CN110093281B - 桑黄液体深层发酵培养工艺 - Google Patents

桑黄液体深层发酵培养工艺 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：(1)桑黄菌种活化；(2)制备桑黄种子悬液；(3)一级发酵培养：利用发酵培养基对桑黄种子悬液进行扩大培养，得一级液体菌种；(4)二级发酵培养：利用发酵培养基对一级液体菌种进行再次扩大培养，得二级液体菌种；(5)发酵罐培养：利用发酵培养基以及桦褐孔菌发酵液对二级液体菌种进行发酵培养；所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10‑15:1混合后，所得的混合液；所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经处理后所得的溶液；所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，所得的发酵液；本发明有效提高了桑黄液体发酵产物中一些活性物质的含量。

Description

桑黄液体深层发酵培养工艺
技术领域
本发明涉及一种桑黄液体深层发酵培养工艺。
背景技术
桑黄(Phellinus igniarius)属担子菌亚门，层孔菌纲，锈革孔菌科，针层孔菌属。桑黄菌提取物在抑制癌细胞转移和防止癌症手术后复发等的临床应用中具有显著效果，是目前国际公认的生物治癌药剂中有效率最高的一种药用真菌。由于受生理状态的特殊性和复杂性以及外部环境的制约，造成桑黄在自然界中形成子实体稀少，特别是形成可用子实体需要多年。而且人工栽培极其困难，培养条件苛刻，且生长周期长达3-4年，难以满足日益膨胀的市场需要。液体发酵法生产桑黄有效成分由于生产周期短、劳动力省以及受外部环境影响小等优点被认为是一种有效的方法。在液体深层培养过程中，菌丝细胞能在反应器中(发酵罐或大三角瓶)处于最适温度、最适酸碱度，最适碳、氮比等条件下生长，呼吸作用所产生的代谢废气又能及时排放，因此新陈代谢旺盛，菌丝生长迅速，在短时问内就可以获得大量菌丝体，具有生产时间短，效率高，成本低等优点。同时，还会在发酵液中产生多糖、生物碱、萜类化合物、甾醇、甙类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素、植物激素及具有抗生素作用的各种化合物等多种生理活性物质。然而，传统液体发酵生产桑黄的方法，桑黄发酵菌丝体的得率不高，桑黄菌丝体易老化，另外，发酵液中甾醇、多糖以及酶类的含量还有待于提高。
双孢蘑菇学名为Agaricus bisporus(Lange)Sing,中文别名为蘑菇、洋菇，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，约占世界食用菌总产量的25％左右。由于新鲜的双孢蘑菇储藏期较短，故其国际贸易形式主要以罐藏加工产品为主，而罐藏加工生产时必须及时对鲜菇进行预煮杀青，防止蘑菇开伞，而预煮后的熟菇重量比鲜菇下降35％～40％，损失的重量变成工业废水。在中国，每年用于罐藏加工的双孢蘑菇原料约占双孢蘑菇总产量的80％，也就是说每年约有30％的双孢蘑菇产量变成工业废水而流失，而它是高BOD和COD含量的生产废水，其中COD的含量为540.29g/L，比国家三级排放标准高出13.07倍，直接排放会造成环境污染，而废水处理会增加企业的生产成本。这些废水中含有大量的营养成分，充分利用好蘑菇产业废水，将其被废为宝，具有极其深远的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高桑黄发酵菌丝体得率、提高发酵液中甾醇、多糖以及酶含量并能够充分利用双孢蘑菇加工废水的桑黄液体深层发酵培养工艺。
本发明的目的通过如下技术方案实现：一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化；
(2)制备桑黄种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；
所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；
所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.本发明利用双孢蘑菇罐藏加工废水作为桑黄液体深层发酵培养的培养基来源，将双孢蘑菇罐藏加工废水变废为宝，减轻环境污染、避免水体富营养化。
2.发酵培养基中榆树皮提取液的加入能够延迟桑黄发酵菌丝体老化，大大提高桑黄发酵菌丝体的得率。
3.本发明将双孢蘑菇罐藏加工废水进行处理后，作为桑黄液体深层发酵培养的培养基来源，能够为桑黄发酵培养提供碳源与氮源。另外，双孢蘑菇罐藏加工废水以及桦褐孔菌发酵液中富含一些多糖、氨基酸、蛋白质、甘露醇等，它们的加入，可以为桑黄发酵培养提供一些外源刺激物，有效提高了桑黄液体发酵产物中一些活性物质的含量，如多糖、漆酶、甾醇等。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：
一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-30℃活化6-8d。
(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-30℃的条件下振荡培养5-7d，得所述桑黄种子悬液。
(3)一级发酵培养：将85-95ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200-250mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L(优选为2.5L)的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％(优选为4％)的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃(优选为28℃)，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在5.8-6.0(优选为5.8)。
