CN101974438A - 一株桉树内生菌及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株青霉菌株及其用途，所述桉树内生菌是青霉(Penicilliumsp.)菌株1，保藏号为CGMCC No.4279。将所述桉树内生菌接种桉树，能提高桉树抗耐低磷胁迫能力，以及用于促进桉树磷的吸收。本发明的桉树内生菌用于促进桉树中磷的吸收，通过菌种接种桉树植株，可提高植株磷酸酶和土壤磷酸酶的活性，降低土壤根际pH值，较大程度的提高了植株P利用率，从而达到促进植株在低磷土壤中正常生长的目的，较大程度降低了土壤磷肥的使用率。

Description

一株桉树内生菌及其用途

技术领域

本发明涉及一株桉树内生菌及其用途。

背景技术

土壤缺磷已经成为制约世界农业发展首要因素，在世界13.19亿hm²耕地中缺磷的占据43％。我国农田的2/3土壤严重缺磷，其中南方土壤是磷含量最低的土壤之一。若单独依靠土壤中的磷，只能满足一季作物需要的1％～0.5％。在大部分土壤中，磷元素在土壤中的扩散能力差，一般集中在土壤表层，随着深度增加而降低。严小龙等研究表明，目前磷肥的利用率只有0%～25%，这意味着75％～90％的磷被转化为难吸收的磷酸盐，土壤已经形成了一个巨大的磷库。因此，磷高效利用成为当今解决土壤磷缺乏的一个重要途径。内生菌也能通过增强植物吸收氮、磷等营养元素的能力，或产生拮抗物质或与病原菌竞争空间而达到促进植株生长的作用^[1]。

植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌^[2]。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。

前人从大部分植物中都能分离出内生菌，因此可以推测内生菌在植株中是普遍存在的。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌^[3]。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌^[4-5]、具有抗病虫害的生防菌^[6-9]。

在桉树内生真菌的研究主要集中在外生菌根（ECM）和VA菌根真菌的研究方面^[10]。桉属树种在自然界中既有外生真菌又有内生真菌，这在国内外均被证实，但内生真菌的自然感染率不高。弓明钦等^[11]进行桉树幼苗菌根接种及生长效应的研究中应用漏斗孢球囊霉（Glomus Mosseae）和地表球囊霉（G. epigaeum）两种菌进行高生长和直径生长比较。陈应龙^[10]用外生真菌彩色豆马勃和苏格兰球囊霉混合接种对尾叶桉的高生长、直径生长、干重的比较研究。前人的研究中应用菌株，多为外生真菌，同时也没有从促进磷吸收的根本因素去寻找内生真菌，以提高其科学性和可靠性^[12]。桉树的ECM菌根真菌主要包含担子菌亚门（Basidiomycotina）、子囊菌亚门（Ascomycotina）和接合菌亚门（Zygomycotina）等，VA菌根真菌主要包含接合菌亚门球囊霉目（Glomales）。证实能促进磷吸收的内生菌方面尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一株桉树内生菌及其用于提高桉树抗耐低磷胁迫能力及促进磷吸收的用途。

本发明所述桉树内生菌为青霉（Penicillium sp.）菌株1，保藏号为CGMCC No. 4279。

该菌株1的分离、纯化步骤包括：

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

真菌固体培养基：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后，从中选择得到单一菌种，通过桉树接种试验，进一步验证其具有促进桉树磷吸收活性后，鉴定并保存菌种；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

本发明所述的桉树内生菌的制种方法即内生菌液的制备方法，是将上述的菌株1接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0～9.0×10⁶cfu/ml备用；

所述液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

本发明所述的桉树内生菌的用途，将所述桉树内生菌接种桉树，提高桉树抗耐低磷胁迫能力以及用于促进桉树磷的吸收，具体操作是应用该菌株的菌液，用于林地浇根、组培进入炼苗期前蘸根或组培过程的切芽阶段转入生根培养基前芽蘸。

所述林地浇根是采用5.0×10⁶cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株桉树的根际。

所述组培进入炼苗期前蘸根是应用该菌株的菌液3.0×10⁶cfu/ml在组培进入炼苗期前蘸根1-5min。

所述组培过程的切芽阶段转入生根培养基前芽蘸是应用该菌株的菌液1.0×10⁶cfu/ml在组培过程的切芽阶段转入生根培养基前，将芽蘸菌液1-5min后接入生根培养基继续培养。

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株1的形态特征如下：

在平面培养基上按常规方法培养，观察其形态。培养基的正面其菌落呈灰绿色，背面黄褐色，点状圆形；菌丝体有隔，分生孢子梗和孢子无色，末端生小梗，小梗直立，刷状，单胞，卵圆形，表面光滑，分生孢子梗自菌丝单个地发生，在顶部附近分枝，形成典型的帚状特征结构。

