CN102071179A - 利用黑曲霉液体深层发酵产纤维素酶 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的纤维素酶生产方法，其步骤包括：将黑曲霉接种到产孢子培养基中培养4d，培养完成后制成菌悬液，取15ml接种到配有200ml液体发酵培养基的1L三角瓶中，于32℃、150r/min转速下放于恒温震荡培养箱中培养24h，然后降低温度到28℃继续培养36h。发酵液经板框过滤，超滤浓缩和喷雾干燥制得纤维素酶干粉。本发明操作工艺简单，原料易得，生产成本低，无污染，为一种理想的纤维素酶制取方法。

Description

利用黑曲霉液体深层发酵产纤维素酶

技术领域

本发明提供了一种新的纤维素酶制备方法，涉及微生物发酵法生产纤维素酶。

技术背景

纤维素酶指的是降解纤维素生成葡萄糖的一类酶的总称，它不是单种酶，而是起协同作用的多组分酶系，主要来自于真菌和细菌。其中3种主要酶组分是内切β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)(Cx酶，CMC酶)；外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)(也称C₁酶，微晶纤维素酶)；β-葡萄糖甘酶(EC3.2.1.21)。

纤维素酶是植物细胞壁的主要成分。纤维素酶一方面将纤维素水解成葡萄糖等有效成分，另一方面它通过提高植物细胞壁的同透性而提高细胞内含物(蛋白质、脂肪、淀粉)的提取率。要使纤维素充分将解和利用，就酶本身而言，主要考虑2个方面：提高酶的活力和改善纤维素酶系各组分的相对含量，以充分发挥它们之间的协同作用。纤维素酶具有补充动物内源酶；促进养分的消化吸收；消除抗营养因子的效果。它是一种高活性生物催化剂，应用极其广泛，如酿造果汁与蔬菜加工，粮食加工、食品、饲料、造纸、中草药有效成分的提取，以及纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等各个方面。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、动物体内等，但研究和生产中所用的纤维素酶都是用真菌发酵得到的，菌中大多是木霉、曲霉和青霉、根霉属和漆斑霉属等。而黑曲霉是公认安全的微生物，用其生产酶制剂安全、可靠，不产生毒素，而且生产快、发酵周期短、具有明显的优越性，可望用于食品和医药领域。本发明用黑曲霉作为发酵菌株采用液体深层发酵及变温控制法生产纤维素酶。生产工艺比较简单，设备要求低，产量高，可用于工业化大规模生产。

发明内容

本发明提供了一种新的纤维素酶生产方法，其步骤包括：

(1)配置营养盐液

准确称取2.0KH₂PO₄，1.4g(NH₄)₂SO₄，0.3gMgSO₄·7H₂，0.3gCaCl₂，加600ml水使之溶解。再称取5.0mgFeSO₄·7H₂O，1.6mgMnSO₄·H₂O，1.4mgZnSO₄·7H₂O，2.0CoCl₂，加200ml蒸馏水使之溶解，将2种混合液混合再用HCl调节PH至5.5，于容量瓶中定容至1000ml.此溶液即为mandels营养盐溶液，在此溶液中再加4gNaNO₃改进mandels营养盐溶液，将配置好的营养盐溶液放于冰箱中备用.

(2)配置PDA斜面培养基

准确称取6g马铃薯粉，2g葡萄糖，2g琼脂再加100ml蒸馏水使之溶解，分别倒入5个试管中，于121℃高温灭菌锅中灭菌20min，冷却，制成斜面培养基备用。

(3)黑曲霉的选育及培养

将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌在无菌操作台中接种到PDA斜面培养基上，于28℃下放入恒温培养箱中培养4-5d。

(4)配置液体发酵培养基

用改良的Mandels氏营养盐为底物配置液体发酵培养基，加入玉米芯80g/L，蛋白胨6g/L，麦芽糖10g/L，再加入一定量的KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲溶液调节PH于5.8左右，配200ml装入1L的三角摇瓶。