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0(优选为5.8)，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；
所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩后，所得的溶液；
所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液。
所述桑黄(ACCC 51638)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，所述桦褐孔菌(ATCC 42011)购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。
其中，所述溶液A的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为20-25℃，离心时间为15-20min；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到15％-20％，得溶液A；
所述榆树皮提取液的制备方法为：
1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-7min，其中，榆树皮与水的料液比为1:2-1:3g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为10:1-12:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.1％-0.3％的果胶酶、占榆树皮重量的0.3％-0.5％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.2％-0.4％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在45-55℃，搅拌反应2-3h，之后将温度升至90-100℃，加热20-30min，再降温至室温，过滤，收集滤液B；
2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为20-30min；
3)将步骤2)所得上清液浓缩至溶液中可溶性固形物浓度达20％-30％，得所述榆树皮提取液。
所述桦褐孔菌发酵液的制备方法为：
1)制备桦褐孔菌种子悬液：先将保存的桦褐孔菌菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在27-30℃活化5-7d；之后，用接种针勾取4块0.5cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为180-200rpm，在27-30℃的条件下振荡培养10-12d，得所述桦褐孔菌种子悬液。
2)发酵培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的桦褐孔菌培养基，之后将桦褐孔菌种子悬液接种于发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为27-30℃，罐压为0.01-0.03MPa下发酵培养8-10天，过滤，收集发酵液，发酵液经高压灭菌后浓缩至溶液折光率达35％-40％，即为所述桦褐孔菌发酵液；其中，桦褐孔菌培养基为榆树木屑与溶液A按料液比为10:1-15:1g/L混合后所得培养基。
所述的桦褐孔菌培养基需灭菌后使用，灭菌的条件采用本领域的常规条件，例如可在120℃-125℃下灭菌20min-30min。
以上所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
本发明所述的接种量指接入的菌种体积或接入的培养好的种子液体积与培养基体积之比的百分数。
下面结合具体实施例对本发明作更细致的阐述：
实施例一：溶液A的制备：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500rpm之间，离心温度为25℃，离心时间为15min；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到15％，得溶液A。
实施例二：溶液A的制备：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在12000rpm之间，离心温度为23℃，离心时间为18min；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到16％，得溶液A。
实施例三：溶液A的制备：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液，离心时，离心机的转速控制在12500rpm之间，离心温度为20℃，离心时间为20min；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到20％，得溶液A；
实施例四：榆树皮提取液的制备：
1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌5min，其中，榆树皮与水的料液比为1:3g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为10:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.3％的果胶酶、占榆树皮重量的0.3％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.4％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在45℃，搅拌反应3h，之后将温度升至90℃，加热30min，再降温至室温，过滤，收集滤液B；
2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在11500rpm之间，离心温度为25℃，离心时间为20min；
3)将步骤2)所得上清液浓缩至溶液中可溶性固形物浓度达30％，得所述榆树皮提取液。
实施例五：榆树皮提取液的制备：
