CN108048331A - 海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺 - Google Patents

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CN108048331A CN201711344278.0A CN201711344278A CN108048331A CN 108048331 A CN108048331 A CN 108048331A CN 201711344278 A CN201711344278 A CN 201711344278A CN 108048331 A CN108048331 A CN 108048331A
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Abstract

本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺；本发明直接从海藻渣中筛选产纤维素酶菌株，且诱导纤维素酶产生的底物也采用海藻渣，可以防止其他来源的产纤维素酶的菌株产生的纤维素酶对海藻渣的降解专一性不强，影响酶的催化效率；传统的分离海藻渣中纤维素和珍珠岩的方法是离心和过滤，这两种方法对于海藻渣的利用率较低，且分离成本很高，微生物发酵法可以使分离出的珍珠岩作为助滤剂重复使用或作为保温材料，同时海藻渣粗纤维降解产生的糖液可直接作为含DHA微藻生长的营养液或其他藻类等微生物生长的碳源，工艺简单，在大规模生产中可以推广应用，具有循环经济价值。

Description

海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体涉及海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺。
背景技术
“海藻”是海带、紫菜、裙带菜、石花菜等海洋藻类的总称，是生长在海中的藻类，是植物界的隐花植物，藻类包括数种不同类以光合作用产生能量的生物。它们一般被认为是简单的植物，主要特征为：无维管束组织，没有真正根、茎、叶的分化现象；不开花，无果实和种子；生殖器官无特化的保护组织，常直接由单一细胞产生孢子或配子；以及无胚胎的形成。海产藻类（Algae）的统称，通常固著于海底或某种固体结构上，是基础细胞所构成的单株或一长串的简单植物。大量出现时分不出茎或叶的水生植物。以海藻为名的生物囊括了很多种，这些形体差异巨大、横跨了多种生命体，共同点主要是生活在海水中，可以通过自身体内的色素体以及光合作用来合成有机物。
在海藻的加工利用过程中，由于现有工艺条件的限制，海藻中养分不能被完全提取出来，剩余的部分残留在废弃的海藻渣中。因此，这些海藻渣复函丰富的营养，除含有部分水外，还有海藻酸、甘露醇、甜菜碱、壳聚糖等，另外还包括海藻纤维。果胶、蛋白质、木质素等物质。因此，如何将海藻渣进一步加工利用，最大程度地发挥其价值，成为人们日以关心的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，可以直接从海藻渣中筛选产纤维素酶菌株，同时海藻渣粗纤维降解产生的糖液可直接作为含DHA微藻生长的营养液或其他藻类等微生物生长的碳源。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，包括以下步骤：
a、产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
b、产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH5.0-8.0之间，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为25℃-40℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为0.5 g/L-3.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为12-120h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28-29℃、180-185rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
优选的，所述步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
优选的，所述步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
优选的，所述步骤c中培养基的配置比例为海藻渣35-65 g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4 g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
优选的，所述步骤d中恒温发酵的条件为装料量35-65 g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为25-35%，培养时间24-120h。
优选的，所述步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
有益效果：
本发明直接从海藻渣中筛选产纤维素酶菌株，且诱导纤维素酶产生的底物也采用海藻渣，可以防止其他来源的产纤维素酶的菌株产生的纤维素酶对海藻渣的降解专一性不强，影响酶的催化效率；传统的分离海藻渣中纤维素和珍珠岩的方法是离心和过滤，这两种方法对于海藻渣的利用率较低，且分离成本很高，微生物发酵法可以使分离出的珍珠岩作为助滤剂重复使用或作为保温材料，同时海藻渣粗纤维降解产生的糖液可直接作为含DHA微藻生长的营养液或其他藻类等微生物生长的碳源，工艺简单，在大规模生产中可以推广应用，具有循环经济价值。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，包括以下步骤：
a、产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
b、产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH=5，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为25℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为2.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为12h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28℃、180rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
步骤c中培养基的配置比例为海藻渣65g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
步骤d中恒温发酵的条件为装料量58g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为25%，培养时间24h。
步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
实施例2：
海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，包括以下步骤：
a、产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
