CN116463220B - 一株促进蓝莓生长的深色有隔dse真菌及其应用 - Google Patents

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CN116463220B CN202310202031.4A CN202310202031A CN116463220B CN 116463220 B CN116463220 B CN 116463220B CN 202310202031 A CN202310202031 A CN 202310202031A CN 116463220 B CN116463220 B CN 116463220B
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Abstract

本发明公开了一株DSE真菌FL1及其在促进蓝莓生长中的应用,所述的DSE真菌FL1分类学名为Thozetella neonivea,于2022年11月08日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.40412。本发明的DSE真菌FL1以PKO固体培养基作为基础培养基,直接从蓝莓根部分离纯化而得,具有溶解无机磷的功能,有效促进蓝莓的生长,提高蓝莓根围土壤有机质、全氮、全磷、速效磷和土壤酶活性,具有开发成微生物菌剂的潜力大。

Description

一株促进蓝莓生长的深色有隔DSE真菌及其应用
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域,涉及一株促进蓝莓生长的深色有隔DSE真菌及其应用。
背景技术
蓝莓(Vaccinium uliginosum)为杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)蓝果类型植物的俗称。野生蓝莓在世界各地广泛分布。主产于美国,在中国主要分布于大兴安岭和小兴安岭林区。蓝莓作为一种具有较高经济价值和保健功能的新兴水果,栽培面积得到了较大的发展。但是当前大多数种植者普遍缺乏设施栽培蓝莓种植经验,当蓝莓出现生长不良或异常时,往往是因其缺少充足的氮磷钾等大量元素,但大量化肥的施用会导致土壤、水源污染及生态环境恶化。
蓝莓属于浅根系、无根毛植物,自然条件下常与共生真菌形成互惠共生关系,共生真菌具有增强植物生长势,改良根系环境以及增强植物对病虫害的抵抗能力等作用。利用蓝莓根部共生真菌进行蓝莓根腐病的防治研究是蓝莓根腐病绿色防控的重要内容。深色有隔DSE真菌(Dark Septate Endophytes,DSE),是植物内生菌的主要类群,其特征是与植物根系共生后可形成颜色深且具有明显横隔的菌丝结构,在植物细胞内及细胞间隙形成“微菌核(microsclerotia)结构。DSE定殖于健康植物根系的表皮、皮层甚至维管组织的细胞间空间,形成共生体,但不会在健康根组织内形成病原菌所引起的病理学特征。DSE具有广泛的宿主范围和生态分布特性,主要分布在干旱、寒冷和重金属污染地区,以及特殊生境和特色植物中,没有宿主特异性,适应性强。DSE可能具有类似菌根真菌的功能,能与宿主建立互惠共生关系,在促进植物生长、改善矿物质吸收和生物病害控制以及增强植物抗逆性方面发挥着重要作用。
土壤中存在许多具有解磷特性的微生物,它们可以将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形式,改善植物磷素营养,还能促进土壤中有益微生物的代谢活动。目前对蓝莓真菌菌株的报道有很多,其中现有专利有(CN107083335A)和(CN107129935A)报道过蓝莓DSE菌株,其中(CN107083335A)的DSE菌株是针对组培苗的快速生根,而(CN107129935A)的DSE菌株是针对提高蓝莓的抗旱作用,促进生长。但是,这两篇专利分离得到的菌株均无解磷效果。而本申请分离得到的菌株具有溶解磷的功能,能促进提高蓝莓实生根的生长。
发明内容
本发明的目的在于,提供一株DSE真菌FL1及其在促进蓝莓生长中的应用。本发明的DSE真菌FL1具有溶解磷的功能,以达到促进蓝莓对磷的吸收,促进蓝莓根际生长的作用。
本发明的技术方案:
一株促进蓝莓生长的深色有隔DSE真菌FL1,所述的DSE真菌FL1分类学名为Thozetella neonivea,于2022年11月08日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.40412。
前述的DSE真菌FL1的组织分离方法,所述DSE真菌FL1的组织分离方法按照如下步骤进行:
