CN103540556B - 一种淡紫灰链霉菌及其在制备海藻微生物肥料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种淡紫灰链霉菌菌株，其分类命名为淡紫灰链霉菌(Streptomyces Lavendulae)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7548。本发明还涉及淡紫灰链霉菌在发酵海藻渣制备海藻微生物肥料中的应用。本发明所述淡紫灰链霉菌菌株对海藻渣的降解效果突出，不但能将海藻加工行业提取海藻胶以后产生的废渣进行重新利用，而且其发酵过程中产生的抗生素类代谢活性物质能够有效抑制多种致病微生物的生长，具有良好的促生增产功效，在农业生产中效果显著。

Description

一种淡紫灰链霉菌及其在制备海藻微生物肥料中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体地说，涉及一种淡紫灰链霉菌菌株及其在发酵海藻渣制备海藻微生物肥料中的应用。

背景技术

迄今为止，海藻已在食品、海洋药物、动物饲料、有机肥料、化妆品及生物能源等领域和范围内显现出巨大的开发潜力和经济价值。在海藻的加工利用过程中，会产生大量的废弃物——海藻渣，这些海藻渣中含有丰富的海藻酸、甘露醇、甜菜碱、壳聚糖、多酚以及海藻纤维、果胶、蛋白质、木质素等物质。因此，如何将海藻渣进一步加工利用，最大程度的发挥其价值，成为人们日益关心的问题。

中国发明专利CN101439997A公开了一种海藻有机肥的制备方法，利用提取海藻胶后的废渣发酵生产有机肥。针对海藻渣不容易降解导致的发酵困难，在配料中加入1‰～15‰的磷酸二氢钾，使不溶性海藻酸钙转化成可溶性的海藻酸钾，加快海藻渣的发酵和腐熟，缩短发酵时间5～8天，缩短腐熟时间5～10天。

中国发明专利CN101585723A公开了一种海藻生物长效肥的制备方法，以海藻渣为活性载体，将海藻提取物内的多种活性物质和营养成分全部包裹，进行生化反应，制成无毒、无污染、纯天然的海藻生物长效肥。

中国发明专利CN102391030A公开了一种有机海藻肥及其作为高效植物生长调节剂的应用。所述的海藻肥是将鲜海带化工中的海藻渣与麦麸、秸秆、中药渣、果渣、活性污泥或酒糟中的一种或几种混合物的复配物，进行堆肥微好氧发酵而成的有机海藻肥。

中国发明专利CN102408282A公开了一种有机海藻肥及其作为高效盐碱土改良剂的应用，是将海藻工业废渣采用微好氧发酵技术进行发酵腐熟而得到有机海藻肥，或将得到的有机海藻肥与麦麸、秸秆、中药渣、果渣、活性污泥或酒糟中的一种或几种混合物复配而成的复合有机海藻肥。

上述海藻渣肥料的主要缺点是腐熟过程中海藻渣降解效果差，所用微生物多为广谱性菌株，不能专一性地降解海藻渣，腐熟周期长、效率低，而且部分腐熟剂中含有的黑曲霉等还会引起植株软腐病等真菌性病害。此外，这类海藻渣肥多为微生物发酵后再与化肥原料掺混而成，虽然有一定的肥效，但是其中的有效菌大部分已死亡，根本起不到应有的作用，而一些纯粹的微生物发酵产品由于营养匮乏，虽然有效菌较多，但是发挥作用慢，农户认可度低，市场推广应用困难。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种淡紫灰链霉菌菌株，所述淡紫灰链霉菌菌株不仅能够高效降解海藻渣，获得海藻多糖、酚类多聚化合物等海藻活性物质，而且发酵过程中产生的抗生素类代谢活性物质能够有效抑制多种病原微生物的生长，具有良好的促生增产功效。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案之一，是提供一种淡紫灰链霉菌菌株，所述菌株的分类命名为淡紫灰链霉菌(Streptomyces Lavendulae)，已于2013年05月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7548，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

所述淡紫灰链霉菌菌株是由下述方法筛选得到的：

(1)菌种富集

以海藻渣为唯一营养物质配制初筛液体培养基，从海藻腐烂部位挑菌接种，28℃、180rpm摇床培养72h，得富集后的发酵液；

(2)菌种复筛

将步骤(1)所得发酵液进行梯度稀释，在复筛培养基平板上涂布，挑选菌落周围透明圈大的菌株进行划线分离纯化。

优选地，步骤(1)中初筛液体培养基组成为新鲜海藻渣与蒸馏水按1:1重量比混合后打成匀浆，pH7.2-7.5；

优选地，步骤(2)中复筛培养基组成为：海藻酸钠1重量份，添加1-5重量份硫酸铵，1-5重量份氯化钠，1-5重量份KH₂PO₄，0.1-0.5重量份MgSO₄·7H₂O，0.1-0.5重量份CaCO₃，用氨水调节pH至7.2-7.5。

