CN109134081A - 一种富含功能性多糖的生物肥料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富含功能性多糖的生物肥料及其制备方法。本发明采用牛蒡根、牛蒡叶、金针菇菌糠等为主要原料，接种米曲霉、哈茨木霉和绿色木霉三种丝状真菌进行固态混菌发酵，然后加入复合酶进行酶解和浸提，淋出浸提液，加入调质剂即得生物肥料。该生物肥料为水溶性的液体肥料，有利于水肥一体化施肥。该肥料含有功能性微生物及其代谢产物、牛蒡多糖等多种有益成分，具有提高植物抗病与抗逆能力、促进生长、增加产量、提高农产品品质的作用。

Description

一种富含功能性多糖的生物肥料及其制备方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，涉及一种生物肥料，更具体涉及一种以牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠为主要原料，通过发酵与酶解法制备的富含功能性多糖的生物肥料。

背景技术

牛蒡是一种药食两用植物，富含牛蒡多糖、蛋白质、多酚、绿原酸等营养成分和功能性成分，具有很高的食用、药用和农业应用价值。牛蒡多糖具有促进植物生长、提高植物的抗病与抗逆能力的作用。张玉凤等^[1]研究了牛蒡多糖对西瓜苗生长、枯萎病发病情况和生理指标的影响，结果表明，喷施牛蒡多糖可降低西瓜枯萎病的发病率，西瓜单株鲜质量、株高、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)活性分别增加，丙二醛(MDA)、氧自由基(O2-·)产生速率降低，枯萎病发病率大幅度下降。郝林华等^[2]研究了牛蒡多糖对黄瓜生长发育的影响及抗低温胁迫的生理效应，结果表明，牛蒡多糖可显著促进黄瓜种子及幼苗的生长和根系发育，促进壮苗的形成；在低温胁迫环境下，牛蒡多糖可显著提高黄瓜叶片细胞膜的稳定性，提高抗氧化酶活性，提高抗冷性。郝林华、伊艳杰等^[3-5]分别研究了牛蒡多糖对黄瓜白粉病和小麦白粉病抗性的影响，结果表明，适宜浓度的牛蒡多糖能增强植物对白粉病的系统抗性。王凤德^[6,7]研究了牛蒡多糖溶液对采后番茄抗病性的影响，结果表明，牛蒡多糖具有与壳聚糖类似的功能，可有效提高番茄果实对自然病害的抗性以及对接种灰霉病的抗性。董亮等^[8]研究了牛蒡粗提液和牛蒡多糖对菠菜生长及品质的影响，研究结果表明，无论是牛蒡粗提液还是牛蒡多糖溶液，均能促进生长和改善品质，且与牛蒡多糖相比，粗提液的促进效果更好，原因在于粗提液除牛蒡多糖外，还含有多种活性成分。除牛蒡多糖外，牛蒡根与牛蒡叶中的次生代谢物质，如多酚、绿原酸等也具有提高作物抗病、抗逆能力，提高产量和品质的作用。林学政等^[9]研究了牛蒡叶绿原酸对植物病原真菌孢子萌发的影响及其对黄瓜枯萎病和辣椒疫病的防效，结果表明，绿原酸对病原真菌孢子的萌发均有一定的抑制作用，对黄瓜枯萎病和辣椒疫病均有良好的防治效果。

然而，虽然相关研究已证实牛蒡中的多糖等功能性成分在促进植物生长和提高植物的抗病与抗逆能力方面具有重要作用，但却罕有将其开发成产品应用于农业生产的案例，其主要原因是：现有生成提取工艺制备的产品成本高、功能性成分少，应用效果不理想。单纯的牛蒡提取物的促生与抗病作用也不足以满足生产需要，必须和其他有效成分配合使用，才能获得理想效果。发酵与酶解一方面可以提高牛蒡中多糖等有益成分的浸出率，另一方面发酵生成的微生物及其代谢产物也具有促生与抗病的作用，因此，通过发酵与酶解的方式对牛蒡进行深加工制备生物肥料，是一种具有应用潜力的技术方案。中国专利申请CN201710236114.X(一种双源腐植酸生物肥料及其制备方法)提供了一种以灵芝菌糠、牛蒡叶和风化煤为主要原料进行酶解与发酵制备双源腐植酸生物肥料的方法，该方法虽然采用牛蒡叶作为生产原料之一，但是仍然存在以下不足需要改善：(1)其技术原理是对牛蒡叶进行发酵和腐熟，转化为生物腐植酸，生产周期长达15-28天，牛蒡叶使用量也仅为20-30％，对牛蒡叶的综合利用效率较低；(2)所发明的双源腐植酸生物有机肥是一种固体肥料，不溶于水，不适用于水肥一体化的施肥方式；(3)未能提供对牛蒡根下脚料进行综合利用的方法。

