CN104818236B - 一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌及其应用 - Google Patents

一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌及其应用 Download PDF

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本发明公开了一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌，其分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，菌株号JW‑CZ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2015095，保藏日期为2015年3月10日。本发明还公开了上述粘质沙雷氏菌在促进茶树生长中的应用。JW‑CZ2菌株对难溶性磷酸盐磷酸三钙、磷酸镁和磷酸铁均具有较强溶解能力；JW‑CZ2菌株具有分泌IAA的能力和产ACC脱氨酶的能力；JW‑CZ2菌剂接种茶树实生苗，该菌剂能明显促进茶树苗的生长。因此，本发明能为将来开发茶树专用微生物肥料提供优良的菌株资源。

Description

一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌及其应用
技术领域
本发明属于生物肥料领域中的微生物肥料技术领域，具体涉及一种茶树根际促生菌粘质沙雷氏菌及其应用。
背景技术
茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze]属山茶科山茶属茶树种，是一种多年生、木本、常绿植物，具有保水固土、调节气候、文化旅游等价值，是我国重要的经济作物之一(林生等，2012)。据统计，截止2012年我国茶园面积3529万亩，约占全国耕地面积的1.15％，居世界第一位(农业部种植业管理司，2012)。以茶树的营养嫩梢为原料制成的茶叶，因具有丰富的营养物质和良好的医疗保健功效而被世界公认为三大饮料(茶、咖啡、可可)之一。然而，每年多次采摘新生的绿色营养嫩梢，带走了茶园大量养分，易造成地力衰退，再加上我国茶产区经常出现强光、季节性干旱、低温和土壤污染等引起的非生物逆境，而茶树耐荫、喜湿的习性，更易遭受逆境的胁迫，严重影响了茶树的正常生长，降低了茶叶产量与品质，影响了整个产茶区的经济发展(胡磊等，2010)。目前，主要是靠采取增施肥料、改进栽培措施和培育抗逆性强的品种等措施来防止茶园地力衰退和提高茶树抗逆能力。然而这些措施因投入大、周期长、见效慢或存在环境风险等问题而受到一定局限。因此，探寻新的途径以促进茶树生长发育的研究备受关注。
植物根际促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是指一类能自由生活于土壤中并可直接或间接有益于植物生长的微生物(Hayat R.et al.,2010；Compant S.et al.,2010)。植物根际促生菌能够活化土壤养分，提高土壤养分资源的利用效率，改善土壤微生物区系，抑制土壤中有害病原菌等(康贻军等，2010；Tan et al.,2013)；在一定程度上可替代农药、化肥等应用于农业生产，减少化学产品对环境及人类健康造成危害，实现农业的可持续发展。植物根际促生菌可以通过多种作用途径促进植物生长，其中主要的促生机制包括：(1)溶解矿质养分(Parmar et al.,2013)，共生固氮(Jameset al.,2012)；(2)产生调节植物生长的信号物质(Hayat R.et al.,2010)，如吲哚乙酸、细胞分裂素、赤霉素等(Kang et al.,2014)；(3)拮抗病原微生物(Avis.et al.,2008)。目前，国内外对植物根际促生菌的研究报道较多，但绝大部分植物根际促生菌方面的研究主要集中于番茄、辣椒、黄瓜等蔬菜瓜果类和小麦、豆科等粮食作物(Nautiyal,1999)，并已发现多个种属的土壤微生物具有促生潜能，包括不动杆菌属(Acinetobacter spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、固氮菌属(Azotobacter spp.)、农杆菌属(Agrobacterium spp.)、埃文氏菌属(Erwiniaspp.)、黄杆菌属(Flavobacterium spp.)、沙雷氏菌(Serratia spp.)等(Lugtenberg.etal.,2009；Hayat R.et al.,2010)。然而，植物促生菌对植物有一定的种属专一性和生境选择性。针对我国不同气候、生境中分离筛选植物促生菌株，以生产适应不同地区和作物的生物菌剂及其生物有机肥是有必要的。因此，开展茶树根际促生菌的筛选，将能丰富我国农林业微生物种质资源库，为茶树专用菌肥的开发与应用提供重要的理论依据和技术支撑，对保护我国茶园土壤环境、提高茶叶产量与品质和促进产茶区经济的发展均具有重要指导意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种茶树根际促生菌粘质沙雷氏菌。
本发明还要解决的一个技术问题是提供上述茶树根际促生菌粘质沙雷氏菌的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌，其分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，菌株号JW-CZ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015095，保藏日期为2015年3月10日。该菌株是2014年6月从安徽省池州市青阳县茶树根际土壤中，筛选获得的。