本发明所采用的技术方案之二，是提供上述淡紫灰链霉菌在制备海藻微生物肥料中的应用。

优选地，所述海藻微生物肥料中淡紫灰链霉菌的有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/g。

优选地，所述海藻微生物肥料对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、串珠镰刀菌、苹果黑腐皮壳菌、小麦根腐病菌、玉米小斑病菌、禾生炭疽病菌有抑菌活性。

本发明通过固态浅盘发酵技术发酵能够高效降解海藻渣的淡紫灰链霉菌，使海藻废渣中的难以被农作物利用的营养物质通过微生物的分解代谢，转化为易被植物吸收的小分子活性物质，同时所得海藻微生物肥料还含有高活菌数的生防放线菌淡紫灰链霉菌(保藏号为CGMCC No.7548)及其代谢活性物质，实现了传统海藻有机肥与活菌制剂的有机结合。

在本发明中，首先利用海藻渣筛选出不仅能够高效降解海藻渣，同时对农作物具有抗病促生功能的生防放线菌淡紫灰链霉菌，继而对该菌株的发酵培养基及固态发酵工艺进行优化，通过浅盘发酵的方式进行规模化生产，获得海藻活性微生物肥料。利用本发明的方法生产的产品不仅具有传统的海藻有机肥所含的海藻活性物质，而且具有活菌制剂的活体调节功能，在促进生长、改良土壤、增强作物抗逆性方面效果显著。

本发明具有的有益效果：

(1)所用的生防菌淡紫灰链霉菌对海藻渣的降解效果突出，其发酵过程中产生的抗生素类代谢活性物质不仅能够有效抑制多种致病微生物的生长，而且具有良好的促生增产功效，在农业生产中效果显著。

(2)变废为宝，将海洋藻类特有的营养活性物质与活菌制剂有效结合，补充单一产品的不足。

(3)海藻废渣价格低廉，处理工艺简单，便于进行规模化生产。

(4)浅盘固态发酵过程粗放，对设备无菌条件要求低，而且后处理简便，无废水废料生成，投资少、能耗低、无污染、易操作。

(5)发酵培养基设计合理，目标菌株容易生长，培养周期短，有效活菌数远远高于液态发酵，达到1.0×10¹⁰CFU/g以上。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的详细说明。

(一)淡紫灰链霉菌(Streptomyces Lavendulae)CGMCC No.7548的获得方法：

(1)样品收集

从青岛明月海藻集团原料存放处取样，选取泡叶藻、马尾藻、海带等藻类的腐烂部位作为待筛分样品，用牛皮纸袋装好，得到6个待筛样品；

(2)初筛培养基配制

取新鲜的海藻渣150g，加入150ml蒸馏水，用打浆机打成匀浆，调节pH至7.5，分装至250ml三角瓶中，每瓶50ml，灭菌后备用。

(3)富集培养

用接种环分别从6个样品中挑取腐烂部位接种至步骤(2)中三角瓶中，28℃、180rpm摇床培养72h，得富集后的发酵液；

(4)复筛培养基配制

称取海藻酸钠1g，硫酸铵3g，氯化钠1g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.2g，碳酸钙0.2g，用氨水调节pH至7.5，最后加入3.6g琼脂粉，灭菌后倒平板备用；

(5)菌种复筛

取步骤(3)中所得发酵液，10倍梯度稀释法稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度，在步骤(4)中所得培养基平板上涂布，做3个重复，分别置于25℃、30℃及37℃恒温培养箱中培养。

(6)分离纯化

从步骤(5)中培养好的平板上挑选菌落周围透明圈大的菌株，进一步在复筛培养基上划线分离，得到1株水解圈直径远大于其它菌落的菌株，通过革兰氏染色镜检及菌落形态特征观察，初步判定为一株放线菌。

(7)菌种鉴定

对步骤(6)中所得菌株进行生理生化、16sRNA序列测定及分析，鉴定结果为一株淡紫灰链霉菌，并申请到保藏号为CGMCC No.7548。

(二)淡紫灰链霉菌(Streptomyces Lavendulae)CGMCC No.7548的培养方法：

(1)培养基

该菌株的活化及种子液培养均选用高氏1号培养基；

(2)培养条件

该菌株最适生长温度为28℃，最适pH为7.2，高氏1号平板培养48h可见明显菌落；摇瓶培养装液量为20％，摇床转速120-150rpm，一般60h左右可达到接种要求；

