CN104818219A - 一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌 - Google Patents

一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌。所述内生真菌为青霉属（Penicillium sp.）ZG3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10467。将千年桐内生真菌ZG3接种于千年桐土培苗，通过对植株干重以及SOD活性的测定，得出接种该菌株的处理的根冠比及SOD活性均较大程度高于对照，表明其对于促进植株根系生长及对抵御低磷环境具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐根系生长。

Description

一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌
技术领域  
本发明涉及一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌。
背景技术  
植物内生菌的研究始于19世纪末，Vogl从黑麦草Lolium temulentum L.种子中分离出第一株内生菌。但真正开始大量研究植株中的内生菌起始于上世纪八十年代，主要是在温带地区、亚热带地区和热带地区的植被中开展研究。
植物内生真菌的分布广、种类多，前人研究表明从绝大多数植物体内都能分离得到内生真菌，由此可见内生真菌普遍存在于植物体内。在全世界范围内至少在80多个属290多种的禾本科农作物中发现了内生菌。目前从植物中分离的内生菌根据其具有的独特功能可以分为：固氮菌、固钾菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病虫害的生防菌和具有促进植物对不良环境的修复能力的抗性菌。
目前，有关内生真菌对千年桐生长的影响研究还存在空白。
发明内容  
本发明的目的在于提供一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌。
该真菌为青霉属（Penicillium sp.）ZG3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC No. 10467。
该菌的分离、纯化包括：
A、材料：将采集得到不同年份的根、枝茎、叶分成三个部分，用自来水清洗干净，分装到自封袋内，于4℃冰箱保存；
B、消毒：75%酒精漂洗30s→无菌水冲洗3-4次→15%的次氯酸钠漂洗（根7min，茎5min，叶3min）→无菌水冲洗4-5次。当样品最后一次浸洗后的水盛于灭菌的小烧杯中，在平板上划线作为对照，以检验样品的消毒是否彻底，若干天后如有菌落生成，则表明样品表面消毒不彻底，需继续调整消毒方法；
C、接种部位的选择：叶片：叶尖部、叶中部和叶基部3个处理；枝茎：上中下分为3部位，其中第3部位为枝茎交接处；根部：分为根尖和根基2个部分；
D 、接种：将消毒后的外植体用接种刀切开，铺放在培养基表面，于28℃恒温培养箱内培养5—7天后观察菌落生长状况。有的菌株繁殖迅速，可先将其产生的菌株进行分离纯化；生长缓慢且数量较少的菌株可延长观察时间，直到其生长稳定后纯化；
固体培养：使用改良马丁固体培养基，配方为蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、琼脂14.0g/L、其它为无菌水，pH值6.4±0.2，培养温度为28℃，培养方式为平板培养；
E、将分离繁殖出的不同种类的内生真菌接入平板培养基进行纯化，经过2-3次点接纯化、转接后得到单一菌种的上述的Penicillium功能菌株。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的制备方法，是将上述的菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml即为成品备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是应用该菌株的菌液浇施于千年桐苗木根际土壤或苗木直接接种。
上述的一种在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌应用菌液的应用方法，是用5.5×106cfu/ml菌液，按每株100ml在林地浇于每株千年桐的根际。
本发明涉及的菌株是从千年桐植株中分离纯化得到的，经接种于千年桐土培苗，根据各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫促进千年桐根系生长的作用，寻找到对促进植株生物量增长的有益的功能内生真菌可应用于生产。
通过菌液浇施的方法接种于千年桐幼苗，并在接种15天后进行低磷胁迫试验，在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定植株叶片的SOD活性，并在胁迫至60d时测定其根冠比。根据测得的各项指标综合评判，进一步证实其对植株生长具有缓解低磷胁迫的作用，寻找到对促进植株生长有益的功能内生真菌可应用于生产。通过对植株的干重以及SOD活性的测定，得出接种该菌株的处理的根冠比及SOD活性均较大程度高于对照，表明其对于促进植株根系生长及对抵御低磷环境具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能在低磷环境下促进千年桐根系生长。
附图说明
图1为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗根冠比的影响。
图2为不同低磷胁迫条件下不同处理对千年桐幼苗SOD活性的影响。
具体实施方式
一、根际土壤浇施与苗木直接接种应用