(1)清洗消毒:选取表面健康无病斑的蓝莓的根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡,用无菌水冲洗,转入5%NaClO溶液中消毒,再用无菌水润洗,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.4-0.6cm长度,得到A品;
(2)培养分离纯化:将A品夹入已灭菌且已加入适量氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养皿中继续培养,重复3-6次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
前述步骤(1)中,清洗消毒:选取表面健康无病斑的5-8年生蓝莓的根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗2-3次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.45-0.55cm长度,得到A品;
前述步骤(2)中,培养分离纯化:将A品夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复3-5次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
前述步骤(2)中,PDA培养基由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
一种包含权利要求1所述的DSE真菌FL1的促蓝莓生长剂。
前述的DSE真菌FL1的应用,所述DSE真菌FL1在制备促进蓝莓根际生长的制剂方面的应用。
一种蓝莓生长促生菌制品,所述制品的活性成分包括前述的DSE真菌FL1。
一种蓝莓生长促生菌制品,所述制品的活性成分是前述的DSE真菌FL1。
一种蓝莓生长促生菌制品的制备方法,采用前述的DSE真菌FL1作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明公开了一株DSE真菌FL1及其在促进蓝莓生长中的应用,利用组织分离法对的蓝莓根部的DSE真菌FL1行分离培养,DSE真菌FL1回接至蓝莓盆栽苗的定殖,可使得蓝莓苗的总定殖率达到86.67%,定殖强度达到29%。
2、DSE真菌FL1通过溶磷效果测定结果表明,该菌株为DSE真菌FL1具有较高的溶解磷的能力,以PKO液体培养基作为基础培养基,第5d达到最大值391.62μg/ml,第七天降到48.17μg/ml。不仅能提高蓝莓苗磷含量,还能提高蓝莓苗的氮和钾含量,使得蓝莓苗的磷含量由8.21g/kg提高到10.6g/kg,氮含量由5.6g/kg提高到9.43g/kg,钾含量由8.08g/kg提高到9.08g/kg。
3、蓝莓DSE真菌FL1可提高蓝莓苗的可溶性糖和可溶性蛋白,使蓝莓苗地上部分可溶性糖达到19.49mg/g,地下部分达到6.88mg/g;使蓝莓苗地上部分可溶性蛋白达到21.65mg/g,地下部分达到3.59mg/g。
4、蓝莓DSE真菌FL1还能提高蓝莓苗的酶活性,酶包括SOD、POD和CAT,其中使蓝莓苗地上部分SOD达到236.14U/g,地下部分达到319.59U/g;使蓝莓苗地上部分CAT达到189.48mg/(g·min),地下部分达到120.99mg/(g·min);使蓝莓苗地上部分SOD达到104.37U/(g·min),地下部分达到92.59U/(g·min)。
5、同时,蓝莓DSE真菌FL1能提高蓝莓苗根围土壤养分及酶活性。
综上所述,本发明的蓝莓DSE真菌FL1具有高效溶解磷的功能,提高蓝莓根围土壤有机质、全氮、全磷、速效磷和土壤酶活性(SOD酶、POD酶和CAT酶),在蓝莓生长促生,开发成微生物菌剂的潜力大,且该菌为溶磷DSE真菌FL1,可以直接使用蓝莓根部组织培养分离而得,无需另外引入菌种。
附图说明
图1:DSE真菌FL1菌落结构特征图(A:正面,B:背面,C:菌丝形态);
图2:DSE真菌FL1于无机磷培养基上的溶磷效果(A:CK即未添加DSE真菌FL1;B:FL1);
图3:FL17d有效磷含量变化;
图4:菌株FL1在无机磷培养基中pH值的变化;
图5:DSE真菌FL1在组培苗根内的侵染情况(A:在没有接菌的组培苗上没有观察到DSE真菌特有的有隔菌丝;a:在没有接菌的组培苗上没有观察到DSE真菌特有的微菌核结构;B:在接菌的组培苗上没有观察到DSE真菌特有的有隔菌丝;b:在接菌的组培苗上没有观察到DSE真菌特有的微菌核结构;h:菌丝;m:微菌核);
图6:DSE真菌FL1对蓝莓组培苗的促生效果;