JW-CZ2菌株的主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨培养基平板上生长良好，菌落红色，表明光滑不透明，边缘整齐，稍突，菌株细胞呈短杆状，无荚膜、无芽孢，革兰氏染色阴性；好氧，葡萄糖发酵、接触酶、V-P测定、明胶液化、硝酸还原、柠檬酸盐利用试验中均显示阳性；硫化氢、吲哚、甲基红(MR)、丙二酸利用试验中显示阴性。
JW-CZ2菌株16SrDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。
将所测16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对，结果表明：菌株JW-CZ2与粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)同源性都很高，与Serratia marcescens的相似度为99％。结合形态、生理生化特征及16SrDNA序列分析，鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
上述粘质沙雷氏菌JW-CZ2在促进茶树生长中的应用也在本发明的保护范围之内。CCTCC NO：M 2015095菌株菌剂盆栽接种试验表明，该菌剂明显促进了茶树的生长发育。
上述粘质沙雷氏菌JW-CZ2具有较强的溶磷能力，可以高产吲哚乙酸(IAA)和1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明所提供的植物根际促生菌粘质沙雷氏菌CCTCC NO：M 2015095对磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸铁(FePO4)和磷酸镁(Mg3(PO4)2)均具有较强溶解效果。
(2)本发明所提供的植物根际促生菌粘质沙雷氏菌CCTCC NO：M 2015095具有较强分泌吲哚乙酸(IAA)的能力，该菌株可以通过提供植物所短缺的物质IAA直接影响新陈代谢来刺激其生长。
(3)本发明所提供的植物根际促生菌粘质沙雷氏菌CCTCC NO：M 2015095具有较强的合成ACC脱氨酶的能力，该菌株能够将乙烯合成的前体物1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)水解，从而降低乙烯的水平，进而抑制乙烯对植物的三重反应，促进植物根和茎伸长、生长，提高养分吸收和光捕获面积，增加干物质积累，且能扩增的根部组织能增强植物对根际微生物分泌或分解的促生物质和养分的有效利用。
(4)本发明所提供的植物根际促生菌粘质沙雷氏菌CCTCC NO：M 2015095制成菌剂接种茶树实生苗。该菌剂能明显促进茶树的生长发育，本发明为将来开发茶树专用微生物肥料提供了优良的菌株资源。
附图说明
粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)JW-CZ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2015095，保藏日期：2015年3月10日。
图1为JW-CZ2菌株对不同难溶性磷的溶解能力；
图2为JW-CZ2菌株产IAA能力的定性分析；
图3为JW-CZ2菌株产IAA能力的定量分析；
图4为JW-CZ2菌株对茶树接种的促生效果。
具体实施方式
根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：JW-CZ2菌株溶磷磷能力测定。
溶磷培养基A：葡萄糖10g，Ca3(PO4)25g，MgCl25g，KCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.25g，(NH4)2SO40.1g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。
溶磷培养基B：采用磷酸铁(FePO4)、磷酸镁(Mg3(PO4)2)代替溶磷培养基A中的磷酸三钙(Ca3(PO4)2)，其它成分和含量相同。将活化2次的JW-CZ2菌株接种NB培养基(牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂18.0g，pH7.2～7.4)中，30℃培养18-24后制成JW-CZ2种子液，按1％的接种量接种于含50mL NBRIP培养基的100mL三角瓶中，以接种NB培养基的NBRIP培养基为对照(CK)，每个处理3个重复，30℃，200r/min振荡培养72h后，发酵液4℃，10000r/min离心10min，采用钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量。
从图1中可看出，以磷酸三钙(Ca3(PO4)2)为唯一磷源时，发酵液可溶性磷含量达806.06mg·L-1；以磷酸铁(FePO4)为唯一磷源时，发酵液可溶性磷含量达42.89mg·L-1；以磷酸镁(Mg3(PO4)2)为唯一磷源时，发发酵液可溶性磷含量达48.84mg·L-1。综上表明，JW-CZ2菌株对磷酸三钙(Ca3(PO4)2)、磷酸镁(Mg3(PO4)2)、磷酸铁(FePO4)均具有较强的溶解解能力。
实施例2：JW-CZ2菌株产IAA定性分析。
将JW-CZ2菌株接种在NA液体培养基中培养12h(28℃、120r/min)后，用无菌水调节OD600值为0.05，取0.1mL供试菌悬浮液分别接到不含色氨酸的King培养液和含有100mg/L色氨酸的King培养液中，每三角瓶盛有50mL的培养液,重复3次，以加0.1mL无菌水的培养液为空白对照，一起置于28℃、转速为120r/min的控温振荡器中培养12d。分别取测试菌菌悬浮液和空白对照50μL各加入50μL比色液，置室温下，静置15min内观察其颜色变化，3个重复均变红为阳性，表示能分泌IAA；颜色越深表示分泌数量多；3个重复均不变色为阴性，表示不分泌IAA。从图2中可看出，JW-CZ2菌株具有较强的产IAA的能力。