试验材料为千年桐幼苗为建阳市林业局提供的千年桐一年生苗。本试验采用土培盆栽试验，选择长势一致的苗木于2014年5月定植于直径15cm，高10cm的塑料盆中。每盆放入相等质量的3kg黄心土，为了保证后期苗木接菌的准确性，往每盆土壤中滴入10-15滴甲醛(福尔马林)消毒液，并用塑料薄膜封盖盆口，消毒时间为24h。待土壤内甲醛渗透消毒完全，除去塑料薄膜，将剩余的甲醛蒸发，以免影响幼苗的移植成活率。将苗木植入，经过一个月的恢复性生长，在千年桐幼苗根际施入菌株浓度为5.5×106cfu/ml的菌液100ml，连续三天浇施，用蒸馏水溶液处理作为空白对照。
菌液制备：将供试菌株接入50mL的液体培养基，培养基为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2，在恒温振荡培养箱中经过72h的培养。用无菌生理盐水按十倍稀释法将菌液稀释，利用血球计数板计算菌液浓度配制成5.5×106cfu/mL。
二、低磷胁迫试验设计
盆栽试验土壤的基质为黄心土。经测定该土壤中各养分物质见表1。接种15天后进行低磷胁迫试验处理，这段时间主要是让接种菌株侵入植株。
表1 基质土壤养分情况
Table 1 Nutrient content of basic soil
单位：mg/g
本试验设计了4个磷处理水平，每个水平3个重复（表2）。磷肥采用KH2PO4，定期施氮肥、钾肥及其他微量元素，直至收获。低磷胁迫于2014年7月21日、7月28日和8月4日分三次进行。根据天气状况及时为千年桐苗补充水分。
表2 低磷胁迫试验设计
Table 2 The experimental design of low phosphorus stress
单位：mg/kg
在胁迫15d时、30d时、45d时、60d时进行取样测定，检测方法如下：
（1）根冠比的测定
将植株的不同部位分别放入信封中并标上记号，放入烘箱105℃烘干半小时（钝化酶），在60℃下烘干，经过12h后，称重后再放入烘箱中，重复测定直至恒重为止。称得样品的重量（W），即为样品干重，以此表示植株的生物量，精确到0.01g。
本试验中采用植株干物质的质量比表示根冠比指标，植物的根冠比是指植物地下部分与地上部分的干重的比值。地面以下的主要是根系，为地下部分；地面以上的主要是茎和叶，为地上部分。
（2）超氧化物歧化酶活性测定
植物体中超氧化物歧化酶（SOD）可分为3 种类型：即铜锌-SOD（CuZn-SOD）、锰-SOD（Mn-SOD）和铁-SOD（Fe-SOD）。低等植物以Fe-SOD 和Mn-SOD 为主，高等植物以CuZn-SOD为主，CuZn-SOD主要位于细胞质和叶绿体中，Mn-SOD主要位于线粒体中，Fe-SOD一般位于一些植物的叶绿体中。三者相加等于总SOD（T-SOD）。经样本前处理过的样本中Mn-SOD和Fe-SOD活力丧失，但CuZn-SOD活力不变。故本试验以测定CuZn-SOD活力表示植株SOD活性。采用购自南京建成生物研究所的植物组织铜锌-超氧化物歧化酶测试盒（货号：A001-4 Cu2+Zn2+-SOD）进行测定
操作步骤如下：
1）20%植物组织匀浆液的制备：准确称取植物组织0.1g，按重量（g）:体积（ml）=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质，剪碎，冰水浴条件下进行匀浆，制备成20%的匀浆液，8000转/分，离心10分钟，去上清液待测。
2）CuZn-SOD的提取：吸取步骤（1）制得的匀浆上清液0.1ml加入试管，再加入CuZn-SOD提取甲液0.1ml以及CuZn-SOD提取乙液0.1ml，漩涡混匀90秒，静置5分钟，8000转/分，离心10分钟，取上层无色透亮液体按以下操作表进行操作。
3）操作表：
混匀，室温放置10分钟，550nm，准确吸取0.25m1各管反应液加入到新的96孔板中，双蒸水调零，酶标仪测定各孔吸光度（OD值）。
4）计算公式：SOD活性以每克样品鲜质量的酶单位表示（U/g）。
三、结果与分析
（1）不同低磷胁迫下不同处理对千年桐根冠比的影响
四个不同低磷胁迫条件分别为：正常条件、轻度胁迫、中度胁迫、重度胁迫。如表1、图1所示，在四个不同低磷胁迫程度下，接种菌株ZG3的幼苗的根冠比分别为1.028、2.000、1.178、1.27，相应的，对照组在四个胁迫程度下的根冠比分别为0.904、1.45、1.116、0.844。可见，在不同低磷胁迫条件下，处理ZG3的根冠比均大于对照，由此可得，菌株ZG3有利于促进植株根系的生长。
（2）不同低磷胁迫条件下不同菌种对千年桐幼苗SOD活性的影响
细胞在正常代谢活动中和不利的环境条件下均能产生活性氧，在植物中活性氧会引起植物代谢失活、细胞死亡、光合作用速率下降、同化物的形成减少，甚至造成植物品质下降和产量降低等严重后果。SOD是活性氧清除反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶。由图2可知，在四个不同低磷胁迫条件下，从整个胁迫过程看，处理ZG3的SOD活性基本都大于对照。在正常条件下，处理ZG3的SOD活性在胁迫至15d、45d、60d时分别比对照组高2.05%、8.81%、13.78%；在轻度胁迫下，处理ZG3的SOD活性在胁迫至15d、30d、45d、60d时分别比对照组高49.95%、39.35%、12.15%、19.38%；在中度胁迫下，处理ZG3的SOD活性在胁迫至15d、30d、45d、60d时分别比对照组高9.56%、6.71%、1.38%、5.06%；在重度胁迫下，处理ZG3的SOD活性在胁迫至30d、45d、60d时分别比对照组高2.57%、11.38%、11.32%。除正常条件30d时与重度胁迫至15d时，处理ZG3略小于对照，其余均大于对照，在不同胁迫条件下，菌株ZG3对千年桐幼苗的SOD活性有促进作用。
本发明发现一株能促进千年桐缓解低磷胁迫促进植株生长的内生真菌，将该株千年桐内生真菌菌株采用浇根的方法接种于千年桐幼苗。通过对植株的干重以及SOD活性的测定，得出接种该菌株的处理的根冠比及SOD活性均较大程度高于对照，表明其对于促进植株根系生长及对抵御低磷环境具有很大功用，从而进一步证实得到该株内生真菌能促进千年桐缓解低磷胁迫，促进植株根系生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (3)

