CN104774771B - 一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌。所述内生真菌为嗜热真菌属（Thermomyces sp.）SY1，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No.10469。通过对植株的叶绿素荧光参数的测定，得出接种该菌株的处理的Fv/Fm和Fv/F0均较大程度高于对照，表明其对于促进植株光合作用效能的提升具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐植株光合作用的增强。
Description
技术领域
本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌。
背景技术
植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。
目前，有关内生真菌对千年桐生长的影响研究还存在空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌。
该真菌为嗜热真菌属（Thermomyces sp.）SY1，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 10469。
该菌的分离、纯化包括：
A、材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；
B、消毒：75%酒精漂洗30s→无菌水冲洗3-4次→15%的次氯酸钠漂洗（根7min，茎5min，叶3min）→无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；
C、接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；
D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化；
固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Thermomyces功能菌株；
上述的一种在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液浇施于千年桐苗木根际土壤或苗木直接接种。
本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫促进千年桐生物量增长的作用，寻找到对促进植株生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于生产。
通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，并在接种15天后进行低磷胁迫试验，在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时测定植株的叶绿素荧光参数。根据测得的各项指标综合评判，进一步证实其在低磷胁迫下具有促进植株光合作用的功用，寻找到对促进植株生长有益的功能内生真菌可应用于生产。通过对植株的叶绿素荧光参数的测定，得出接种该菌株的处理的Fv/Fm和Fv/F0均较大程度高于对照，表明其对于促进植株光合作用效能的提升具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐植株光合作用的增强。
附图说明
图1为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗Fv/Fm的影响。
图2为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗Fv/F0的影响。
具体实施方式
一、根际土壤浇施与苗木直接接种应用
试验材料为千年桐幼苗为建阳市林业局提供的千年桐一年生苗。本试验采用土培盆栽试验，选择长势一致的苗木于2014年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入相等质量的3kg黄心土，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10-15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。将苗木植入，经过一个月的恢复性生长，在千年桐幼苗根际施入菌株浓度为5.5×106cfu/ml的菌液100ml，连续三天浇施，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。
菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×106cfu/mL。
二、低磷胁迫试验设计
盆栽试验土壤的基质为黄心土。经测定该土壤中各养分物质见表1。接种15天后进行低磷胁迫试验处理，这段时间主要是让接种菌株侵入植株。
表1基质土壤养分情况
Table 1 Nutrient content of basic soil
单位：mg/g
本试验设计了4个磷处理水平，每个水平3个重复（表2）。磷肥采用KH2PO4，定期施氮肥、钾肥及其他微量元素，直至收获。低磷胁迫于2014年7月21日、7月28日和8月4日分三次进行。根据天气状况及时为千年桐苗补充水分。
表2低磷胁迫试验设计
Table 2 The experimental design of phosphorus stress
单位：mg/kg
在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定，检测方法如下：
（1）叶绿素荧光特性测定
叶绿素荧光参数采用Photon Systems Instruments（PSI）公司生产的HandyFluor Cam荧光成像仪进行测定。测定前进行仪器程序设计并预热。千年桐叶片在测定前充分暗适应20 min，测定时将材料放在摄像头前，调整焦距至能看到清晰的叶片图像。
（2）数据处理
数据整理与作图采用Excel2003，数据的统计学分析采用SPSS16.0。
三、结果与分析
不同低磷胁迫下不同处理对千年桐幼苗叶绿素荧光特性的影响
初始荧光（Fo）是光系统II（PSII）反应中心处于完全开放时的荧光产量，最大荧光（Fm）是PSII的最大光化学量子产量（Maximum quantum yield of PSII photochemistry），又叫原初光化学的最大产量，PSII光化学反应的潜在产量，PS II潜在最大量子产量等，反映了当所有的PS II反应中心均处于开放态时的量子产量，也反映通过PSII的电子传递情况。可变荧光(即Fv)为Fm与Fo之差。Fv/Fm和Fv/F0反映PSⅡ反应中心的光化学效率和光能潜在活性，是体现植物光合作用强度的重要参数。如图1所示，在不同胁迫程度下，胁迫至60d时，处理SY1的Fv/Fm均大于对照，分别比对照大8.22%、4.80%、10.50%、5.10%。如图2所示，在不同胁迫程度下，胁迫至60d，处理SY1的Fv/F0均大于对照，分别比对照增加了37.09%、18.16%、47.40%、21.26%。
综上所述，在不同胁迫程度下，千年桐叶片真菌SY1所处理的幼苗与对照相比，其Fv/Fm和Fv/F0均大于对照，说明菌株SY1对千年桐苗木的光合作用起到一定程度的促进作用。
本发明发现一株能缓解低磷胁迫促进千年桐光合作用的内生真菌，将该株千年桐内生真菌菌株采用浇根的方法接种于千年桐幼苗。通过对植株的叶绿素荧光参数的测定，得出接种该菌株的处理的Fv/Fm和Fv/F0均较大程度高于对照，表明其对于促进植株光合作用效能的提升具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐缓解低磷胁迫促进其光合作用的增强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌，其特征在于：该真菌为嗜热真菌属（Thermomyces sp.）SY1，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No.10469。
2.一种如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进千年桐光合作用的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，将所述的嗜热真菌属（Thermomyces sp.）SY1菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml，备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
3.一种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述应用菌液用于千年桐苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。
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