CN104004666B - 一株能促进杉木生长的内生真菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一株能促进杉木生长的内生真菌，包括其分离、提纯、接种与培养接及其应用方法，该真菌为柱孢属（Cylindrocarpon<i>？sp.</i>）CG2菌株，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC？NO.9188。本发明涉及的菌株是从杉木植株中分离纯化得到的，经接种于杉木组培苗，根据光合作用和生物学特性的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有促进作用，寻找到对促进植株生长的有益的功能内生真菌可应用于生产。

Description

一株能促进杉木生长的内生真菌

技术领域

该发明涉及一株能促进杉木生长的内生真菌（Cylindrocarponsp.），包括其分离、提纯、接种与培养接及其应用方法。

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草LoliumtemulentumL.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。

谢卿媚和黄建河（1985）对杉木内生菌根的形态特征及菌根真菌的鉴定，主要以杉根皮层组织与内生菌根真菌的共生结构作解剖学分析及以湿筛—倾析法从根际土中获得的菌丝与厚垣孢子进行观察。结果表明，根据杉木内生菌根的解剖学分析与根际土壤中厚垣孢子的形态结构特征，确定杉木内生菌根是属于泡囊一丛枝型内生菌根（简称VA菌根）。进一步研究杉木内生菌根对杉木的生长发育及抗性方面的效应，充分合理的利用内生菌根制剂促进杉木生长的问题，具有重大的经济价值。特别是在我国南方养分瘠薄的红壤地区，研究内生菌根增强土壤中磷素的吸收，是当前南方红壤地区杉木速生丰产中亟待解决的重要问题。综上可知，关于杉木的内生真菌方面的研究仅从根部位进行鉴定研究，而对杉木叶部位和茎部位均未涉及内生真菌的研究。此外，有关内生真菌对杉木自身生长的影响研究还存在空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能促进杉木生长的内生真菌，提供一株能促进杉木生长的内生真菌分离、提纯、培养及其应用方法。

本发明提供的一株能促进杉木生长的内生真菌（Cylindrocarponsp.），从杉木根部分离、纯化获得，其菌落呈柔软的绒毛状、分生孢子座方式产孢。瓶梗圆柱形，具有开放的顶孔和短的领状物，从中产生无色的、壁光滑的粘质状的分生孢子。大分生孢子，圆柱形，两端钝圆，弯曲，有一个横隔膜。该真菌为柱孢属（Cylindrocarponsp.）CG2菌株，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCCNO.9188。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

该菌的分离、纯化包括：

A、材料：将采集得到不同年份的根、茎段、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

B、消毒：70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；

C、接种部位的选择：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝条：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；

D、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Cylindrocarponsp.功能菌株；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

上述的一种能促进杉木生长的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48-72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一种能促进杉木生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液，苗木栽植前期蘸根和用于林地浇根。

上述的一种能促进杉木生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是用9.0×10⁵cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株杉木的根际。

上述的一种能促进杉木生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0×10⁵cfu/ml在水培苗栽植前将苗蘸根10min。

本发明涉及的菌株是从杉木植株中分离纯化得到的，经接种于杉木组培苗，根据光合作用和生物学特性的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有促进作用，寻找到对促进植株生长的有益的功能内生真菌可应用于生产。

菌株CG2在浇根方式（R）下对植株的苗高的增长率为11.44%，对地径的增长率为10.87%；在淋冠方式（G）下对植株的苗高的增长率为15.03%，对地径的增长率为12.73%。而对照组植株的苗高和地径的增长率分别为7.31%和6.94%。上述两种接菌方式下，CG2的促生作用均很显著。

从根冠比指标看，在G处理下的根冠比要大于R处理，且接种CG2幼苗的根冠比在G处理和R处理分别比对照高17.76%和10.82%。从生物量指标看，G处理下的植株生物量却小于R处理，且接种CG2幼苗的根冠比在G处理和R处理分别比对照高64.29%和74.16%。综上分析，CG2菌株不论是在G处理或R处理下都比对照更能够促进根系的生长，且G处理的促生效果优于R处理。

接种菌株CG2的植株地上部分和地下部分的氮含量，均比对照组高；在G处理下分别高17.99%和23.79%，R处理下分别高23.84%和6.32%。接种菌株幼苗的地上部分和地下部分的碳含量在G处理下分别高10.62%和8.28%，R处理下分别高9.56%和7.05%。

