CN104004664B - 一株能提高杉木光合作用的内生真菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株能提高杉木光合作用的内生真菌。所述内生真菌为刺盘孢（<i>Colletotrichum</i><i>sp.</i>）AJ4，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC？No.9227。通过应用该菌株的菌液，可以进行杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。本发明涉及的菌株通过接种后植株的测定试验，得出植株的叶绿素含量以及叶绿素荧光参数表现均优于对照，且浇根的接种方式优于淋冠，表明其对于杉木光合作用具有很大提高作用。

Description

一株能提高杉木光合作用的内生真菌

技术领域

本发明涉及一株能提高杉木光合作用的内生真菌。

背景技术

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草LoliumtemulentumL.种子中分离出第一株内生菌^[1]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌^[2]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌^[3-4]、具有抗病虫害的生防菌^[5-7]和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。

谢卿媚和黄建河（1985）^[8]对杉木内生菌根的形态特征及菌根真菌的鉴定，主要以杉根皮层组织与内生菌根真菌的共生结构作解剖学分析及以湿筛—倾析法从根际土中获得的菌丝与厚垣孢子进行观察。结果表明，根据杉木内生菌根的解剖学分析与根际土壤中厚垣孢子的形态结构特征，确定杉木内生菌根是属于泡囊一丛枝型内生菌根（简称VA菌根）。进一步研究杉木内生菌根对杉木的生长发育及抗性方面的效应，充分合理的利用内生菌根制剂促进杉木生长的问题，具有重大的经济价值。特别是在我国南方养分瘠薄的红壤地区，研究内生菌根增强土壤中磷素的吸收，是当前南方红壤地区杉木速生丰产中亟待解决的重要问题。综上可知，关于杉木的内生真菌方面的研究仅从根部位进行鉴定研究，而对杉木叶部位和茎部位均未涉及内生真菌的研究。此外，有关内生真菌对杉木自身生长的影响研究还存在空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能提高杉木光合作用的内生真菌。

本发明提供的一株能提高杉木光合作用的内生真菌，为刺盘孢（Colletotrichumsp.）AJ4，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.9227。

该菌的分离、纯化包括：

A、材料：将采集得到不同年份的杉木根、茎段、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；

B、消毒：70%酒精浸泡30s——无菌水浸洗一次——10%次氯酸钠浸泡7min——无菌水浸洗一次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法^[9-11]；

C、接种部位的选择：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝条：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；

D、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化。

固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Colletotrichumsp.功能菌株；

其分生孢子盘呈盘形或垫状,黑褐色,盘上有刚毛，有隔膜，平滑，较坚硬，分生孢子梗单枝，淡褐色，平滑，疏松排列成栅栏状。参照真菌鉴定手册将其鉴定为刺盘孢属（Colletotrichumsp.）。

上述的一种能提高杉木光合作用的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基,其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

上述的一种能提高杉木光合作用的内生真菌的应用方法，是应用该菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。

上述的一种能提高杉木光合作用的内生真菌的应用方法，是用9.0×10⁵cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株杉木的根际。

上述的一种能提高杉木光合作用的内生真菌的应用方法，是应用该菌株的菌液5.0×10⁵cfu/ml在杉木水培苗栽植前将苗蘸根10min。

本发明涉及的菌株是从杉木植株中分离纯化得到的，经接种于杉木组培苗，

根据光合作用的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有促进光合效能的作用，寻找到对促进植株生长的有益的功能内生真菌可应用于生产。通过接种后植株的测定试验，得出植株的叶绿素含量以及叶绿素荧光参数表现均优于对照，且浇根的接种方式优于淋冠，表明其对于杉木光合作用具有很大提高作用。

附图说明

图为内生真菌AJ4对杉木幼苗叶绿素含量的影响。

具体实施方式

一株能提高杉木光合作用的内生真菌，菌种命名为AJ4，分类命名：刺盘孢（Colletotrichumsp.），其保藏编号：CGMCCNo.9227，保藏日期：2014年5月20日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

1水培繁殖中的应用

取配制好的上述内生真菌应用菌液，制成5.0×10⁵cfu/ml菌液，在组培苗栽植前蘸根10min。可提高植苗成活率10%以上。

2根际土壤浇施应用

本试验采用土培盆栽试验，试验所用杉木幼苗为福建省林科院提供的杉木组培苗。选择长势一致的苗木于2013年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。所用土壤是严格经过熏蒸消毒的黄心土。经过称量，每盆放入等量的3kg土壤。经过两个月的恢复性生长，连续三天（7月5日、7月6日和7月7日）分别于杉木根际（R）和树冠（G）施入相同浓度的100mL菌液。利用上述试验获得的共5个优势菌种，每种菌液4个重复，用蒸馏水作为空白对照。接种60天后进行各项指标的测定。

菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×10⁶cfu/mL。

2.1叶绿素含量测定

叶绿素含量测定参考张宪政（1986）^[12]的方法，采用丙酮乙醇提取法。取相近位置叶片，洗净并吸干水分后，准确称取0.1g鲜叶放入小试管中，加混合液（丙酮：乙醇=1:1）10mL盖塞。在室温下暗处提取12h后去清液分别在663nm和645nm下测定光吸收值。