图7:DSE真菌FL1在蓝莓盆栽苗的定殖情况图(A:在使用清水培养没有接种菌株FL1的组培苗上观察“有隔菌丝”结构;a:在使用清水培养没有接种菌株FL1的组培苗上观察“微菌核”结构;B:在接种菌株FL1的组培苗上观察“有隔菌丝”结构;b:在接种菌株FL1的组培苗上观察“微菌核”结构);
图8:不同处理下DSE真菌FL1对蓝莓组培苗的促生效果;
图9:DSE真菌FL1处理下蓝莓苗的根系图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
实施例1:DSE真菌的组织分离
(1)清洗消毒:从高坡选取表面健康无病斑的6年生蓝莓(圆蓝),在蓝莓茎干直径25cm内且距土壤表面5-25cm的范围里取1.5kg的蓝莓根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗3次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.45-0.55cm长度,得到清洗消毒后的蓝莓根段;
(2)培养分离纯化:将清洗消毒后的蓝莓根段夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复5次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
PDA培养基配方:由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
实施例2:DSE真菌的组织分离
(1)清洗消毒:从麻江选取表面健康无病斑的5年生蓝莓(粉蓝)根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗2次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.40-0.55cm长度,得到清洗消毒后的蓝莓根段;
(2)培养分离纯化:将清洗消毒后的蓝莓根段夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复4次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
PDA培养基配方:由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
实施例3:DSE真菌的组织分离
(1)清洗消毒:从凤冈选取表面健康无病斑的8年生蓝莓(奥尼尔)根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗3次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.5-0.55cm长度,得到清洗消毒后的蓝莓根段;
(2)培养分离纯化:将清洗消毒后的蓝莓根段夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复4次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
PDA培养基配方:由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
实施例4:DSE真菌的组织分离
(1)清洗消毒:从高坡选取表面健康无病斑的5年生蓝莓(莱格西)根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗2次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.45-0.6cm长度,得到清洗消毒后的蓝莓根段;
(2)培养分离纯化:将清洗消毒后的蓝莓根段夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复3次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
PDA培养基配方:由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
实施例5:DSE真菌的组织分离
(1)清洗消毒:从麻江选取表面健康无病斑的7年生蓝莓(莱格西)根部,用清水洗净后滤纸控干,移至超净工作台里,置于在75%乙醇溶液中浸泡30s,用无菌水冲洗3次,转入5%NaClO溶液中消毒3min,再用无菌水润洗5次,使用已灭菌的滤纸控干根段的水分,用已灭菌的剪刀与镊子将处理好的根段剪成0.45-0.50cm长度,得到清洗消毒后的蓝莓根段;