附图说明

图1内生真菌CG2对杉木幼苗生物量和根冠比的影响。

具体实施方式

实施例1

1、水培繁殖中的应用

取配制好的上述内生真菌应用菌液，制成5.0×10⁵cfu/ml菌液，在组培苗栽植前蘸根10min。可提高植苗成活率10%以上。

2、根际土壤浇施应用

本试验采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省林科院提供的杉木组培苗。选择长势一致的苗木于2013年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。所用土壤是严格经过熏蒸消毒的黄心土。经过称量，每盆放入等量的3kg土壤。经过两个月的恢复性生长，连续三天（7月5日、7月6日和7月7日）分别于杉木根际（R）和树冠（G）施入相同浓度的100mL菌液。利用上述试验获得的共5个优势菌种，每种菌液4个重复，用水溶液作为空白对照。接种60天后进行各项指标的测定。

菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×10⁶cfu/mL。

苗高地径测定

钢尺测定苗高，数显游标卡尺测定地径。

生物量测定

将植株的不同部位分别标号放入已知重量（W1）的铝盒中，放入烘箱105℃烘干半小时（钝化酶），在70℃下烘干，经过10h后，取出铝盒放入干燥箱中冷却至室温，称重后再放入烘箱中，重复测定直至恒重为止。称得铝盒和样品的总重量（W2），则样品干重为W2-W1。

本试验中根冠比指标采用植株干物质的质量比。地面以下，主要是根系，为地下部分；地面以上，主要是茎和叶，为地上部分。

植株碳含量和氮含量测定

植株碳含量和全氮含量采用CHNS元素分析仪（德国Elementar公司）进行测定，每个样品重复测两次。

2.4数据处理

数据整理与初步处理采用Excel2003，作图采用Origin8.0，数据的统计学分析采用SPSS18.0。

结果与分析

不同菌种对杉木幼苗苗高和地径的影响

由表1可知，从不同处理角度分析，采用浇根方式（R）对植物生长的促进作用大多数情况要大于淋冠方式（G）的促进作用。菌株CG2在浇根方式（R）下对植株的苗高的增长率为11.44%，对地径的增长率为10.87%；在淋冠方式（G）下对植株的苗高的增长率为15.03%，对地径的增长率为12.73%。而对照组植株的苗高和地径的增长率分别为7.31%和6.94%。但在上述两种接菌方式下，CG2的促生作用均很显著。

表1不同内生真菌对杉木幼苗苗高和地径的影响

注：表中数据为四个重复的均值±标准差。

不同菌种对杉木幼苗根冠比和生物量的影响

由图1可知，与对照相比，接种菌株CG2的幼苗根冠比和生物量在淋冠方式（G）和浇根方式（R）两种处理下均要大。从根冠比指标看，在G处理下的根冠比要大于R处理，且接种CG2幼苗的根冠比在G处理和R处理分别比对照高17.76%和10.82%。从生物量指标看，G处理下的植株生物量却小于R处理，且接种CG2幼苗的根冠比在G处理和R处理分别比对照高64.29%和74.16%。综上，CG2菌株不论是在G处理或R处理下都比对照更能够促进根系的生长，且G处理的促生效果优于R处理。

不同菌种对杉木幼苗植株碳氮含量的影响

由表2可以看出，接种菌株CG2的植株地上部分和地下部分的氮含量，均比对照组高；在G处理下分别高17.99%和23.79%，R处理下分别高23.84%和6.32%。接种菌株幼苗的地上部分和地下部分的碳含量在G处理下分别高10.62%和8.28%，R处理下分别高9.56%和7.05%。

表2不同菌种对杉木幼苗植株碳氮含量的影响

注：表中数据为四个重复的均值±标准差。

本发明发现一株能促进杉木生长的内生真菌，将该株杉木内生真菌菌株采用浇根和淋冠两种方法接种于杉木幼苗。通过接种后植株的测定试验，得出菌株的苗高地径、根冠比、生物量以及碳氮含量的表现均优于对照，表明其对于促进杉木生长具有很大功用，且浇根的接种方式优于淋冠。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一株能促进杉木生长的内生真菌，其特征在于：该真菌为柱孢属（Cylindrocarponsp.）CG2菌株，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCCNO.9188。

2.一种如权利要求1所述的一株能促进杉木生长的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述的应用菌液制备方法为，将权利要求1中所述柱孢属（Cylindrocarponsp.）CG2菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48-72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

3.一种如权利要求2所述的一株能促进杉木生长的内生真菌的应用菌液在杉木水培繁殖及根际土壤浇施中的应用。