1.一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌，其特征在于：该真菌为青霉属（Penicillium sp.）ZG3，已于2015年1月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏号为CGMCC No. 10467。
2.一种如权利要求1所述的一株在低磷环境下促进千年桐根系生长的内生真菌的应用菌液，其特征在于：所述应用菌液的制备方法，将所述的青霉属（Penicillium sp.）ZG3菌株接入液体培养基，摇床振荡培养，培养温度为28℃，培养时间48～72h，利用血球计数板计算菌液浓度，将菌液用超纯水稀释成1.0-9.0×106cfu/ml，备用；液体培养基：为改良马丁培养基，其中蛋白胨 5.0g/L、酵母浸出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、硫酸镁0.5g/L、其它为无菌水、pH值6.4±0.2。
3.一种如权利要求2所述的应用菌液的用途，其特征在于：所述应用菌液用于千年桐苗木根际土壤浇施或苗木直接接种。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106085873A (zh) * 2016-06-22 2016-11-09 福建农林大学 低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524949A (zh) * 2003-02-24 2004-09-01 唐文华 一种草酸青霉菌、其菌剂及其制备方法、以及其制剂在解磷防病提高土壤肥力方面的应用
CN101974438A (zh) * 2010-11-18 2011-02-16 福建农林大学 一株桉树内生菌及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1524949A (zh) * 2003-02-24 2004-09-01 唐文华 一种草酸青霉菌、其菌剂及其制备方法、以及其制剂在解磷防病提高土壤肥力方面的应用
CN101974438A (zh) * 2010-11-18 2011-02-16 福建农林大学 一株桉树内生菌及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
范丙全 等: ""溶磷草酸青霉菌筛选及其溶磷效果的初步研究"", 《中国农业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106085873A (zh) * 2016-06-22 2016-11-09 福建农林大学 低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌
CN106085873B (zh) * 2016-06-22 2019-03-12 福建农林大学 低磷环境下能促进台湾相思磷元素吸收的混合内生真菌

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