针对上述不足，本发明旨在提供一种生产原料中牛蒡叶和牛蒡根所占比例大、生产周期短、生产效率高、产品可溶于水、适用于水肥一体化的生物肥料产品及其制备方法。

我国牛蒡种植面积超过2.3万公顷，除牛蒡根用于食用、牛蒡子用于药材之外，牛蒡叶及牛蒡根深加工的下脚料大多被废弃，未能充分进行综合利用。本发明采用发酵与酶解的方法对牛蒡叶和牛蒡根废弃物进行深加工，提取有效成分，生产功能性生物肥料，不仅可提高其经济价值，还可促进牛蒡种植业的发展壮大，具有重要意义。

参考文献：

[1]张玉凤,董亮,宋效宗,王江涛,郭洪海,罗加法.不同浓度牛蒡寡糖对西瓜苗生长和抗枯萎病的影响[J].华北农学报,2016,31(S1):340-344；

[2]郝林华，陈靠山，李光友.牛蒡寡糖促进黄瓜生长及抗低温胁迫的生理效应[J].上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(1)：6-12；

[3]郝林华，石红旗，孙丕喜，等.牛蒡寡糖对黄瓜植株生理生化特性的影响[J].西北植物学报，2006，26(8)：1612-1616；

[4]郝林华，孙丕喜，石红旗，等.牛蒡寡糖诱导黄瓜对白粉病的抗性[J].上海交通大学学报(农业科学版)，2006，24(5)：441-447；

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[6]王凤德.牛蒡低聚果糖诱导植物抗病的分子机制研究[D].济南：山东大学，2009；

[7]Wang Feng-de,Feng Gui-hua,Chen Kao-shan.Defense responses ofharvested tomato fruit to burdock fructooligosaccharide,a novel potentialelicitor[J].Postharvest Biology and Technology.2009,52:110-116；

[8]董亮，张玉凤，王学君，等.牛蒡提取物对菠菜生长及品质的影响[J].植物营养与肥料学报，2009，15(3)：729-732；

[9]林学政，柳春燕，何培青，等.牛蒡叶内绿原酸抑制植物病原真菌的研究[J].植物保护，2005，31(3)：35-38。

发明内容

本发明针对现有技术存在的诸多不足之处，提供了一种富含功能性多糖的生物肥料及其制备方法。本发明是将牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠和尿素按比例混合后，采用微生物进行发酵，然后采用复合酶进行酶解，使纤维素、蛋白质等大分子物质降解为小分子多糖、氨基酸等可溶性成分，同时，生成大量有益微生物及其代谢产物，得到一种适用于水肥一体化，具有“增强植物抗病与抗逆能力、促进植物生长、提高作物品质的作用”的生物肥料产品。

本发明所采用的技术方案如下：一种富含功能性多糖的生物肥料，由以下重量份的原料经发酵和酶解制成：：牛蒡叶50-60份，牛蒡根25-30份，金针菇菌糠15-20份，尿素0.2-0.5份，KCl 3-5份，米曲霉菌种0.1-0.2份，哈茨木霉菌种0.1-0.2份，绿色木霉菌种0.1-0.2份，复合酶制剂0.1-0.2份，调质剂1-2份。

