CN109536558B - 制备β-胡萝卜素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备β‑胡萝卜素的方法。制备β‑胡萝卜素的方法，其特征在于：对种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分别进行酶解处理后，再以一定比例混合进行发酵培养；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取β‑胡萝卜素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的复合酶。通过将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液酶处理，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌丝分布更加分散，由此达到当菌体混合后，增加正负菌体间的接合效率，增加接合孢子的生产，从而提高β‑胡萝卜素产量的目的。

Description

制备β-胡萝卜素的方法
技术领域
本发明涉及制备β-胡萝卜素的方法，尤其是一种使用三孢布拉氏霉菌制备β-胡萝卜素的方法。
背景技术
β-胡萝卜素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有良好的抗氧化、抗癌防癌功效，且对预防心血管疾病、增强机体免疫力以及延缓衰老等都具有一定的作用，是一种很有开发价值的功能性天然色素。
β-胡萝卜素原料的生产，主要有天然提取法、化学合成法和微生物发酵法。天然提取法所需要的原料主要是胡萝卜，番茄等植物，这些植物受气候、产地、运输等条件限制，且植物提取工艺繁琐冗长，成本昂贵，不能满足工业化生产的需求。化学合成法尽管成本较低，但其对环境影响比较大，且产品活性较低，因此应用范围受到极大限制。采用微生物发酵法生产β-胡萝卜素，其产品质量和生理活性和天然提取产品完全相同，且不受环境条件限制，具有产量高、成本低、安全性高、易于被人体吸收等优点。
目前，工业上利用三孢布拉氏霉菌发酵生产β-胡萝卜素，主要是将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌在种子培养阶段分开培养，之后将正菌和负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养。如中国专利申请第CN10275795A和CN104561211A，均是在发酵培养时，将三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌的种子液以一定的比例混合后再接入发酵培养基中培养，但其发酵产量较低。现有提高三孢布拉氏霉菌产β-胡萝卜素产量的方法主要是增加溶氧和添加前体物质。增加溶氧通常采取的措施是通过增加鼓风或强制通氧，但是这种方法需要耗费大量的能源，增加成本，对工业化生产造成困难。也有在发酵液中添加氧载体正十二烷等，但会对菌体造成伤害。添加前体物质的报道也有很多，但是效果不是很理想，而且还会增加成本。本发明旨在提供一种简便易行，更有效的提高β-胡萝卜素的产量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供制备β-胡萝卜素的方法。该方法简便易行，可有效提高β-胡萝卜素的产量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
提供制备β-胡萝卜素的方法，对种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分别进行酶解处理后，再以一定比例混合进行发酵培养；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取β-胡萝卜素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的复合酶。使用酶处理可酶解菌丝体之间粘连的胶质、蛋白、油脂等，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌体的菌丝分布更加分散。
按上述方案，种子阶段的三孢布拉氏霉菌是在均匀的液体培养基中使用摇瓶或发酵罐培养的。
按上述方案，所述酶处理为将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别在适宜三孢布拉氏霉菌生存的温度和pH范围内加入上述酶进行酶解处理。
按上述方案，所述酶活性为果胶酶10000-1000000U/g；纤维素酶10000-800000U/g；中性蛋白酶100000-1500000U/g；脂肪酶10000-200000U/g。
按上述方案，酶处理时酶的用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.1％-1％，酶解体系pH为5.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解处理时间为1-4小时。
按上述方案，所述的酶优选为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2的组合，酶用量0.05％-0.5％，酶解体系pH6.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解时间0.5-2h。本发明优选将果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2组成的组合酶对三孢布拉氏霉菌种子液进行组合酶解处理，可更有利于酶解菌丝体之间粘连的胶质、蛋白、油脂等，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌体的菌丝分布更加分散，由此可达到更佳的效果，且快速高效。
按上述方案，所述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液以三孢布拉氏霉菌正、负菌干菌体质量计，按质量比为1:1-1:50优选为1:5-1:10混合后进行发酵培养(干菌体质量：分别取一定体积的正、负菌种子液，干燥处理后测得)。
按上述方案，上述制备β-胡萝卜素的方法，包括以下具体步骤：
(1)取三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行斜面培养；
(2)将步骤(1)斜面培养的三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行种子培养，和根据需要进行种子放大培养；
(3)将步骤(2)得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用酶处理，然后按照一定的比例混合，最后进行发酵培养；
(4)收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取β-胡萝卜素。
本发明具有如下有益效果：
三孢布拉氏霉菌正、负菌混合培养生产β-胡萝卜素中，正、负菌的菌丝体相互接触、融合，不断生成接合孢子，进而合成β-胡萝卜素。正、负菌的接合程度对β-胡萝卜素的产量有直接影响，目前的工艺技术均是分别培养正负菌后直接进行混合发酵生产β-胡萝卜素，然而，三孢布拉氏霉菌正负菌为丝状真菌，浓度达到一定程度之后菌丝相互缠绕，正负菌混合后接触的概率显著降低，从而导致接合孢子的量减少，进而影响了β-胡萝卜素产量，目前行业内没有任何相关技术解决该问题。本发明在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过将三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液酶处理，减少菌体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌丝分布更加分散，由此达到当菌体混合后，增加正负菌体间的接合效率，增加接合孢子的生产，从而提高菌体中β-胡萝卜素的产量的目的。
附图说明
图1为显微镜放大40倍，酶处理前后的菌丝形态图。酶处理前菌丝缠绕聚集在一起，使用0.1％果胶酶在pH5.0，30℃的条件下处理1小时后，菌丝分散均一。
图2为将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别酶解处理后混合进行发酵，发酵结束时的生物量示意图；
D1使用0.1％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理1h；
D2使用0.1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理1h；