参照真菌鉴定手册将菌株鉴定为青霉属(Penicillium)。

本发明的青霉（Penicillium sp.）菌株1，已经于2010年10月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No. 4279。

本发明的显著优点：

本发明的桉树内生菌用于促进桉树中磷的吸收，通过菌种接种桉树植株，可提高植株磷酸酶和土壤磷酸酶的活性，降低土壤根际pH值，较大程度的提高了植株P利用率，从而达到促进植株在低磷土壤中正常生长的目的，较大程度降低了土壤磷肥的使用率。

附图说明

图1为不同处理的植株SOD变化图；

图2为不同处理的植株POD变化图；

图3为不同处理的土壤pH值变化图；

图4为不同处理的土壤磷酸酶含量变化图；

图5为不同处理的植株全磷含量图。

具体实施方式

实施例1

1 菌液制备

本发明菌株1的分离、纯化包括：

A、材料：采集野外邓恩桉和尾巨桉植株直径0.5cm以下的根、直径0.5cm以下的茎段和成熟叶；

B、消毒：叶片消毒采用70％酒精浸泡40s、0.1％升汞浸泡90s，茎段消毒采用70％酒精浸泡30s、0.1％升汞浸泡60s，根部消毒采用70％酒精浸泡50s、0.1％升汞浸泡120s；

C、分离：将经表面消毒的野外邓恩桉、尾巨桉植株的根、茎段和成熟叶接入真菌固体培养基进行内生真菌的繁殖；

真菌固体培养基：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养，培养时间为48h；

D、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Penicillium sp.功能菌株；

点接种纯化：将消毒后的接种环轻微点击菌体表面，然后将其点击接种面，该方法较传统的点植培养法更易控制接种量，从而提高对内生真菌的接种效率与检出率。

菌液的制备方法，是将上述的菌株1接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成5.0×10⁶cfu/ml即为成品备用；所述液体培养基：为改良马丁培养基,其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

2 试验方法

低磷胁迫试验设计

所用材料为福建省林业科学院尾巨桉组培苗3229，随机选择生长状态良好，且长势均匀一致含有两对真叶小苗。

设计了3个磷处理水平，每个水平3个重复(表1)。盆栽试验土壤的基质为黄心土(酸性贫瘠缺磷黄壤)。经测定其pH值4.15、土壤有机质含量为0.315 g·kg^-1、全氮为0.151 mg·kg^-1、全磷为0.088 g·kg^-1、全钾为1.998 g·kg^-1、有效磷为0.360 mg·kg^-1。盆子规格为34×40cm²，盆底有九个排水孔。称取16kg黄心土装盆，2009年3月定植桉树苗，待其生长一个月后进行3个等级的磷胁迫处理^[13-15]。

表1 试验设计

Tab. 1 The experimental design

磷肥采用KH₂PO₄，定期施N、K肥和其它微量元素，直至收获。磷胁迫于2009年4月15号开始进行，集中施肥一次，同时在植株根际施入菌液，连续3天在树干基部周围均匀施入相同体积相同浓度的100ml菌液，此做法为保证接种后菌株能实现侵染。将浇施水溶液的植株作为空白对照。在胁迫15d、30d、45d中进行取样测定各项指标：可溶性蛋白含量的测定；丙二醛(MDA)含量测定；酸性磷酸酶(APA)活性测定。3个月后收获植株和土壤样品进行生物量测定和植株含P量测定。

结果分析

3.1超氧化物歧化酶含量分析

植株在逆境胁迫下，植株体内产生大量的H₂O₂、O^2-、-OH等活性氧自由基。这些破坏性很强的活性氧将对膜脂产生过氧化作用，使植物细胞膜收到伤害，从而导致细胞内的电解质外渗，从而导致电导率增大^[16]。SOD、POD等是植物自我保护系统中重要的酶，当植株处在逆境条件下，这些酶可以通过协调作用起到清除上述自由基的作用，使植物免受伤害^[17]。同时，在逆境条件下植株体内会产生大量的脯氨酸，达到降低植物细胞渗透势，维持压力势，稳定大分子物质，参与叶绿素合成等维持细胞正常功能的作用^[17]。

随着低P胁迫的加深，植株超氧化物歧化酶的含量逐渐减少（图1）。与对照处理相比较，菌种处理的植株的超氧化物歧化酶含量增加了27.36％。这表明在低P胁迫下，植株体内受到了一定程度的伤害，SOD含量一定程度的增加，起到保护植株的作用。