(5)接种发酵培养

将培养好的新鲜PDA斜面培养基上的菌体制成菌悬液，接种15ml到液体发酵培养基中，于32℃、150r/min转速下放入恒温震荡培养箱中培养24h，然后下调温度至28℃，继续培养36h。

(6)纤维素酶提取

将搅拌发酵后的发酵液通过板框压滤，滤布目数为768，压滤速率为5吨/小时。压滤后的发酵液再经超滤浓缩，使滤液浓度浓缩为原来的15-20倍。浓缩后的滤液经喷雾干燥后制得纤维素酶干粉。

本发明生产操作工艺简单，原料来源广泛，生产成本低且无污染，适于工业化生产，为一种理想的生产纤维素酶的方法。

为研究实验中各种最优化条件设计了几个比较实验：

1.产纤维素酶发酵特性研究

实验设计按25g/L的浓度加入麦秸粉、甘蔗渣和玉米芯等不同碳源，用营养液配置，250ml三角瓶装液量30ml，在28℃、200r/min震荡培养，每隔24h取样测定纤维素酶活力，测得实验数据如下：

可知发酵72h为黑曲霉产纤维素酶高峰期，玉米芯为最佳碳源。

2.不同氮源对纤维素酶的影响

确定了玉米芯为最佳碳源后，以玉米芯为碳源，在去除(NH₄)₂SO₄的Mandels盐液中分别加入酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸铵、硝酸钠以及它们的复合物，浓度为6g/l，来研究氮源对他们的影响，在溶液PH一定的条件下分别测产物酶活，结果显示蛋白胨效果最佳。

3.调控发酵PH对产酶的影响

研究发现，黑曲霉产纤维素酶发酵始末PH值的变化很大，可见黑曲霉发酵产纤维素酶的同时产酸，使得发酵液PH下降，而抑制了酶的产生。这时可以通过加入KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液来调节PH发现在PH＝5.78时产酶活力达到最大。

Claims (5)

1.利用黑曲霉液体深层发酵产纤维素酶，其特征包括以下几个步骤：

(1)配置营养盐液

以Mandels氏营养盐为基础再加入NaNO₃ 4.0g/l，配置成一种新的营养盐备用。

(2)黑曲霉的选育及培养

将菌种保藏培养基上的黑曲霉菌接种到产孢子培养基上，于28℃下放入恒温培养箱中培养4-5d。

(3)配置液体发酵培养基

用改良的Mandels氏营养盐为底物配置液体发酵培养基，加入玉米芯80g/L，蛋白胨6g/L，麦芽糖10g/L，再加入一定量的KH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲溶液调节PH于5.8左右，配200ml装入1L的三角摇瓶。

(4)接种发酵培养

将培养好的新鲜产孢子斜面上的孢子制成菌悬液，接种15ml到发酵培养基中，于32℃、150r/min转速下放入恒温震荡培养箱中培养24h，下调温度至28℃，继续培养36h。

(5)纤维素酶提取

将搅拌发酵后的发酵液通过板框压滤，滤布目数为768，压滤速率为5吨/小时。压滤后的发酵液再经超滤浓缩，使滤液浓度浓缩为原来的15-20倍。浓缩后的滤液经喷雾干燥后制得纤维素酶干粉。

2.如权利要求(2)所诉，其特征在于所用的产孢子培养基为PDA斜面培养基。

3.如权利要求(3)所诉，其特征在于以玉米芯为碳源，麦芽糖为辅助碳源，蛋白胨为氮源时产酶效率最高。

4.如权利要求(4)所诉，其特征在于利用变温调控培养(前24h控制温度32℃，后36h控制温度28℃)能使发酵产率和速度达到最大化。

5.如权利要求(5)所诉，其特征在于用喷雾干燥温度为175℃，时间为3-8秒。