(三)淡紫灰链霉菌(Streptomyces Lavendulae)CGMCC No.7548的具体特征：

(1)菌落特征

该菌株在高氏合成1号琼脂中气生菌丝淡紫色，基内菌丝麦秆黄色；马铃薯浸汁琼脂中气生菌丝豆蔻紫色，基内菌丝褐色；淀粉琼脂中气生菌丝淡紫色，基内菌丝杏仁黄色；察氏琼脂中气生菌丝紫色，基内菌丝白色；葡萄糖天门冬素琼脂中气生菌丝灰白色，基内菌丝黄色。

该菌株气生菌丝和基内菌丝颜色变化均不明显，但在同种培养基上气生菌丝和基内菌丝之间颜色变化较大；仅在土豆培养基上产生褐色的可溶性色素，而在其他培养基上无色素产生。

(2)生理生化特性

该菌株能够使淀粉水解，能使明胶液化，不能分解纤维素，不产生硫化氢和黑色素，能够使硝酸盐还原，能够使牛奶凝固与冻化，能够利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、麦芽糖，不能利用阿拉伯糖和鼠李糖。

(四)利用淡紫灰链霉菌生产海藻微生物肥料的工艺过程：

(1)海藻渣预处理

取样检测并调节海藻加工后产生的海藻渣的含水量；

(2)发酵培养基配制及灭菌

取步骤(1)所得海藻渣750重量份，添加200-300重量份麸皮，50-100重量份稻壳，5-10重量份硝酸钾，15-20重量份可溶性淀粉，0.5-1重量份KH₂PO₄，0.05-0.1重量份MgSO₄，调节pH至7-8；分装至发酵专用浅盘中，表面用6层纱布覆盖，高压蒸汽灭菌；

(3)接种并发酵

将淡紫灰链霉菌(保藏号为CGMCC No.7548)接种到步骤(2)所得培养基中，恒温室中进行发酵；

(4)干燥粉碎及包装

将步骤(3)发酵结束所得产物热风烘干，粉碎后计量包装，即得海藻微生物菌剂。

实施例1

(1)海藻渣预处理

取海藻加工后产生的新鲜海藻渣，测定其含水量，采用补水或晾晒的方式调节其含水量在55％-60％左右。

(2)发酵培养基配制

取步骤(1)准备好的海藻渣500kg，添加150kg麸皮(30％，W/W)，50kg稻壳(10％，W/W)，5kg硝酸钾(1％，W/W)，10kg可溶性淀粉(2％，W/W)，KH₂PO₄(0.1％，W/W)0.5kg，MgSO₄(0.01％，W/W)0.05kg，pH用氨水调节，在混料设备中不停搅拌，要求物料湿润但不结块，直至呈均匀松散状，pH稳定在7.5。

(3)培养基分装及灭菌

将步骤(2)中所得培养基均匀分装至发酵专用浅盘中，装料厚度5cm，表面覆盖六层纱布，121℃高压蒸汽灭菌，保温30min，灭菌结束后及时将托盘取出摊开，降温走水。

(4)菌种活化及接种

将沙土管保存的菌种放置在4℃冰箱中解冻，然后采用平板划线的方式接到高氏一号培养基平板上，置于28℃恒温培养箱中培养48h，然后挑取平板上长势较好的单菌落接种在灭菌好的液体摇瓶培养基中，28℃、120rpm往复式摇床培养60h。种子液要求镜检菌丝生长旺盛，孢子刚刚开始脱落，发酵液内菌丝松散不成团，有效活菌数达到1.0×10⁸CFU/ml以上。接种量10％，接种后划盘翻动均匀，使物料疏松透气，菌种与物料充分接触。

(5)发酵工艺参数

将接种后的托盘置于30℃恒温发酵室中，通风培养，每隔4h划盘翻料，以保证整个发酵过程中的氧气供应。

分别在发酵36h、48h、60h、72h取样检测，镜检菌体形态及孢子形成情况，一般在72h左右发酵结束。

(6)干燥筛分

发酵结束后将物料摊薄，75℃热风干燥6h左右，至水分降至10％以下即可。

(7)检测及包装

随机抽取干燥后的产品，按照GB20287-2006的规定及相关企业标准提供的检测方法检测海藻渣发酵后部分营养物质含量的变化，结果见表1。

表1  海藻渣发酵后部分营养物质含量变化

从检测结果来看，其中可被植物利用的营养物质含量明显提高，部分有机质在菌株发酵过程中被分解利用，含量有所下降。

实施例2

取实施例1所得的海藻微生物肥料，测定其对几种常见植物病原真菌的抑菌活性。

(1)供试病原菌菌株

立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、串珠镰刀菌、苹果黑腐皮壳菌、小麦根腐病菌、玉米小斑病菌、禾生炭疽病菌；