过氧化物酶含量分析

随着低P胁迫的加深，植株超氧化物歧化酶的含量一般呈现逐渐减少的趋势（图2）。与对照处理相比较，菌种处理的植株的过氧化物酶含量增加了70.16％。这表明在低P胁迫下，植株体内受到了一定程度的伤害，POD含量一定程度的增加，起到保护植株的作用。

丙二醛含量分析

在正常供P条件下，与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的丙二醛含量减少了0.46％。

可溶性蛋白含量分析

在正常供P条件下，与对照处理CK相比，菌种处理的植株的可溶性蛋白含量增加了23.09％。在P胁迫处理LP₂条件下，与对照处理CK相比，菌种处理的植株的可溶性蛋白含量增加了27.60％。这表明菌种处理的植株在低P条件下，植株可溶性糖含量一定程度的增加，这可能是由于菌株促进了植株在低P条件下的适应性。

根系酸性磷酸酶含量分析

植物酸性磷酸酶主要分布在叶的下表面和植物的根，或由根系分泌在土壤中^[18]。磷酸酶作为一类水解磷酸单酯键的水解酶，与细胞的许多生理生化过程相关，包括细胞防御、细胞质PO₄ ^3-库的维持等。它是一种在低磷状况下表达的诱导酶，其活性受植株供磷状况的影响，它是植株在低磷条件下表达最早和最剧烈的反应之一^[19]。

在正常供P条件下，与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的根系酸性磷酸酶含量增加了53.87％。在P胁迫处理LP₁条件下，与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的根系磷酸酶含量增加了50.00％。在P胁迫处理LP₂条件下，与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的根系磷酸酶含量增加了25.00％。这表明菌种处理的植株根系磷酸酶含量具有比较明显的差异，菌株对植株根系磷酸酶的分泌产生了显著的影响。

根际土壤pH值分析

PH值是影响植物对土壤难溶磷活化的重要因素。在一定范围内，随着根际PH值的下降，磷的吸收显著增加^[20]。导致根际PH降低的原因有多种，植物根系分泌有机酸，根系吸收阴阳离子的不平衡。关于有机酸活化土壤中磷的途径有多种^[21]：改变吸附剂表面的电荷；磷酸根与有机酸之间竞争络合位点，从而降低土壤对磷酸根的吸附；消除土壤的吸附位点；酸的溶解作用；有机阴离子／有机酸与Ca、Fe等金属离子间的络合反应，从而造成含磷化合物的溶解，活化土壤中的磷。

随着低P胁迫的加重，土壤PH值逐步降低（图3）。与对照处理相比较，菌种处理的植株的PH下降了4.03％。植株根际PH值受到植株和土壤的酶含量影响，菌种处理的植株与对照相比土壤PH值差异显著。

土壤磷酸酶含量分析

随着低P胁迫的加深，土壤磷酸酶的含量逐渐增加（图4）。与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的土壤磷酸酶的含量增加了88.88％。这表明菌种处理的植株与对照相比根际土壤磷酸酶含量差异显著。

叶绿素含量分析

与对照处理CK相比较， 菌种处理的植株的总叶绿素含量增加了30.51％。这表明在低P条件下，植株叶绿素的生成受到了一定程度的抑制，但由于内生菌的接种，在一定程度上减缓了叶绿素含量的降低，菌种处理的植株与对照相比叶绿素含量较大程度的增加。

3.9 植株全磷分析

在缺磷条件下植物对磷的利用率明显提高，主要是由于缺磷诱导了植物根系酸性磷酸酶活性的显著提高，从而促进了植株磷的吸收^[22]；也可能是植物细胞内的酸性磷酸酶参与了细胞磷的转运^[23]；也可能是在缺磷条件下，磷酸酶使植株体内仅有的磷重复利用，从而提高磷的利用率^[24]。

随着低P胁迫的加深，植株全磷的含量逐渐减少（图5）。与对照处理CK相比较，菌种处理的植株的植株P含量增加了35.14％。表明菌种处理的植株的全P含量与对照相比出现了显著的差异性。

植株生物量分析

植株总生物量分析，与对照处理相比较，菌种处理的植株的总生物量增加了20.62％。植株的叶片生物量分析，与对照CK相比较，菌种处理的植株的生物量增加了27.91％。这表明植株在低P条件下生长受到了一定程度的抑制，但由于内生真菌的接种，在一定程度上提高了体内各项抵御低P伤害的指标，促进了植株的生长，菌种处理的植株的生物量与对照相比产生了较大的差异性，促进了植株P的吸收，从而达到促进植株生长的目的。

结论

本发明通过研究发现，本发明的菌种1接种桉树提高了植株磷酸酶和土壤磷酸酶的活性，降低了土壤根际pH值，较大程度的提高了植株P利用率。今后可以考虑在生产实践中利用内生真菌或内生真菌与解磷菌混合菌进一步提高植株在低磷土壤中对磷的利用率。

参考文献：

[1]Adhikari T B, Joseph C M． Evaluation of bacteria isolated from rice for plant growth promotion and biological control of seeding disease of rice [J]．Can．J Microbiol, 2001, 47:916-924．

[2]郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001, 20(1):148~152.

