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，并振荡摇晃混匀。然后再用一支吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4的四种稀释倍数的土壤溶液。
4、倒平板：将上述马丁氏培养基熔化，待冷却至55℃时，向马丁氏培养基中加入浓度为10mg/ml链霉素溶液，使得每毫升培养基中含有链霉素50ug。然后，在无菌操作下向培养皿内注入培养基15ml左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使得培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后成平板。
5、涂布真菌：将上述培养基的平板分别标上10-1、10-2、10-3、10-4四种稀释倍数，然后用4支1ml无菌吸管分别由10-1、10-2、10-3、10-4四管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放于已经标好稀释倍数的平板中，用无菌玻璃棒在培养基平板表面轻涂均匀。
6、培养及挑菌：将上述培养基平板倒置于28℃培养箱培养72小时；将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到培养基的斜面上，置于28℃培养，获得单纯菌苔。
7、无菌河沙土的制备：取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中的有机质；倒去酸水，用自来水冲洗至中性；烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒；装入小试管（10×100ml），每管装2g左右，塞上棉塞，进行灭菌、烘干。
8、菌根真菌土的培养：选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的）优良菌株，以无菌水洗下，制成孢子悬液；于每沙土管中加入约1.0ml（刚刚使沙土湿润为宜）孢子悬液，以接种针拌匀；放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分。存放于冰箱或室内干燥处备用。
实施例2
本实施例与实施例1的区别仅在于步骤4中链霉素浓度及冷却温度不同。
本实施例步骤4为：将马丁氏培养基熔化，待冷却至60℃时，向培养基中加入浓度为12mg/ml链霉素溶液，使得每毫升培养基中含有链霉素60ug。然后，在无菌操作下向培养皿内注入培养基15ml左右，加盖后轻轻摇动培养皿，使得培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后成平板。
应用例
4月份在蓝莓生长季，选取300株蓝莓进行接种，在蓝莓植物的根系周边20cm的区域挖坑，挖坑深度为蓝莓根系主要分布区域，然后使用接种匙将实施例1制备的菌根真菌土接入到蓝莓根系附近。
接种率调查：于接种后的第30天调查菌根真菌侵染率，随机抽取回接菌根真菌的蓝莓树100株，并抽取100株未接种蓝莓树作为对照，调查结果显示，使用本方法接种的菌根真菌侵染率达到52%，而对照蓝莓树的菌根只有1%。由此可见其间的差异性极其显著，回接菌根真菌极大地提高了菌根的侵染率。
Claims (7)
1.一种用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）、菌根真菌的取样：选取生长健壮的杜鹃花树，在树干周围20cm处向下挖至主要根系分布处，在菌根周围取土样；
（2）、制备土壤稀释液：过滤所取土样，将过滤后土样连同细根一起放入装有无菌水的三角瓶中，振荡摇晃使土与水充分混合，用无菌吸管从中吸取土壤悬液注入盛有无菌水的试管中，制成10-1、10-2、10-3…不同稀释倍数的土壤溶液；
（3）、倒平板：将预先制备的马丁氏培养基熔化，待冷却至55℃~60℃时，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每1ml马丁氏培养基中含有链霉素30-60ug；在无菌操作下向培养皿内注入培养基，平置于桌面上，待凝固后成平板；
（4）、涂布真菌：将步骤（3）中所得的平板分别标上不同稀释倍数，用无菌吸管从土壤稀释液中吸取0.2~0.4ml不同稀释倍数10-1、10-2、10-3…加入到对应稀释倍数的平板中，用无菌玻璃棒在培养基平板表面轻涂均匀；
（5）、培养及挑菌：将上述培养基平板倒置于28℃培养箱培养60~72h；将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到培养基的斜面上于28℃培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，如有其它杂菌混杂，再次进行分离纯化，直至把真菌分纯为止；
（6）、无菌河沙土的制备：向河沙土中加入10wt%稀盐酸，加热煮沸30min；倒去酸水，用水冲洗至中性；烘干，40目过筛去掉粗颗粒；装入小试管，塞上棉塞，进行灭菌、烘干；
（7）、菌根真菌土的培养：选择培养成熟的优良菌株，用无菌水洗，制成孢子悬液；向每个装有河沙土小试管中加入1.0~1.2ml孢子悬液，以接种针拌匀；放入真空干燥器内，抽干水分，存放于冰箱或室内干燥处备用。
2.根据权利要求1所述的用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，其特征在于，所述土样含有直径小于2mm细菌根，该土样采用20目筛网过滤，每10g土样用90ml无菌水混合。
3.根据权利要求1所述的用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，其特征在于，所述链霉素的浓度为10~12mg/ml。
4. 根据权利要求1所述的用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，其特征在于，所述马丁氏培养基组成为：KH2PO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 10g，琼脂 15-20g，水 1000ml，pH自然，1%孟加拉红水溶液3.3ml。
5.根据权利要求1所述的用于栽培蓝莓的菌根真菌土的制备方法，其特征在于，所述步骤（6）中每100ml小试管装2g河沙土。
6.由权利要求1所述方法制备的真菌土在蓝莓栽培中的应用，其特征在于，在蓝莓生长季，选取需接菌的蓝莓，以蓝莓主根基部为中心，直径20~30cm的区域挖坑，使用接种匙将菌根真菌土接入到蓝莓根系附近。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，接种时间每年4-8月份，每株蓝莓只接种一次即可。
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