(2)培养分离纯化:将清洗消毒后的蓝莓根段夹入已灭菌且已加入0.1g氯霉素的PDA培养基中,置于恒温培养箱培养,28℃条件下避光培养,待培养皿内有深色菌丝长出后,将边缘菌丝挑到新的PDA培养基中继续培养,重复4次后即可得到纯培养菌株,得到DSE真菌FL1。
PDA培养基配方:由200g马铃薯、20g葡萄糖和20g琼脂溶于1000mL水中制成,pH自然。
实施例5:DSE真菌FL1促进蓝莓组培苗生长方法
在无菌的MEA液体培养基中接种2mmDSE真菌FL1菌柄,放入25℃,180rpm/min的恒温震荡培养箱中进行震荡培养。当培养液呈现浅棕色,菌球大小适中、密度较高时,取出,作为菌苗共培养的液体种子。无菌环境下,选取长势一致且已生根的蓝莓组培苗(莱格西)至装有苔藓培养基的组培瓶里,每瓶放置两棵组培苗,移至温度25℃、光照强度为0.6、半光照半黑暗的条件下培养45d,取3mL已培养好的MEA液体培养基里DSE真菌悬浮液至蓝莓组培苗根部。
实施例6:DSE真菌FL1促进蓝莓实生苗生长方法
挑选出促生效果较好且为优势种的DSE真菌(FL1),挑取其边缘菌丝在PDA培养基上培养7d,将新的菌落边缘的菌丝接种至PDB培养基里,并移至28℃、150rpm/min的条件下培养7d。因为菌株FL1不产孢,则将DSE真菌菌株的发酵液用破壁机将其打碎,用蒸馏水将发酵液菌丝悬液配制成菌丝终浓度为1×106个/mL。选取健康无病害且长势一致的一年生蓝莓盆栽苗(莱格西),将其移栽至已灭菌1h的营养土里,每盆营养土移栽一棵蓝莓苗,醒苗14d后将上述菌丝悬浮液从蓝莓苗根部灌溉。
本发明做了大量分析验证实验,以下为本发明实验研究的结果:
1、DSE真菌FL1的分离鉴定方法
1.1DSE真菌FL1的分离方法采用实施例1的方法进行分离得到DSE真菌FL1。
1.2鉴定方法
DSE真菌形态学鉴定
通过菌落形态和显微形态的观察对菌株进行形态鉴定,取6mm已纯化DSE真菌菌落边缘菌丝,接种到PDA中央并移至28℃条件下20d,观察菌落的宏观形态及大小、菌丝密度等,参照《真菌鉴定手册》对菌株形态进行鉴定。图1示菌落灰黑色,有裂褶,毯状,背面黑色,边缘锯齿状。
无菌条件下,挑取培养皿新鲜菌丝体置于放有载玻片的培养皿上,培养第7d时,在边缘菌丝体上盖上盖玻片,通过电子荧光显微镜观察菌丝的形态结构特征并拍照。图1示菌丝浅褐色,细长,隔间距15-30,细,不产孢。
DSE真菌分子生物学鉴定。
使用Fungal DNA Midi Kit真菌DNA提取试剂盒(OMEGA)提取真菌的DNA作为模板,利用真菌通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)进行PCR扩增,然后移交至重庆擎科兴业生物技术有限公司进行测序。获得结果与NCBI数据库相近序列比对。利用MEGA7.0中的Clustal W做序列比对,MEGA7.0中邻接法(neighbor joining,NJ)构建所分离菌株的系统发育树。
2、DSE真菌FL1的筛选
将已活化的DSE真菌FL1(d=0.6cm)接种在PKO无机磷培养基上,28℃培养7d后,根据是否存在透明溶磷圈来判定菌株是否具备溶磷能力,同时测定菌株的溶磷圈直径D值与菌落直径d值的比值并计算。结果见图2和表1。
无机磷培养基(PKO):Ca3(PO4)2 3.0g,蔗糖10.0g,NaCl 0.5g,KCl 0.2g,(NH4)2SO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.1g,MnSO40.004 g,酵母膏0.5g,FeSO40.004g,蒸馏水1000mL,琼脂15.0g,pH 7.0。
表1.DSE真菌FL1溶磷圈直径与菌落直径于固体PKO培养基中D/d值
菌株Strain D(mm) d(mm) D/d
FL1 17.47±0.09 9.47±0.03 1.84±0
注:数据为平均数±标准误
3、DSE真菌FL1的溶磷效果测定
3.1发酵液制备:以PKO培养基不加琼脂作为PKO液体培养基,每个锥形瓶各添加150mL,无菌条件下,取5块直径8.0mm的DSE真菌FL1菌饼分别放入呈有发酵液的锥形瓶中,移至摇床,于28℃、150r/min转速下培养7d,得到发酵液;
每天取发酵完成的发酵液进行测定其有效磷含量,并用pH计测定pH值。
3.2 2,4-二硝基酚指示剂的制备:0.25g二硝基酚定容至100ml水中。
3.3 100mg/L的标准磷溶液:放置磷酸二氢钾在45℃环境干燥6h后称取0.4394g,移至400mL蒸馏水中充分溶解,加入5mL浓硫酸,蒸馏水稀释至1L,摇匀。