D3使用0.1％中性蛋白酶，在pH7.5,30℃条件下处理1h；
D4使用0.1％脂肪酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D5使用0.1％的果胶酶和纤维素酶按质量比为1:1组成的复合酶，在pH6.0,30℃条件下处理1h；
D6使用0.1％的果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D7使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为2:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D8使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:2:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D9使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为4:3:2:2组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理2h；
D10使用0.1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
D11使用0.3％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
D12使用0.8％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
D13使用1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h；
D14使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D15使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理1h；
D16使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理2h；
D17使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理3h；
D18使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理4h；
D19使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:3:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h；
D20使用0.3％的纤维素酶和中性蛋白酶按质量比为2:1组成的复合酶，在pH6.0,25℃条件下处理2h；
D21使用0.05％的果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.0,28℃条件下处理2h；
D22使用0.1％的果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.5,25℃条件下处理1h；
D23使用0.5％的果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH7.0,30℃条件下处理0.5h。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作详细说明。应理解，这些实施例只是为了具体说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中使用的所述三孢布拉氏霉菌正菌菌株：三孢布拉氏霉菌BT7251(+)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2014378；三孢布拉氏霉菌负菌菌株：三孢布拉氏霉菌BT7603(-)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，保藏编号为：CCTCC M2014379。
但本方法并不限于上述三孢布拉氏霉菌正菌菌株和三孢布拉氏霉菌负菌菌株，市售三孢布拉氏霉菌正菌菌株和三孢布拉氏霉菌负菌菌株均可。
实施例1
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)发酵瓶培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液使用酶处理后，按照正、负菌菌体质量比为1:1混合均匀，以20％接种量接入装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养120小时。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。
5)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量。
上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：
现有技术(不使用酶处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为5.09g/L。
本实施例方案一(D1)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％纤维素酶(20000U/g)，在pH5.0,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为7.25g/L，比现有技术提高了42.44％。
本实施例方案二(D2)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％果胶酶(50000U/g)，在pH6.0,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为7.62g/L，比现有技术提高了49.71％。
本实施例方案三(D3)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％中性蛋白酶(100000U/g)，在pH7.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为6.93g/L，比现有技术提高了36.15％。
本实施例方案四(D4)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％脂肪酶(10000U/g)，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为6.77g/L，比现有技术提高了33.01％。
本实施例方案五(D5)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶(50000U/g)和纤维素酶(20000U/g)按质量比为1:1组成的复合酶，在pH6.0,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.73g/L，比现有技术提高了71.51％。
本实施例方案六(D6)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶(50000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)按质量比为2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为9.73g/L，比现有技术提高了91.16％。
本实施例方案七(D7)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)按质量比为2:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为9.97g/L，比现有技术提高了95.87％。
本实施例方案八(D8)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)按质量比为3:2:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.12g/L，比现有技术提高了98.82％。