[3]于汉寿,纪燕玲,翁忠贺等. 禾本科植物内生真菌研究10--内生真菌共生体的苗期生物学特性[J].草业科学，2009,26(10):150-154.

[4]Lu H,Zou W X,Meng J C,Hu J,Tan R X.New bioactive metabolites produced by Colletotrichum sp.,an endophytic fungus in Artemisia annua [J].Plant Sci,2000,151:67-73.

[5]Reis V M,Baldani V L D,Dobereiner J.Biological dinitrogen fixation in Cramineae and palm trees[J]. Critical Rev Plant Sci,2000,19:227-247.

[6]Stone J K, Bacon C E, White J F Jr. An overview of endophytic microbes: endophytism defined Microbial Endophytes[J] . New York:Marcel Dekker，2000;3-29.

[7]冯永君，宋未.植物内生细菌[J].自然杂志，2001,23(5):249~252.

[8]刘云霞.植物内生细菌的研究与应用[J].植物保护，1994,20(5):30~32.

[9]杨海莲，孙晓璐，宋未.植物内生细菌的研究[J].微生物学通报，1998,25(4):224~227.

[10]陈应龙，弓明钦，王凤珍等.ECM和VAM菌混合接种对尾叶桉生长效应的研究[J].林业科学研究，1998，11（5）：481～487.

[11]弓明钦等.桉树幼苗菌根接种及其生长效应的研究[J].林业科学研究,1992,5(6):639-645.

[12]谯天明等.四川桉树内生菌根真菌的研究[J].四川林业科技,2001,22(3):6-9.

[13]杨曾奖,周文龙．桉树苗期缺素症状的研究[J]．林业科学研究,1992,5(6):646-650．

[14]徐大平．不同磷水平对不同种源尾叶桉的生长和养分吸收的影响[J]．热带亚热带土壤科学,1997,6(2):76-81．

[15]黄勇．不同桉树品种适应磷胁迫的生理学机制研究[D],2007．

[16]Kochian L V．Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants Annu． Rev． Plant Physiol[J]．Plant Mal Biol,1995,46:237-260．

[17]Liu P,Yang Y A．Effects of molybdenum and boron on membrane lipid peroxidation and endogenous protective systems of soybean leaves[J]．Acta Botanica Sinica, 2000,42,461-466．

[18]宋克敏,焦新之．磷酸饥饿时番茄幼苗酸性磷酸酶活性的变化与Pi吸收的关系[J]．云南植物研究,1999,21(1):101-108．

[19]Dracup M N H,Brrett-Lennare E G,Greenway H,Roboson A D．Effect of phosphorus deficiency on phosphastase activity of cell walls from roots of subterranean clover[J]．J Exp Bot．,1984,35:466-480．

[20]王庆仁,李继云,李振声．植物高效利用土壤难溶态磷研究动态及展望[J]．植物营养与肥料科学报,1998,4,(2):107-116．

[21]王庆仁,李继云,李振声．磷高效基因型小麦对缺磷胁迫的根际适应性[J]．西北植物学报,2000,20(1):1-7．

[22]Hela HM．Varietal differences in roots phosphatase activity as related to the utilization of organic phosphates[M]．In:Bassam NEL(ed)．Genetil Aspects of Plant Mineral Nutrition．Netherlands:Kluwer Academic Publishers,1990,103-105．

[23]Duff S M,Sarath G, Plaxton W C．The role of acid phosphatases in plant phosphorus metabolism [J]．Physiologia Plmtmm,1994,90:791-800．

[24]严小龙,张福锁．植物营养遗传学[M]．北京:中国农业出版社,1999,154-156．

Claims (5)

1.一株桉树内生菌，其特征在于：所述桉树内生菌为青霉（Penicillium sp.）菌株1，保藏号为CGMCC No.4279。

2.如权利要求1所述的桉树内生菌的制种方法，其步骤包括，将菌株1接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0～9.0×10⁶cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的桉树内生菌的制种方法，其特征在于：所述液体培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。

4.如权利要求1所述的桉树内生菌的用途，其特征在于：将所述桉树内生菌接种桉树，能提高桉树抗耐低磷胁迫能力。

5.如权利要求1所述的桉树内生菌的用途，其特征在于：将所述桉树内生菌接种桉树，用于促进桉树磷的吸收。

Images