其中，所述的牛蒡叶为牛蒡根和牛蒡子采收后剩余的叶子，晒干或自然风干，无腐烂与霉变；其水分含量10-20％、干物质含量80-90％。

其中，所述的牛蒡根来源于牛蒡根深加工制备牛蒡茶时产生的下脚料，主要为牛蒡根碎屑等，无腐烂与霉变，其水分含量10-20％，干物质含量80-90％。

其中，所述的金针菇菌糠来源于金针菇采收后剩余的新鲜菌糠，无腐烂与霉变；其主要栽培基质为木屑、麸皮等；其水分含量60-70％，干物质含量30-40％。

所述复合酶制剂由纤维素酶、中性蛋白酶和几丁质酶三种酶与填充物葡萄糖复配而成；复合酶中各种酶的酶活力为：纤维素酶10000-20000u/g、中性蛋白酶10000-20000u/g、几丁质酶10000-20000u/g。

所述调质剂的组成以重量百分比计为：柠檬酸60-80％、苯甲酸钠8-12％、十二烷基磺酸钠8-12％、维生素C 8-12％；采用这种组成的调质剂可以有效调节产品的pH值、界面张力、浸润性等物化性质，同时具有防腐、抗氧化、提高产品生物稳定性的作用。

所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种、绿色木霉菌种均为采用麸皮固体培养基培养的麸皮固体培养物，其孢子含量均为(1-2)×10⁹cfu/g。优选的，所述麸皮固体培养基具体为：麸皮100份、柠檬酸1.8-2.2份、水90-110份。

其中所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种和绿色木霉，其原种优选源于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号分别为ACCC31491、ACCC30371和ACCC30206。其中米曲霉具有较强的蛋白酶产生能力，哈茨木霉和绿色木霉具有较强的纤维素酶产生能力，同时，三种真菌均具有促进植物生长、增强植物抗病能力、提高植物系统抗性的作用。

牛蒡叶和牛蒡根中含有的大量营养成分，可以为发酵提供营养物质。添加部分金针菇菌糠和尿素，具有调节基质碳氮比和透气性的作用；

除此之外，本发明还进一步公开了所述生物肥料的制备方法，具体步骤如下：

1)取组方量的牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠和尿素混合均匀，加水调节初始含水量为50-55％(质量百分数)并灭菌；

2)然后按组方量接入哈茨木霉和绿色木霉菌种，并转入发酵罐中，于25-35℃进行间歇通风好氧发酵，20-28h后，再按组方量接入米曲霉菌种，搅拌均匀，继续发酵2-4d，待物料长满绿色或黄绿色孢子，蛋白酶活力≥2000u/g干曲，纤维素酶活力≥300u/g干曲时，即可停止发酵；

3)发酵结束后，将发酵料转入罐底具有筛板的不锈钢浸提罐中，按组方量加入KCl和复合酶，同时加入清水，搅拌均匀，升温至35-40℃，酶解与浸提48-72h，然后淋出浸提液；

4)将组方量的调质剂加入浸提液中，混合均匀，即为本发明所述的生物肥料。

优选的，所述步骤1)的灭菌为：转入蒸球中，于0.11MPa下蒸煮灭菌10-15min；灭菌结束后，风冷至25-35℃。

优选的，所述步骤2)的发酵罐为带机械搅拌的卧式固态发酵罐，装料系数0.3-0.4。

优选的，所述步骤3)的发酵料与清水重量比为1：0.8-1.2。

上述方法所获得的生物肥料，其有机质含量≥80mg/mL，多糖含量≥5mg/mL，有效活菌数(孢子数)≥5×10⁸cfu/mL。

本发明的技术特点及有益效果：

1)本发明采用米曲霉、哈茨木霉和绿色木霉等三种真菌进行固态混菌发酵，其优点是米曲霉产蛋白酶能力强，绿色木霉和哈茨木霉产纤维素酶能力强，三者混菌发酵，酶系互补，有利于发酵基质的分解、可溶性物质的浸出、菌丝体的生长、孢子的形成和代谢产物的分泌，从而提高产品质量。

2)本发明采用金针菇菌糠做为辅料，有利于调节发酵基质的透气性和碳氮比，同时，金针菇菌糠中富含金针菇菌丝体产生的多糖、蛋白质和其他有益代谢产物，这些成分可部分浸出，进入产品，提高产品的应用效果。

3)本发明采用先发酵后酶解的生产工艺，其优点是：发酵过程中，三种真菌可产生多种水解酶类，这些酶在酶解过程中可充分发挥水解作用，从而提高可溶性物质浸出率。同时，酶解过程中外加的复合酶，可弥补上述内源酶系的不足，特别是几丁质酶，有利于促进菌丝细胞壁的分解，从而促进胞内物质的释放。