本实施例方案九(D9)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶(50000U/g)、纤维素酶(20000U/g)、中性蛋白酶(100000U/g)和脂肪酶(10000U/g)按质量比为4:3:2:2组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.33g/L，比现有技术提高了102.95％。
实施例2
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)发酵瓶培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液使用酶处理后，按照正、负菌菌体质量为1:5混合均匀，以20％接种量接入装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养120小时。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。
5)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量。
上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
上述所用酶的酶活性为：果胶酶10000U/g、纤维素酶50000U/g、中性蛋白酶200000U/g、脂肪酶20000U/g。
将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：
现有技术(不使用酶处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为5.13g/L。
本实施例方案一(D10)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为7.61g/L，比现有技术提高了48.34％。
本实施例方案二(D11)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.3％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为7.94g/L，比现有技术提高了54.78％。
本实施例方案三(D12)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.8％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.19g/L，比现有技术提高了59.65％。
本实施例方案四(D13)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用1％果胶酶，在pH6.0,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.41g/L，比现有技术提高了63.94％。
本实施例方案五(D14)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:2:1:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为9.84g/L，比现有技术提高了91.81％。
实施例3
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)发酵瓶培养：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液使用酶处理后，按照正、负菌菌体质量为1:10混合均匀，以20％接种量接入装有40ml发酵培养基的250ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养120小时。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。
5)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量。
上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
上述所用酶的酶活性为：果胶酶100000U/g、纤维素酶10000U/g、中性蛋白酶200000U/g、脂肪酶20000U/g。
将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：
现有技术(不使用酶处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为5.27g/L。
本实施例方案一(D15)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为7.83g/L，比现有技术提高了44.58％。
本实施例方案二(D16)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.26g/L，比现有技术提高了56.74％。
本实施例方案三(D17)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理3h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.47g/L，比现有技术提高了60.72％。
本实施例方案四(D18)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.4％纤维素酶，在pH5.0,30℃条件下处理4h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为8.69g/L，比现有技术提高了64.90％。
本实施例方案五(D19)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.1％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:3:2:1组成的复合酶，在pH6.5,30℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.13g/L，比现有技术提高了92.22％。
实施例4
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30min，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)发酵罐培养(D20)：将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液使用0.3％的纤维素酶(100000U/g)和中性蛋白酶(200000U/g)按质量比为2:1组成的复合酶，在pH6.0,25℃条件下处理2h，按照正、负菌菌体质量为1:5混合均匀后，以20％接种量接入50L发酵罐中，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度300转/分钟，通气量3vvm(L/L.min)，罐压0.1MPa培养时间120h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。所述发酵培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉20g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
5)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。
6)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量。
上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：
现有技术(不使用酶处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为5.32g/L。
本实施例：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为10.29g/L，比现有技术提高了93.42％。
实施例5
1)斜面培养：配制PDA斜面培养基(葡萄糖20g/L，琼脂粉25g/L，去皮土豆200g/L；将土豆切成1cm方块加入去离子水煮沸30分钟，冷却后用四层纱布过滤，取过滤后的清液加入葡萄糖和琼脂粉)。取三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌孢子悬液，分别涂布于PDA斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养5-7天；