b、产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH=6，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为30℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为1.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为48h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28.3℃、182rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
步骤c中培养基的配置比例为海藻渣57g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
步骤d中恒温发酵的条件为装料量47g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为30%，培养时间48h。
步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
实施例3：
海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，包括以下步骤：
a、产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
b、产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH=7，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为35℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为0.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为72h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28.6℃、184rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
步骤c中培养基的配置比例为海藻渣35g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
步骤d中恒温发酵的条件为装料量65g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为32%，培养时间72h。
步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
实施例4：
海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，包括以下步骤：
a、产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
b、产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH=8，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为40℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为3.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为120h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，29℃、185rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
步骤c中培养基的配置比例为海藻渣47g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
步骤d中恒温发酵的条件为装料量35g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为35%，培养时间120h。
步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：
产纤维素酶的菌株的筛选：
选取海藻渣腐烂部位，接种于海藻渣和蒸馏水配制成的匀浆培养液中，将富集后的发酵液采用10倍梯度法稀释后，再涂布在初筛培养基平板上，待长出菌落后，用接种针挑出同一平板上不同形态的菌落，将菌落转接到复筛培养基上进行单菌落分离，最终得到多株纯的单一菌落；将得到的单一菌落用刚果红染液染色30min，再用1mol/L的NaCl溶液脱色15min，测量透明圈和菌株直径的大小，计算透明圈和菌株直径的比值，筛选出比值大于5的菌株；将种子液按5%的量接种于产酶培养基上，收集上清液测定滤纸酶(FPA)、内切葡聚糖酶(CMC)、外切葡聚糖酶(CBH)、β-葡聚糖苷酶的酶活力，将酶活力高的菌株在斜面上连续传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况，保存遗传稳定性较强的菌株；
产酶条件的优化：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养基中培养至对数期进行产酶条件的优化，探讨不同的pH、温度、氮源、底物浓度、摇床速度、培养时间对藻渣纤维素的分解及寡糖积累的影响，选择以下的条件培养：
①培养基中初始pH值分别用1N H2SO4或1N NaOH调整为pH5.0-8.0之间，每隔1个pH值设置为一个测试点；
②测试温度调节为25℃-40℃，每隔5℃为一设置温度；
③酵母粉的浓度设置为0.5 g/L-3.5 g/L；
④海藻渣的浓度均分为8个梯度：依次为5.0 g/L、6.0 g/L、7.0 g/L、8.0 g/L、9.0 g/L、10.0 g/L、11 g/L和12.0 g/L来确定最佳底物浓度，能够使海藻渣纤维素最大程度的降解；
⑤摇床速度（溶解氧含量）：100rpm，130rpm，150rpm，180rpm；
⑥培养时间为12-120h，在本发明的寡糖产量达到最高时结束发酵；
每6h取样，分别测定发酵液上清的酶活性及糖产量，经如上述的发酵培养方法，确定产生寡糖的最优发酵条件；
c、利用产纤维素酶的菌株处理海藻渣制备含DHA微藻的培养基：
将纤维素酶活力最高的菌株接入种子培养液中，28-29℃、180-185rpm摇床培养至对数期，取海藻加工后产生的海藻渣，按比例配置发酵培养基；
d、纤维素降解率的测定：
将上述培养基恒温发酵，每发酵12h取样一次，配置葡萄糖标准溶液及DNS试剂，在550nm处用分光光度计测定反应溶液的OD值，以葡萄糖浓度作为纵坐标，A550值为横坐标，作出标准曲线并回归出标准方程，计算寡糖含量，发酵结束后，过滤剩余藻渣纤维素及珍珠岩，检测纤维素降解率，糖化液可直接作为含DHA微藻的培养基的碳源添加使用。
2.根据权利要求1所述的海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于：所述步骤a中海藻渣和蒸馏水的质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于：所述步骤a中刚果红染液的质量浓度为0.1%。
4.根据权利要求1所述的海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于：所述步骤c中培养基的配置比例为海藻渣35-65 g/L，蛋白胨2 g/L，MnSO4 0.5 g/L，酵母粉4 g/L，K2HPO4 0.5 g/L。
5.根据权利要求1所述的海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于：所述步骤d中恒温发酵的条件为装料量35-65 g/L，控制pH值恒定为7.0±0.5，搅拌速度150rpm，菌株接种量5%，通气量（V空气/V氧气）1:0.5-1.0，发酵温度恒定为30±0.1℃，溶解氧含量为25-35%，培养时间24-120h。
6.根据权利要求1所述的海藻渣发酵法制备生产微藻用培养基的生产工艺，其特征在于：所述步骤d中的分光光度计为紫外可见分光光度计。
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