4)本发明在酶解过程中加入KCl，可有效促进真菌菌丝的自溶，有利于胞内酶和有益代谢产物的释放。

5)本发明的生物肥料富含多种功能性成分，包括：源自牛蒡的多糖、绿原酸等，源自真菌的代谢产物及孢子，源自金针菇菌糠的多糖、多肽、氨基酸及其他代谢产物、酶、KCl等，具有增强植物抗病与抗逆能力、促进植物生长、提高作物品质的作用。

6)与CN201710236114.X相比，本发明大幅度提高了牛蒡叶和牛蒡根下脚料在原料中的百分比，有利于提高其综合利用效率；同时，生产周期大大缩短(7天左右)，所得产品为水溶性的液体肥料，有利于实施水肥一体化施肥，具有显著的经济效益与社会效益。此外，本发明的产品富含哈茨木霉和绿色木霉等生防真菌孢子，其抗病效果优于CN201710236114.X所述双源腐植酸生物有机肥。

具体实施方式

下面结合实施例来进一步说明本发明，可以使本领域技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1：米曲霉、哈茨木霉和绿色木霉菌种的制备

根据本发明，所述米曲霉、哈茨木霉和绿色木霉菌种的制备方法按本领域公知技术即可。本发明提供以下优选方案。其中所述的米曲霉、哈茨木霉和绿色木霉，其原种均购买于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号分别为ACCC31491、ACCC30371和ACCC30206。

(1)米曲霉菌种(ACCC31491)的制备的方法，包括步骤：

a、用PDA斜面培养基将米曲霉菌种活化；

b、摇瓶种子制备：按质量份，取葡萄糖2.5份，酵母粉2.5份，玉米粉45份，水1000份，pH5.5-6.5，0.11MPa压力下灭菌20-30min，制成液体培养基A；将步骤a活化后的米曲霉接入液体培养基A中，于28～32℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养48～72小时，得米曲霉种子液；种子液中的活菌含量为1×10⁷cfu/mL～5×10⁷cfu/mL；

c、固体菌种的制备：制备麸皮固体培养基，灭菌后装入长60cm、宽40cm的曲盘中，料层厚度为5-7cm，接入步骤b培养的米曲霉种子液，接种量为5-10％，于28～32℃培养48～72小时，得米曲霉固体菌种，其孢子数为1×10⁹cfu/g～2×10⁹cfu/g。所述麸皮固体培养基的制备方法为：麸皮100份、柠檬酸2份、水100份，混匀，0.11MPa压力下灭菌20-30分钟。

(2)哈茨木霉菌种(ACCC30371)的制备的方法，包括步骤：

a、用PDA斜面培养基将哈茨木霉菌种活化；

b、摇瓶种子制备:按质量份，取葡萄糖2份，麸皮粉25份，水1000份，pH5.5-6.5，0.11MPa压力下灭菌20-30分钟，制成液体培养基B；将步骤a活化后的哈茨木霉接入液体培养基B中，于28～32℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养48～72小时；得哈茨木霉种子液，其活菌含量为1×10⁷cfu/mL～5×10⁷cfu/mL；

c、固体菌种的制备：制备麸皮固体培养基，灭菌后装入长60cm、宽40cm的曲盘中，料层厚度为5-7cm，接入步骤b培养的哈茨木霉种子液，接种量为5-10％，于28～32℃培养72～96小时，得哈茨木霉固体菌种，其孢子数为1×10⁹cfu/g～2×10⁹cfu/g。所述麸皮固体培养基的制备方法为：麸皮100份、柠檬酸2份、水100份，混匀，0.11MPa压力下灭菌20-30分钟。