2)种子培养：分别从三孢布拉氏霉菌正菌、负菌菌株斜面上用接种铲铲取一铲的正菌、负菌，分别接种到含有150ml种子培养基的1000ml三角瓶中，于25℃，180转/分钟条件下培养48小时，得到三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液。所述种子培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
3)种子扩大培养：最终发酵罐的体积为10m3，依次选用容积为10L，100L，1m3的种子罐扩大培养种子液，种子罐中培养基装量为60％(体积比)，将步骤2)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液按照10％(体积比)接种量分别接种到种子罐中进行培养，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1vvm(L/L.分钟)，培养时间48h，所述扩大培养基为：葡萄糖10g/L，玉米淀粉30g/L，玉米浆干粉50g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
4)发酵罐培养：将步骤3)中得到的三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液使用酶处理后，按照正、负菌菌体质量为1:50混合均匀后，以10％(体积比)接种量接入10m3发酵罐中，培养过程工艺控制为：培养温度25℃，搅拌速度150-200转/分钟，通气量1-3vvm(L/L.分钟)，罐压0.05-0.1MPa，培养时间120-144h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20g/L。所述发酵培养基为：葡萄糖20g/L，玉米淀粉40g/L，酵母浸膏25g/L，黄豆饼粉40g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.1g/L，pH7.0。
5)收集发酵后得到的菌体，将菌体过滤清洗后烘干，得到干重。
6)准确称量0.02g干菌体，用乙酸乙酯萃取，用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素含量。
上述步骤完成后，使用现有的常规工艺，例如使用溶剂提取菌体中的β-胡萝卜素，进一步脱溶、纯化、结晶后，即可制得β-胡萝卜素。
上述所用酶的酶活性为：果胶酶200000U/g、纤维素酶50000U/g、中性蛋白酶200000U/g、脂肪酶10000U/g。
将本发明的制备方法与现有技术对比，结果如下：
现有技术(不使用酶处理种子液，直接将正、负菌混合后，进行发酵)：测得发酵液中β-胡萝卜素产量为5.53g/L。
本实施例方案一(D21)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.05％的果胶酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.0,28℃条件下处理2h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.51g/L，比现有技术提高了90.05％。
本实施例方案二(D22)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.2％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH6.5,25℃条件下处理1h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.78g/L，比现有技术提高了94.94％。
本实施例方案三(D23)：将三孢布拉氏霉菌正、负种子液分别使用0.5％的果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶和脂肪酶按质量比为3:4:2:1组成的复合酶，在pH7.0,30℃条件下处理0.5h，再混合进行发酵，测得发酵液中β-胡萝卜素的产量为10.95g/L，比现有技术提高了98.01％。
上述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用物理手段进行处理后混合进行发酵培养制备β-胡萝卜素，发酵结束后生物量如图2所示。由图2可看出：三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液酶处理后再混合进行发酵培养，发酵结束后生物量与对照(三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液不进行酶处理)无明显差异，说明本发明的酶处理没有破坏菌体的活性。
通过以上实例及对比可以看出，本发明在将三孢布拉氏霉菌正负菌混合发酵前，通过酶处理的方式，可减少菌丝体中菌丝之间的粘连和缠绕，使菌体的菌丝分布更加均匀，如图1所示，由此，当菌体混合后，加了正负菌体间的接合效率，从而提高了β-胡萝卜素的产量。酶处理前显微镜目测三孢布拉氏霉菌的菌丝体互相缠绕，由此直接将种子液混合发酵，会影响正、负菌的接合效率及接合程度，进而影响β-胡萝卜素的产量。

Claims (7)

1.制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：对种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌分别进行酶解处理后，再以一定比例混合进行发酵培养；收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取β-胡萝卜素；所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶或脂肪酶其中的一种或二至四种任意混合形成的复合酶；所述酶活性为果胶酶10000-1000000U/g；纤维素酶10000-800000U/g；中性蛋白酶100000-1500000U/g；脂肪酶10000-200000 U/g。
2.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：种子阶段的三孢布拉氏霉菌正菌和三孢布拉氏霉菌负菌是在均匀的液体培养基中于摇瓶或发酵罐中培养的。
3.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：所述酶处理为将三孢布拉氏霉菌正菌种子液和三孢布拉氏霉菌负菌种子液分别在适宜三孢布拉氏霉菌生存的温度和pH范围内加入酶进行酶解处理。
4.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：酶处理时酶的用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.1%-1%，酶解体系pH为5.0-7.5，酶解温度25-30℃，酶解处理时间为1-4小时。
5.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：所述的酶为果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶、脂肪酶按质量比为2-4：0-4：1-2：1-2的组合，酶用量为三孢布拉氏霉菌正菌种子液或三孢布拉氏霉菌负菌种子液菌体干重的0.05%-0.5%，酶解体系pH为5.0-7.5，25-30℃，酶解时间0.5-2h。
6.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：所述三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液以三孢布拉氏霉菌正、负菌干菌体质量计，按质量比1:1-1:50混合后进行发酵培养。
7.根据权利要求1所述的制备β-胡萝卜素的方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
（1）取三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行斜面培养；
（2）将步骤（1）斜面培养的三孢布拉氏霉菌正、负菌分开进行种子培养，和根据需要进行种子放大培养；
（3）将步骤（2）得到的三孢布拉氏霉菌正、负菌种子液采用酶处理，然后按照一定的比例混合，最后进行发酵培养；
（4）收集发酵后得到的菌体，从菌体中提取β-胡萝卜素。
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