3.4钼锑抗贮存液:配制浓度为0.5%的C8H4K2O12Sb2的溶液。另取10g H8MoN2O4于450mL蒸馏水中混匀,慢慢添加153mL浓硫酸并搅动。最后,在H8MoN2O4溶液中添加100mL浓度为0.5%的C8H4K2O12Sb2溶液,蒸馏水定容至1L并混匀,储藏于深棕色的瓶子里。
配制浓度为0.5%的C8H4K2O12Sb2的溶液。另取10gH8MoN2O4于450mL蒸馏水中混匀,慢慢添加153mL浓硫酸并搅动。最后,在H8MoN2O4溶液中添加100mL浓度为0.5%的C8H4K2O12Sb2溶液,蒸馏水定容至1L并混匀,储藏于深棕色的瓶子里。
3.5钼锑抗显色剂:临用前于100mL钼锑抗贮存液中加入1.5g左旋抗坏血酸。
3.65mg/L磷溶液:临用前取“3.3项”100mg/L标准磷溶液10mL置于量筒中,蒸馏水定容至200mL。
3.7发酵液有效磷含量测定:取5mL发酵液,12000r/min离心5min后,取3ml上清液作为待测液置于50ml锥形瓶中。
3.8磷准液的配置:将100mg/L的磷标液稀释为5mg/L,取0、2、4、6、8、10mL的5mg/L的磷标液至50mL锥形瓶中,添加蒸馏水至30mL,分别得到0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1mg/L的磷标液;
3.9测定方法:取“3.1项”的发酵液、0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L和1mg/L的磷标液分别各加2滴2,4-二硝基酚指示剂,再各逐滴加入4mol/L的NaOH至锥形瓶中液体现微黄色,并添加浓度为1mol/L的H2SO4至黄色褪去,再分别添加5mL钼锑抗显色剂,快速摇匀后,加蒸馏水至50mL标线位置,2h后分光光度计700nm波长测定吸光度值。以未接菌的PKO液体培养基为参比液,设定吸收值为零,分别测定不同标准液和发酵液的显色值,绘制磷标准曲线,并在磷标准曲线上计算发酵液的磷浓度。
计算公式:有效磷含量P(μg/mL)=(ρ×V×Ts)/Vo
ρ:有效磷(p)的质量浓度(μg/mL);V:定容体积(mL)(此处为50mL);Ts:分取倍数(此处为17倍);Vo:加入发酵液的体积(mL)(此处为3mL)
将DSE真菌FL1菌株进行有效磷含量的测定,菌株在7d内的有效磷含量变化如图3所示。
4、DSE真菌FL1发酵液中pH值的变化情况
在测菌株有效磷含量的同时,利用pH计测定菌株PKO发酵液的pH值,得出DSE真菌FL1与未接菌的PKO液体培养基7d内的pH值变化,见图4。
5、DSE真菌FL1在蓝莓组培苗的促生效果
在无菌的MEA液体培养基中接种2mmDSE真菌FL1菌柄,放入25℃,180rpm/min的恒温震荡培养箱中进行震荡培养。当培养液呈现浅棕色,菌球大小适中、密度较高时,取出,作为菌苗共培养的液体种子。无菌环境下,选取长势一致且已生根的蓝莓组培苗(莱格西)至装有苔藓培养基的组培瓶里,每瓶放置两棵组培苗,移至温度25℃、光照强度为0.6、半光照半黑暗的条件下培养45d,取3mL已培养好的MEA液体培养基里DSE真菌悬浮液至蓝莓组培苗根部,以未接菌的蓝莓组培苗为对照,以上实验重复五次。
MEA液体培养基:葡萄糖20g,大豆蛋白胨3g,麦芽浸粉30g,pH 5.4±0.2。于500mL三角瓶中倒入200mL MEA液体培养基,121℃高压灭菌20min。
苔藓培养基:用蒸馏水将干苔藓浸泡24h后将苔藓取出,除掉苔藓约50%的水分,然后将苔藓分装至组培瓶内,苔藓的量约占组培瓶容积的1/3,然后将组培瓶擦干净,将高温高压灭菌锅灭菌条件设置为121℃灭菌2h。
将蓝莓组培苗与DSE真菌FL1共生培养45d后的莱格西组培苗的根系处理后,能观察到DSE真菌FL1菌丝和微菌核结构,未接菌的组培苗上则未观察到DSE真菌结构(图5)。
表2 DSE真菌FL1回接至蓝莓组培苗的苗高
CK FL1
苗高 8.24±0.78 8.95±0.33
注:数据为平均数±标准误
6、DSE真菌FL1在蓝莓盆栽苗的定殖情况
蓝莓实生苗(盆栽苗)与DSE真菌FL1共生培养方法:挑取其边缘菌丝在PDA培养基上培养7d,将新的菌落边缘的菌丝接种至PDB培养基里,并移至28℃、150rpm/min的条件下培养7d。因为菌株FL1不产孢,则将DSE真菌菌株的发酵液用破壁机将其打碎,用蒸馏水将发酵液菌丝悬液配制成菌丝终浓度为1×106个/mL。选取健康无病害且长势一致的一年生蓝莓盆栽苗(莱格西),将其移栽至已灭菌1h的营养土里,每盆营养土移栽一棵蓝莓苗,醒苗14d后将上述菌丝悬浮液从蓝莓苗根部灌溉。采样后14d内,用无菌水将蓝莓根样洗净后将根剪成约1cm长大小,在每个样本里随机取30根段,移入10%KOH的试管里,100℃下解离约1h后,取出根样,无菌水洗3-4次后转至乳酸溶液里中和10min,随后置于0.5%酸性品红溶液染色30s,再使用乳酸甘油(乳酸:甘油:蒸馏水=1:1:1)脱色2-3次,用滤纸控干根段后对其进行压片制片,微分干涉显微镜下观察DSE真菌的形态结构及侵染状况,并记录DSE真菌的侵染数量。分别计算单个根样的DSE真菌的定殖率和定殖强度,计算方法为:定殖率(%)=定殖根段数/被镜检根段总数×100%;定殖强度(%)=(Σ每根段定殖的长度/每根段的总长度)×100%。