(3)绿色木霉菌种(ACCC30206)的制备的方法，包括步骤：

a、用PDA斜面培养基将绿色木霉菌种活化；

b、摇瓶种子制备：按质量份，取葡萄糖2份，麸皮粉25份，水1000份，pH值5.5-6.5，0.11MPa压力下灭菌20-30分钟，制成液体培养基B；将步骤a活化后的绿色木霉接入液体培养基B中，于28～32℃、150-180转/分钟的摇瓶中培养48～72小时，得绿色木霉种子液，其活菌含量为1×10⁷cfu/mL～5×10⁷cfu/mL；

c、固体菌种的制备：制备麸皮固体培养基，灭菌后装入长60cm、宽40cm的曲盘中，料层厚度为5-7cm，接入步骤b培养的绿色木霉种子液，接种量为5-10％，于28～32℃培养72～96小时，得绿色木霉固体菌种，其孢子数为1×10⁹cfu/g～2×10⁹cfu/g。所述麸皮固体培养基的制备方法为：麸皮100份、柠檬酸2份、水100份，混匀，0.11MPa压力下灭菌20-30分钟。

实施例2：

一种富含功能性多糖的生物肥料，其主要原料按重量份计为：牛蒡叶50份，牛蒡根30份，金针菇菌糠20份，尿素0.2份，KCl 5份，米曲霉菌种0.1份，哈茨木霉菌种0.1份，绿色木霉菌种0.1份，复合酶制剂0.1份，调质剂2份。

其中所述的牛蒡叶为牛蒡根和牛蒡子采收后剩余的叶子，晒干或自然风干，无腐烂与霉变；其水分含量10-20％、干物质含量80-90％；其中所述的牛蒡根来源于牛蒡根深加工制备牛蒡茶时产生的下脚料，主要为牛蒡根碎屑等，无腐烂与霉变，其水分含量10-20％，干物质含量80-90％；其中所述的金针菇菌糠来源于金针菇采收后剩余的新鲜菌糠，无腐烂与霉变；其主要栽培基质为木屑、麸皮等；其水分含量60-70％，干物质含量30-40％。

所述复合酶制剂由纤维素酶、中性蛋白酶和几丁质酶三种酶制剂与填充物葡萄糖复配而成；复合酶中各种酶的酶活力为：纤维素酶20000u/g、中性蛋白酶20000u/g、几丁质酶20000u/g。

所述的调质剂的组成以重量百分比计为柠檬酸70％、苯甲酸钠10％、十二烷基磺酸钠10％、维生素C 10％。

所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种、绿色木霉菌种均为采用实施例1的方法制备的麸皮固体培养物，其孢子含量均为2×10⁹cfu/g。

所述生物肥料的制备方法，具体步骤如下：

1)取组方量的牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠和尿素原料，混合均匀，加水调节初始含水量为50-55％(质量百分数)，转入蒸球中，于0.11MPa蒸煮灭菌10-15min。

2)灭菌结束后，风冷至25-35℃，按组方量接入哈茨木霉和绿色木霉菌种，并转入带机械搅拌的卧式固态发酵罐中，装料系数0.3-0.4；于25-35℃进行间歇通风好氧发酵，24h后，再按组方量接入米曲霉菌种，搅拌均匀，继续发酵2-4d，待物料长满绿色或黄绿色孢子，蛋白酶活力≥2000u/g干曲，纤维素酶活力≥300u/g干曲时，即可停止发酵。

3)发酵结束后，将发酵料转入罐底具有筛板的不锈钢浸提罐中，按组方量加入KCl和复合酶，同时加入与发酵料等重量的清水，搅拌均匀，升温至35-40℃，酶解与浸提48-72h，然后淋出浸提液。

4)将组方量的调质剂加入浸提液中，混合均匀，即为本发明所述的生物肥料。

所获得的生物肥料，其有机质含量≥80mg/mL，多糖含量≥5mg/mL，有效活菌数(孢子数)≥5×10⁸cfu/mL。

实施例3：

一种富含功能性多糖的生物肥料，其主要原料按重量份计为：牛蒡叶60份，牛蒡根25份，金针菇菌糠15份，尿素0.5份，KCl 3份，米曲霉菌种0.2份，哈茨木霉菌种0.2份，绿色木霉菌种0.2份，复合酶制剂0.2份，调质剂1份。