(2)活体菌株对病原真菌的抑菌活性测定

取10g实施例1所得海藻微生物肥料，无菌操作条件下加入到100ml无菌水中摇匀，制成含淡紫灰链霉菌(CGMCC No.7548)的菌悬液。

在制备好的PDA平板上以原点为中心划垂直的十字，无菌操作条件下用接种环沿一条线接种菌悬液，另一条线两端与中心等距离处点接步骤(1)中所述供试病原菌菌株，25℃恒温培养5天后，测量病原菌菌饼边缘与接种菌悬液的直线的最近垂直距离作为抑菌带大小，记录结果见表2。

表2  菌株对病原菌抑菌活性

注：+表示抑菌带小于1cm，++表示抑菌带大于1cm，-表示无抑菌效果。

(3)发酵产物对病原真菌的抑菌活性测定

取10g实施例1所得海藻微生物肥料，无菌操作条件下加入到100ml无菌水中摇匀，制成含淡紫灰链霉菌(CGMCC No.7548)的菌悬液，然后用0.2微米的微孔滤膜过滤除菌，制备好20ml无菌上清液，加入到200ml的PDA培养基中，制成含淡紫灰链霉菌发酵海藻渣后的代谢产物的PDA平板，以加入等量无菌水的PDA培养基制备对照组平板。

将步骤(1)中所述供试病原菌菌株分别点接到倒好的2种PDA平板中央，用接种环在平板中心周围约2cm处点接4个菌悬液，25℃恒温培养5天后，测量并计算抑菌率，结果如下：

表3  发酵产物对病原菌抑菌活性

注：抑菌率＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100％

结合步骤(2)、(3)所述实验结果可以看出，实施例1所提供的海藻微生物肥料对实验室的9种供试病原菌均有一定的抑制效果，其中对苹果黑腐皮壳菌抑菌活性最高，对玉米小斑病菌的抑制效果不显著。

肥效试验1

取实施例1所得海藻微生物肥料，检验其在苹果树上的应用效果。

在山东烟台某苹果种植基地，挑选种植年岁较长、重茬病害较严重的果园进行肥效实验。

从同一果园划分4个间隔区域进行试验，每个试验区1亩，分为A、B、C、D四个试验区，试验方案如下：

A区不施用任何肥料；B区施用尿素；C区施用农户提供的市面上的普通海藻有机肥；D区施用海藻微生物肥料。

具体施肥方式如下：

表4  各试验区施肥方案

四个小区采用相同的灌溉和管理方式。记录从当年秋收施肥至次年苹果收获的发病及生长状况，结果如下：

A区的重茬病害较严重，6株果树枯死，果实色泽较暗，产量低；

B区白粉病及黑腐病较严重，烂果较多，产量高于A区需要配合喷施大量农药来保证产量；

C区也出现一些病虫害，产量高于A区、B区，但是烂果、落果也较严重；

D区发病情况最轻微，仅有个别植株发病较严重，果实有烂斑的较少，大部分果树产量及产品质量远高于其余试验区，果实着色较深，口感较好。可以看出施用该海藻微生物肥料后可有效减少农药使用量，增产、增收，提高农产品品质。

Claims (4)

1.一种淡紫灰链霉菌菌株，其特征在于，其分类命名为淡紫灰链霉菌(StreptomycesLavendulae)，已于2013年05月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.7548。

2.根据权利要求1所述的淡紫灰链霉菌在利用海藻渣制备海藻微生物肥料中的应用。

3.根据权利要求2所述的淡紫灰链霉菌在制备海藻微生物肥料的应用，其特征在于，所述海藻微生物肥料中淡紫灰链霉菌的有效活菌数≥1.0×10¹⁰CFU/g。

4.根据权利要求2所述的淡紫灰链霉菌在制备海藻微生物肥料的应用，其特征在于，所述海藻微生物肥料对立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、串珠镰刀菌、苹果黑腐皮壳菌、小麦根腐病菌、玉米小斑病菌、禾生炭疽病菌有抑菌活性。