将蓝莓盆栽苗与FL1共生培养60d后,随机取出30个根段在显微镜下观察,能观察到DSE真菌FL1菌丝和微菌核结构。见图7和表3。
表3 DSE真菌FL1回接至蓝莓盆栽苗的定殖情况
微菌核 菌丝 总定殖率 定殖强度
CK 23.33±0.33 26.67±0.33 33.33±0.33 13.33±0.33
FL1 36.67±0.67 53.33±0.33 86.67±0.33 29.00±0.58
注:数据为平均数±标准误
7、DSE真菌FL1对蓝莓盆栽苗的生长和生物量的影响
DSE真菌FL1菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,莱格西盆栽苗的生长情况见图8和表4。
表4不同处理下DSE真菌FL1对蓝莓组培苗生长和生物量的影响
注:数据为平均数±标准误
8、DSE真菌FL1对蓝莓盆栽苗的根系影响
DSE真菌FL1处理下蓝莓苗的根系生长情况见图9和表5。
表5不同处理下蓝莓苗的根系的长度、表面积、体积、根尖数和分叉数
处理 长度(cm) 表面积(cm2) 体积(cm3) 根尖数 分叉数
CK 484.99±31.51 128.93±5.35 8.63±0.17 1620.67±57.62 3227±109
FL1 1015.41±23.24 268.05±19.15 19.23±1.04 3038±98.65 7366.33±28.24
注:数据为平均数±标准误
9、DSE真菌FL1对蓝莓苗的根系活力及叶绿素含量的影响
将不同处理下的DSE真菌FL1菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,测定不同处理下的蓝莓苗根系活力和叶绿素含量,见表6。
表6不同处理下蓝莓苗的根系活力及叶绿素含量
10、DSE真菌对蓝莓苗养分的影响
将DSE真菌FL1菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,对蓝莓苗的全氮、全磷和全钾进行测定,见表7。
表7 DSE真菌FL1对蓝莓苗养分的影响
处理 全氮(g/kg) 全磷(g/kg) 全钾(g/kg)
CK 5.6±0.21 8.21±0.01 8.08±0.04
FL1 9.43±0.19 10.6±0.63 9.08±0.19
11、DSE真菌FL1对蓝莓苗可溶性糖和可溶性蛋白的影响
将不同处理下的DSE真菌FL1菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,测定蓝莓苗的可溶性糖及可溶性蛋白,见表8。
表8 DSE真菌FL1对蓝莓苗可溶性糖和可溶性蛋白的影响
12、DSE真菌FL1对蓝莓苗抗氧化酶的影响
将不同处理下的DSE真菌菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,测定蓝莓苗的SOD、POD和CAT酶活,见表9。
表9 DSE真菌FL1对蓝莓苗SOD、POD和CAT酶活的影响
13、DSE真菌FL1对蓝莓苗根围土壤养分的影响
将不同处理下的DSE真菌FL1菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,测定蓝莓苗的根围土壤养分,结果如表10所示。
表10 DSE真菌FL1对蓝莓苗根围土壤养分的影响
14、DSE真菌FL1对蓝莓苗根围土壤酶活的影响
将不同处理下的DSE真菌菌株接种至莱格西盆栽苗60d后,测定蓝莓苗的根围土壤酶活,结果如表11所示。
表11蓝莓DSE真菌FL1对蓝莓苗根围土壤酶活的影响
处理 酸性磷酸酶(U/g) 碱性磷酸酶(U/g) 脲酶(U/g)
CK 23620.22±35.27 21166.43±29.93 568.49±4.48
FL1 27352.97±177.52 35927.32±448.16 641.68±5.46
15、结论