其中所述的牛蒡叶为牛蒡根和牛蒡子采收后剩余的叶子，晒干或自然风干，无腐烂与霉变；其水分含量10-20％、干物质含量80-90％；其中所述的牛蒡根来源于牛蒡根深加工制备牛蒡茶时产生的下脚料，主要为牛蒡根碎屑等，无腐烂与霉变，其水分含量10-20％，干物质含量80-90％；其中所述的金针菇菌糠来源于金针菇采收后剩余的新鲜菌糠，无腐烂与霉变；其主要栽培基质为木屑、麸皮等；其水分含量60-70％，干物质含量30-40％。

所述复合酶制剂是将纤维素酶、中性蛋白酶和几丁质酶等三种酶制剂与填充物葡萄糖复配而成；复合酶制剂中各种酶的酶活力为：纤维素酶10000u/g、中性蛋白酶10000u/g、几丁质酶10000u/g。

所述的调质剂的组成以重量百分比计为柠檬酸70％，苯甲酸钠10％，十二烷基磺酸钠10％，维生素C 10％。

所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种、绿色木霉菌种均为采用实施例1的方法制备的麸皮固体培养物，其孢子含量均为1×10⁹cfu/g。

所述生物肥料的制备方法，具体步骤如下：

1)取组方量的牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠和尿素混合均匀，并加水调节初始含水量为50-55％(质量百分数)，转入蒸球中，于0.11Mpa蒸煮灭菌10-15min。

2)灭菌结束后，风冷至25-35℃，按组方量接入哈茨木霉和绿色木霉菌种，并转入带机械搅拌的卧式固态发酵罐中，装料系数0.3-0.4；于25-35℃进行间歇通风好氧发酵，24h后，再按组方量接入米曲霉菌种，搅拌均匀，继续发酵2-4d，待物料长满绿色或黄绿色孢子，蛋白酶活力≥2000u/g干曲，纤维素酶活力≥300u/g干曲时，即可停止发酵。

3)发酵结束后，将发酵料转入罐底具有筛板的不锈钢浸提罐中，按组方量加入KCl和复合酶，同时加入与发酵料等重量的清水，搅拌均匀，升温至35-40℃，酶解与浸提48-72h，然后淋出浸提液。

4)将组方量的调质剂加入浸提液中，混合均匀，即为本发明所述的生物肥料。

所获得的生物肥料，其有机质含量≥80mg/mL，多糖含量≥5mg/mL，有效活菌数(孢子数)≥5×10⁸cfu/mL。

实施例4：

一种富含功能性多糖的生物肥料，其主要原料按重量份计为：牛蒡叶55份，牛蒡根27.5份，金针菇菌糠17.5份，尿素0.35份，KCl 4份，米曲霉菌种0.2份，哈茨木霉菌种0.14份，绿色木霉菌种0.14份，复合酶0.14份，调质剂1.5份。

所述复合酶制剂中各种酶的酶活力为：纤维素酶15000u/g、中性蛋白酶15000u/g、几丁质酶15000u/g。所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种、绿色木霉菌种均为实施例1制备的麸皮固体培养物，其孢子含量均为1.5×10⁹cfu/g。

其余同实施例3。

试验例1

以水稻恶苗病为例，通过盆栽实验，说明本发明所述生物肥料对作物病害的防治效果。盆栽实验共设4个处理，如表1所示，每个处理设3组平行，每组15盆，共180盆。实验用陶盆上口内径30cm、盆底内径25cm、高30cm。实验用土的全氮、全磷、全钾分别为1.11、2.03、5.41g·kg^－1，pH 6.47。每盆定植水稻秧苗6棵。实施例2所得生物肥料的施入方式为：每次采用生物肥料2.5mL，稀释100倍后灌根，每7天1次，共6次。水稻恶苗病致病菌采用其孢子悬液，秧苗定植后喷施。CN201710236114.X所述双源腐植酸有机肥的施入方法为：在供试土壤装入陶盆前，与双源腐植酸有机肥混匀，再装入陶盆。栽培管理按常规方式进行，观察记录发病株数和相对病斑高度，并计算病级、病情指数和防治效果。病级、发病率、病情指数及相对防效按下述公式计算：