1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌6min，其中，榆树皮与水的料液比为1:2.5g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为11:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.2％的果胶酶、占榆树皮重量的0.4％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.3％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在50℃，搅拌反应2.5h，之后将温度升至95℃，加热25min，再降温至室温，过滤，收集滤液B；
2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在12000rpm之间，离心温度为20℃，离心时间为25min；
3)将步骤2)所得上清液浓缩至溶液中可溶性固形物浓度达25％，得所述榆树皮提取液。
实施例六：榆树皮提取液的制备：
1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌7min，其中，榆树皮与水的料液比为1:2g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为12:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.1％的果胶酶、占榆树皮重量的0.5％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.2％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在55℃，搅拌反应2h，之后将温度升至100℃，加热20min，在降温至室温，过滤，收集滤液B；
2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在12500rpm之间，离心温度为15℃，离心时间为30min；
3)将步骤2)所得上清液浓缩至溶液中可溶性固形物浓度达20％，得所述榆树皮提取液。
实施例七：桦褐孔菌发酵液的制备：
1)制备桦褐孔菌种子悬液：先将保存的桦褐孔菌菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在27℃活化7d；之后，用接种针勾取4块0.5cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为180rpm，在27℃的条件下振荡培养12d，得所述桦褐孔菌种子悬液。
2)发酵培养：在5L的发酵罐中加入2L的桦褐孔菌培养基，之后将桦褐孔菌种子悬液接种于发酵罐中，接种量为15％，在通气量为1:0.5vvm，温度为27℃，罐压为0.01MPa下发酵培养10天，过滤，收集发酵液，发酵液经高压灭菌后浓缩至溶液折光率达35％，即为所述桦褐孔菌发酵液；其中，桦褐孔菌培养基为榆树木屑与实施例二所得的溶液A按料液比为15:1g/L混合后所得培养基。
以上所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
实施例八：桦褐孔菌发酵液的制备：
1)制备桦褐孔菌种子悬液：先将保存的桦褐孔菌菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在28℃活化6d；之后，用接种针勾取4块0.5cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为190rpm，在28℃的条件下振荡培养11d，得所述桦褐孔菌种子悬液。
2)发酵培养：在5L的发酵罐中加入2.5L的桦褐孔菌培养基，之后将桦褐孔菌种子悬液接种于发酵罐中，接种量为12％，在通气量为1:1vvm，温度为28℃，罐压为0.02MPa下发酵培养9天，过滤，收集发酵液，发酵液经高压灭菌后浓缩至溶液折光率达38％，即为所述桦褐孔菌发酵液；其中，桦褐孔菌培养基为榆树木屑与实施例二所得的溶液A按料液比为12:1g/L混合后所得培养基。
以上所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
实施例九：桦褐孔菌发酵液的制备：
1)制备桦褐孔菌种子悬液：先将保存的桦褐孔菌菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在30℃活化5d；之后，用接种针勾取4块0.5cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200rpm，在30℃的条件下振荡培养10d，得所述桦褐孔菌种子悬液。
2)发酵培养：在5L的发酵罐中加入3L的桦褐孔菌培养基，之后将桦褐孔菌种子悬液接种于发酵罐中，接种量为10％，在通气量为1:1.5vvm，温度为30℃，罐压为0.03MPa下发酵培养8天，过滤，收集发酵液，发酵液经高压灭菌后浓缩至溶液折光率达40％，即为所述桦褐孔菌发酵液；其中，桦褐孔菌培养基为榆树木屑与实施例二所得的溶液A按料液比为10:1g/L混合后所得培养基。
以上所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
实施例十至实施例十三：
本发明实施例十至实施例十三为桑黄液体深层发酵培养工艺，其中实施例十至实施例十二所用的溶液A为实施例二所得的溶液A、所用的榆树皮提取液为实施例五所得的榆树皮提取液、所用的桦褐孔菌发酵液为实施例八所得的桦褐孔菌发酵液。实施例十三所用的溶液A为实施例二所得的溶液A、所用的榆树皮提取液为实施例五所得的榆树皮提取液，实施例十三未使用桦褐孔菌发酵液。
实施例十：
一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25℃活化8d。