结果计算：

2.2叶绿素荧光特性测定

叶绿素荧光参数采用PhotonSystemsInstruments（PSI）公司生产的HandyFluorCam荧光成像仪进行测定。测定前进行仪器程序设计并预热。杉木叶片在测定前充分暗适应20min，测定时将材料放在摄像头前，调整焦距至能看到清晰的叶片图像。

2.3数据处理

数据整理与初步处理采用Excel2003，作图采用Origin8.0，数据的统计学分析采用SPSS18.0。

3结果与分析

3.1菌种对杉木幼苗叶绿素含量的影响

由表1和图1可知，采用浇根（R）和淋冠（G）两种方式进行接种，G处理中，接种AJ4幼苗的叶绿素含量比对照高18.73%；R处理中，接种AJ4幼苗的叶绿素含量比对照高11.64%。两种接种方式下，接种AJ4均能有效提高宿主叶片的叶绿素含量。

表1不同内生真菌对杉木幼苗叶绿素含量的影响

注：表中数据为四个重复的均值±标准差。

3.2不同菌种对杉木幼苗叶绿素荧光特性的影响

初始荧光（Fo）是光系统II（PSII）反应中心处于完全开放时的荧光产量，与叶片叶绿素含量有关^[13]，Fo越大说明植株受抑制程度越重。接种AJ4菌株的幼苗叶片Fo在G处理下比对照低11.27%，在R处理下比对照低13.04%。

最大荧光（Fm）是PSII的最大光化学量子产量（MaximumquantumyieldofPSIIphotochemistry），又叫原初光化学的最大产量，PSII光化学反应的潜在产量，PSII潜在最大量子产量等，反映了当所有的PSII反应中心均处于开放态时的量子产量，也反映通过PSII的电子传递情况。接种AJ4菌株的幼苗叶片Fm在G处理下比对照高5.49%，在R处理下比对照高7.16%。

Fv/Fm和Fv/Fo反映PSII反应中心的光化学效率和光能潜在活性。在两种不同的接种方式下，接种菌株的幼苗Fv/Fm和Fv/Fo均分别大于对照组。

表2内生真菌AJ4对杉木幼苗叶绿素荧光参数的影响

注：表中数据为四个重复的均值±标准差。

综上，菌株AJ4号菌株两种处理植株较对照苗木叶绿素含量分别高了18.73%和11.64%。两种处理植株较对照苗木初始荧光（Fo）分别低了11.27%和13.04%。两种处理植株较对照苗木最大荧光（Fm）分别高了5.49%和7.16%。两种处理植株Fv/Fm和Fv/Fo均分别大于对照组。

本发明发现一株能促进杉木光合作用的内生真菌，将该株杉木内生真菌菌株采用浇根和淋冠两种方法接种于杉木幼苗。通过接种后植株的测定试验，得出植株的叶绿素含量以及叶绿素荧光参数表现均优于对照，且浇根的接种方式优于淋冠，表明其对于杉木光合作用具有很大提高作用。

参考文献

[1]郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001,20(1):148~152.

[2]于汉寿,纪燕玲,翁忠贺等.禾本科植物内生真菌研究10--内生真菌共生体的苗期生物学特性[J].草业科学，2009,26(10):150-154.

[3]LuH,ZouWX,MengJC,HuJ,TanRX.NewbioactivemetabolitesproducedbyColletotrichumsp.,anendophyticfungusinArtemisiaannua[J].PlantSci,2000,151:67-73.

[4]ReisVM,BaldaniVLD,DobereinerJ.BiologicaldinitrogenfixationinCramineaeandpalmtrees[J].CriticalRevPlantSci,2000,19:227-247.

[5]StoneJK,BaconCE,WhiteJFJr.Anoverviewofendophyticmicrobes:endophytismdefinedMicrobialEndophytes[J].NewYork:MarcelDekker，2000;3-29.冯永君，宋未.植物内生细菌[J].自然杂志，2001,23(5):249~252.

[6]冯永君，宋未.植物内生细菌[J].自然杂志，2001,23(5):249~252.

[7]杨海莲，孙晓璐，宋未.植物内生细菌的研究[J].微生物学通报，1998,25(4):224~227.

[8]谢卿媚,黄建河.杉木内生菌根的研究I.内生菌根的形态特征及菌根真菌的鉴定[J].福建林学院学报,1985,5(2):82-84

[9]崔林,孙振,孙福在,etal.马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定[J].植物病理学报,2003,33(004):353-358.

[10]何红,蔡学清,洪永聪,etal.辣椒内生细菌的分离及拮抗菌的筛选[J].中国生物防治,2002,18(4):171-175.

[11]袁军,孙福在,田宏先,etal.防治马铃薯环腐病有益内生细菌的分离和筛选[J].微生物学报,2002,42(3):270-274.

[12]张宪政.植物叶绿素含量测定——丙酮乙醇混合法[J].辽宁农业科学,1986(3):26-28.

[13]中华人民共和国林业行业标准.森林土壤分析方法[M].285-287,288-289,296-297。

Claims (3)

1.一株能提高杉木光合作用的内生真菌，其特征在于：所述内生真菌为刺盘孢（Colletotrichumsp.）AJ4，已于2014年5月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.9227。

2.一种如权利要求1所述的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，是将所述的刺盘孢（Colletotrichumsp.）AJ4接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×10⁶cfu/ml，备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

3.一种如权利要求1所述的内生真菌的用途，其特征在于：应用该菌株的菌液，杉木苗木栽植前期蘸根和用于杉木林地浇根。