病级＝(病斑高度/植株高度)×9级

病情指数＝∑(发病水稻数×病情级别数)/(水稻总株数×最高病情级别数)×100％

相对防效(％)＝(T1的病情指数–T2或T3处理的病情指数)/T1的病情指数×100％。

表1盆栽实验设计

实验结果如表2所示，CK发病指数为0，T1发病指数高达60.21％～70.54％，T3的发病指数高达40.61％-57.83％，而T2的发病指数仅为17.45％-26.47％，平均相对防效高达67.66％，这说明实验采用的水稻恶苗病病菌悬液对受试水稻具有较强的致病性，本发明的生物肥料对水稻恶苗病具有良好的防治效果，且其防效高于CN201710236114.X所述双源腐植酸有机肥。

表2生物肥料对水稻恶苗病的防治效果

注：表中数据为3次重复的平均值。“-”表示无。不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan氏新复极差法)。

试验例2

为验证本发明所述生物肥料的应用效果，采用实施例1制备的生物肥料在苹果树上进行了大田实验。选取10年生的富士苹果树，实验处理每次施用生物肥料5L/株，每10天施用1次，连续施用3次。对照处理施用化肥，每次施入的氮、磷、钾和水的量与实验处理相同，每10天施用1次，连续施用3次。按照当地习惯对果树进行常规管理。实验结果如表3所示。

表3生物肥料对苹果产量与品质的影响

从表3可以看出：与对照相比，施用生物肥料的处理苹果产量和单果重增大，总糖、可溶性固形物和Vc含量提高，总酸含量降低，果实品质明显改善。本发明所述生物肥料除可用于果树外，还可用于蔬菜和小麦、玉米、水稻等粮食作物。

Claims (8)

1.一种富含功能性多糖的生物肥料，其特征是，由以下重量份的原料经发酵和酶解制成：牛蒡叶50-60份，牛蒡根25-30份，金针菇菌糠15-20份，尿素0.2-0.5份，KCl 3-5份，米曲霉菌种0.1-0.2份，哈茨木霉菌种0.1-0.2份，绿色木霉菌种0.1-0.2份，复合酶制剂0.1-0.2份，调质剂1-2份。

2.如权利要求1所述的一种富含功能性多糖的生物肥料，其特征是，所述复合酶制剂中的酶及酶活力为：纤维素酶10000-20000u/g、中性蛋白酶10000-20000u/g、几丁质酶10000-20000u/g。

3.如权利要求1所述的一种富含功能性多糖的生物肥料，其特征是，所述调质剂的组成以重量百分比计为：柠檬酸60-80％，苯甲酸钠8-12％，十二烷基磺酸钠8-12％，维生素C 8-12％。

4.如权利要求1所述的一种富含功能性多糖的生物肥料，其特征是，所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种、绿色木霉菌种的孢子含量均为(1-2)×10⁹cfu/g。

5.如权利要求1所述的一种富含功能性多糖的生物肥料，其特征是，所述的米曲霉菌种、哈茨木霉菌种和绿色木霉菌种的保藏编号分别为ACCC31491、ACCC30371和ACCC30206。

6.权利要求1-5中任意一项所述的一种富含功能性多糖的生物肥料的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

1)取牛蒡叶、牛蒡根、金针菇菌糠和尿素混合均匀，加水调节初始含水量为50-55％并灭菌；

2)然后接入哈茨木霉菌种和绿色木霉菌种，并转入发酵罐中，于25-35℃进行间歇通风好氧发酵，20-28h后，再接入米曲霉菌种，搅拌均匀，继续发酵2-4d，待物料长满绿色或黄绿色孢子，蛋白酶活力≥2000u/g干曲，纤维素酶活力≥300u/g干曲时，停止发酵，得到发酵料；

3)发酵结束后，将发酵料转入罐底具有筛板的浸提罐中，加入KCl和复合酶，同时加入清水，搅拌均匀，升温至35-40℃，酶解浸提48-72h，然后淋出浸提液；

4)将调质剂加入浸提液中，混合均匀，即到富含功能性多糖的生物肥料。

7.如权利要求6所述的一种富含功能性多糖的生物肥料的制备方法，其特征是，所述步骤1)的灭菌为：转入蒸球中，于0.11MPa下蒸煮灭菌10-15min；灭菌结束后，风冷至25-35℃。

8.如权利要求6所述的一种富含功能性多糖的生物肥料的制备方法，其特征是，所述步骤2)的发酵罐为带机械搅拌的卧式固态发酵罐。