实施例3：JW-CZ2菌株产IAA定量分析。
将供试菌株接种king培养基摇瓶培养3d。首先用分光光度法测定菌悬液的OD600值。然后将菌悬液10000r/min离心10min，取上清液1mL加入等体积Salkowski比色液，避光静置30min，进行显色。采用分光光度法测定其OD530值。计算菌浓度OD600值为1时，单位体积菌悬液中细菌分泌IAA的量。标准曲线的绘制采用分析纯的IAA梯度稀释制备。
比色液的配制：S1比色液的配制：称取FeCl312g溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入429.7mL 98％H2SO4，待冷却后定容至1L，测定范围0.3-20mg/L。S2比色液的配制：将4.5gFeCl3溶于300mL蒸馏水，然后缓慢加入587.4mL 98％的H2SO4，待冷却后定容至1L，测定IAA范围5-200mg/L。从图3中可看出，JW-CZ2菌株菌悬液中IAA的含量为7.27μg/mL。
实施例4：JW-CZ2菌株产ACC脱氨酶能力测定
将JW-CZ2接种至20mL TSB液体培养基中，在28℃、200r/min条件下振荡培养12h，之后于4℃、8000r/min离心10min，收集菌体沉淀。将菌体重新悬浮在7.5mL无氮源的DF培养基中，并加入45μL经过滤灭菌的0.5mol/mL ACC溶液，使ACC终浓度为3.0mol/mL，然后在28℃、200r/min条件下振荡培养24h以诱导细菌的ACC脱氨酶活性。将上述菌悬液在4℃、8000r/min离心10min，去除上清液，收集菌体沉淀，重新悬浮于5mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)中，再4℃、8000r/min离心10min后收集沉淀，该步骤重复3次以彻底去除DF培养基。向菌体沉淀中加入1mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.6)以悬浮菌体，然后转移至1.5mL离心管中，16000r/min下离心5min；之后将菌体沉淀再次悬浮于600μL 0.1mol/LTris-HCl缓冲液(pH 8.5)中，加入30μL甲苯，漩涡振荡30s以破碎菌体。吸取200μL破碎细胞菌悬液，加入20μL 0.5mol/L ACC溶液，混匀后于30℃条件下水浴15min。然后向其中加入1mL 0.56mol/L HCl混匀，室温下16000r/min离心5min。取上述离心上清液1mL，加入800μL0.56mol/L HCl，混匀后再加入300μL 2，4－二硝基苯肼(使用2mol/L HCl溶解，质量浓度为2g/L)，30℃下水浴30min。然后，加入2mL 2mol/L NaOH显色，用紫外可见分光光度计(U-2900，日本Hitachi公司)在540nm下测定其吸光值(OD540)，以蒸馏水代替菌悬液的处理作为对照。
用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)配制0.2，0.4，0.6，0.8和1.0mmol/mL的标准α－丁酮酸梯度溶液，并向其中分别加入300μL的2，4－二硝基苯肼(使用2mol/L HCl溶解，质量浓度为2g/L)，混匀后于30℃下水浴30min。然后加入2mol/L NaOH显色，稳定后测定其OD540，以0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)溶液做空白对照。按照α－丁酮酸溶液浓度及其对应的吸光值制作标准曲线，求其回归方程。
将样品的OD540代入标准曲线回归方程得到其中α－丁酮酸的含量，计算每min ACC脱氨酶催化ACC生成α－丁酮酸的物质的量(μmol)，即为1个单位酶活力(U)。利用考马斯亮蓝G-250法，测定剩余菌悬浮液中的蛋白质含量，以牛血清蛋白(BSA，国药集团生产)为对照。用单位酶活力除以总蛋白质量即为比活力(U/mg)，以此表示细菌的ACC脱氨酶活性。结果表明，JW-CZ2菌株具有产ACC脱氨酶的能力，ACC脱氨酶活性为1.08U/mg。
实施例5：JW-CZ2菌株温室盆栽试验。
将JW-CZ2菌株活化2～3次后，用接种环挑取少量菌体接种于含有50mL NB培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2～7.4)150mL三角瓶中，30℃，180r/min振荡培养48h。发酵液(4℃，6000r/min)离心5min，用无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节菌悬液(108cfu/mL)制成菌剂。接种3月生茶树苗，以等量无菌生理盐水为对照，接种量为5mL/株。每处理8个重复，置于温室统一管理，适时浇水。
JW-CZ2菌株接种6个月后对茶树实生苗生长的影响(见表1)。从表1和图4可看出，接种JW-CZ2菌剂对茶树的生长具有明显的促进作用，显著提高了茶树的苗高和地径(P<0.05)。其中，茶树苗的苗高和地径分别比CK增长了53.56％和18.96％。
表1 JW-CZ2对茶树实生苗生长的影响
注：P<0.05，同行不同列小写字母不相同代表差异显著。

Claims (2)

1.一种茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌，其分类命名为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，菌株号JW-CZ2，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2015095，保藏日期为2015年3月10日。
2.权利要求1所述的茶树根际促生细菌粘质沙雷氏菌在促进茶树生长中的应用。
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