因贵州大部分地区的土壤缺磷,且土壤里的大部分磷为无效磷,无法被植物所吸收。所以本次主要是研究蓝莓DSE真菌的溶磷促生功能,将所选促生效果好且为优势种的菌株FL1接种至蓝莓盆栽苗上,观察其接种效果。结果表明不同处理组的根系均能观察到DSE真菌菌丝和微菌核结构,且在苗高、地径、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重上,各接菌处理的蓝莓苗均显著高于对照处理。处理组的根系长度、表面积、体积、根尖数均显著高于对照组,说明该处理组可以吸收到更深层土壤里的养分和水分。根系表面积的大小决定植物根部与土壤的接触面,根系表面积增加,说明植物可以吸收到土壤里更多的水分及养分;植物根系是植物吸收、传送营养物质的主要器官,它的生长状态在基本决定植物获取水分和养分的能力,因此根系活力是判断植物的根系生理状况的重要指标,处理组的根系活力也高于对照组。植物的光合作用是其生物产量的基础,而植物叶绿素是其光合作用过程中不可或缺的光催化剂,因此植物叶绿素的含量和比例值常作为植物是否适应其生长环境的一个重要评估因素。本试验中处理组的叶绿素含量比对照组高。氮、磷和钾是植物在生长发育过程中所必须的营养元素,其中植物对磷、钾元素的吸收量对于日后植物形成果实十分重要。处理组的蓝莓苗的氮、磷和钾元素均显著提高,说明接种菌株FL1可以提高蓝莓果实的产量。当植物处于逆境时,其体内的蛋白质的含量会直接发生变化,因此评价植物的新陈代谢及生理状态的重要指标之一就是植物体内可溶性蛋白的含量。处理组的可溶性蛋白含量比对照组高。植物体内的抗氧化酶使得其细胞内的活性氧物质产生和清除保持动态平衡,同时其也是植物在胁迫环境下产生的一种防御机制,其中抗氧化酶包括SOD酶、POD酶、CAT酶。测定已接菌处理的蓝莓苗的SOD酶、POD酶和CAT酶活均高于未接菌的对照组,说明接种菌株FL1后可提高蓝莓植物自身的抗病性。接种菌株FL1后土壤里的pH值均有所降低,可能是因为DSE真菌分泌有机酸导致pH值得以降低,因为蓝莓喜酸性土壤,接种DSE真菌使得其根围土壤pH值降低后更适宜蓝莓苗的生长。接种后的蓝莓根围土壤有机质、全氮、全磷、速效磷均高于对照组,处理组土壤酶活均高于对照组。
测序结果
蓝莓DSE真菌FL1(Thozetella neonivea)
GenBank:OM234783.1
ITS rDNA序列:
CATTACAGGATTCGCAAGAACTCCCGTACCACTGTGAACTTTACCTTTTGTTGCCTCGGCGGGTGCTGGG
TCTTCCCAGCGCTCCAGCCCGCCGACGGCCCACAACTCATTGTCTGATTTATGCATCTCCGAGCCATACA
CAAACGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
TAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCGGTATTC
CGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAGGCCTCGCCTGGTGTTGGGGCTCCTGCGCACT
GCAGGCCCTCAAAGGCAGCGGCGGGTGCGCCTACGAACCGAACGCAGTAGTTTTCTCTCGTTCTGGTCTT
GCGGGCGTGCTCCGGCCGTTAAACCCCCTTTATATTCAATGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCG
CTGAACTTAAGCATATCTAAAGCCGGAAGGAAA。

Claims (6)

1.一株促进蓝莓生长的深色有隔DSE真菌FL1,其特征在于:所述的DSE真菌FL1分类学名为Thozetella neonivea,于2022年11月08日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心,保藏号为CGMCC No.40412。
2.一种包含权利要求1所述的DSE真菌FL1的促蓝莓生长剂。
3.如权利要求1所述的DSE真菌FL1的应用,其特征在于:所述DSE真菌FL1在制备促进蓝莓根际生长的制剂方面的应用。
4.一种蓝莓生长促生菌制品,其特征在于:所述制品的活性成分包括权利要求1所述的DSE真菌FL1。
5.一种蓝莓生长促生菌制品,其特征在于:所述制品的活性成分是权利要求1所述的DSE真菌FL1。
6.一种蓝莓生长促生菌制品的制备方法,其特征在于:采用权利要求1所述的DSE真菌FL1作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。
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