所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200rpm，在25℃的条件下振荡培养7d，得所述桑黄种子悬液。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将85ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为5％，接种之后在25℃，转速为200rpm，持续培养7d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将200mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为15％，接种之后在25℃，转速为200rpm，持续培养7d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2L的发酵培养基以及占发酵培养基体积5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％，在通气量为1:1.5vvm，温度为25℃，罐压为0.04MPa下发酵培养7天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在5.9。
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10:1混合后，调节pH值为5.9，再经121℃，湿热灭菌20min后，所得的混合液。
实施例十一：
一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在28℃活化7d。
所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为220rpm，在28℃的条件下振荡培养6d，得所述桑黄种子悬液。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将90ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为4％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养6d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将220mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为12％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养6d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2.5L的发酵培养基以及占发酵培养基体积4％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为12％，在通气量为1:1vvm，温度为28℃，罐压为0.03MPa下发酵培养6天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在5.8。
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为12:1混合后，调节pH值为5.8，再经121℃，湿热灭菌15min后，所得的混合液。
实施例十二：
一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在30℃活化6d。
所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为250rpm，在30℃的条件下振荡培养5d，得所述桑黄种子悬液。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将95ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为3％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养5d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将250mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为10％，接种之后在30℃，转速为150rpm，持续培养5d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为15％，在通气量为1:0.5vvm，温度为30℃，罐压为0.02MPa下发酵培养5天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在6.0。
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10:1混合后，调节pH值为6.0，再经122℃，湿热灭菌10min后，所得的混合液。
实施例十三：
一种桑黄液体深层发酵培养工艺，它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在28℃活化7d。
所述的PDA固体培养基包括20％马铃薯1L、葡萄糖20g、KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，琼脂20g，pH自然，121℃灭菌15min。
(2)制备桑黄种子悬液：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为220rpm，在28℃的条件下振荡培养6d，得所述桑黄种子悬液。
所述的PDA液体培养基包括20％马铃薯1L，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O1.5g，硫胺素8mg，pH自然，121℃灭菌15min。
(3)一级发酵培养：将90ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为4％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养6d，得一级液体菌种。
(4)二级发酵培养：将220mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为12％，接种之后在28℃，转速为180rpm，持续培养6d，得二级液体菌种。
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2.6L的发酵培养基，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为12％，在通气量为1:1vvm，温度为28℃，罐压为0.03MPa下发酵培养6天，得桑黄液体发酵产物；整个发酵过程中，利用灭菌的稀NaOH或HCl调节发酵液pH值，使发酵液pH始终维持在5.8。
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为12:1混合后，调节pH值为5.8，再经121℃，湿热灭菌15min后，所得的混合液。
实施例十四：
(1)菌丝生物量的测定：
将实施例十至实施例十三发酵后所得的桑黄液体发酵产物分别经8层纱布过滤，收集桑黄菌丝体以及桑黄液体发酵液，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，得对应的菌丝体A、菌丝体B、菌丝体C以及菌丝体D，之后对菌丝体A、菌丝体B、菌丝体C以及菌丝体D进行称重，经称重实施例十一所得的桑黄菌丝体最重。
(2)胞内多糖含量的测定
将菌丝体A、菌丝体B、菌丝体C以及菌丝体D磨成粉末，之后分别称取适量菌丝体A、菌丝体B、菌丝体C以及菌丝体D干粉进行以下操作，进行相应菌丝体胞内多糖含量的测定。
将菌丝体干粉置于烧杯中，按料液比1:10g/mL加入蒸馏水，90℃浸提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，50℃下减压浓缩，浓缩液加入4倍体积无水乙醇，隔夜醇沉，3000rpm、20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀用蒸馏水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即胞内多糖含量，测试的结果见表1。
(3)麦角甾醇的提取和检测：
分别称取1g菌丝体A干粉、1g菌丝体B干粉、1g菌丝体C干粉以及1g菌丝体D干粉进行以下操作，进行麦角甾醇的提取与检测。
将称好的各菌丝体干粉，分别置于25mL容量瓶，加入20mL CHCl3液，超声波浸提1h(功率300W，频率50kHz)，然后3000rpm离心15min，取上清液，残渣用5mL CHCl3洗涤后3000rpm离心10min，取上清液。合并两次上清液得到含麦角甾醇的提取液。
麦角甾醇含量测定：将含麦角甾醇的提取液用CHCl3定容至25mL得萃取液，取2mL萃取液，氮气吹干后用5mL甲醇溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤，滤液供HPLC分析用。高效液相色谱条件：色谱柱：安捷伦C18色谱柱(200mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇(色谱级)，流速1.2mL/min；UV检测波长：检测波长282nm，柱温30℃，进样量10μL。检测结果见表1。
(4)桑黄漆酶的提取和检测：
将实施例十至实施例十三步骤(5)发酵罐培养后所得的桑黄液体发酵液经多层纱布过滤，8000rpm离心10min，取上清液，即得漆酶粗酶液。酶活测定利用漆酶氧化ABTS(2,2＇-连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸))，用可见紫外分光光度计测定波长420nm处0-3min内吸光度值随时间的变化，求得漆酶反应速率，进而推算酶活。用等体积5mmol/L的ABTS水溶液和酶液反应，测定反应前3min内420nm处吸光值的增加，每分钟使1μmol的ABTS转化所需的酶量为1个活力单位(U)。定义:每1min氧化1μmol的ABTS所需的酶量为1个酶活单位。测定结果见表1。
表1
Figure BDA0002041381920000131
注：与对照组比较，*：P<0.05；**：P<0.01。
需要说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)桑黄菌种活化；
(2)制备桑黄种子悬液；
(3)一级发酵培养：将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行扩大培养，得一级液体菌种；
(4)二级发酵培养：将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于含有发酵培养基的三角瓶中进行再次扩大培养，得二级液体菌种；
(5)发酵罐培养：在5L的发酵罐中加入2-3L的发酵培养基以及占发酵培养基体积3％-5％的桦褐孔菌发酵液，之后将步骤(4)所得的二级液体菌种转接入发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为25-30℃，罐压为0.02-0.04MPa下发酵培养5-7天，得桑黄液体发酵产物；
其中，所述发酵培养基为溶液A与榆树皮提取液按体积比为10-15:1混合后，调节pH值为5.8-6.0，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，所得的混合液；
所述溶液A为双孢蘑菇罐藏加工废水经离心、浓缩至溶液折光率达到15％-20％，所得的溶液；
所述桦褐孔菌发酵液为利用溶液A对桦褐孔菌进行发酵培养后，经过滤、灭菌、浓缩所得的发酵液；
其中，所述榆树皮提取液的制备方法为：
1)酶解：将榆树皮粉碎成粉末后，倒入酶解罐中，同时向酶解罐中加入水、pH为7.0-7.2磷酸盐缓冲溶液，搅拌5-7min，其中，榆树皮与水的料液比为1:2-1:3g/mL，水与磷酸盐缓冲溶液的体积比为10:1-12:1；之后，再向酶解罐中依次加入占榆树皮重量的0.1％-0.3％的果胶酶、占榆树皮重量的0.3％-0.5％的纤维素酶、占榆树皮重量的0.2％-0.4％的半纤维素酶，控制酶解罐温度在45-55℃，搅拌反应2-3h，之后将温度升至90-100℃，加热20-30min，再降温至室温，过滤，收集滤液B；
2)离心分离：步骤1)所得的滤液B放入离心机中离心，收集上清液；其中，离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为20-30min；
3)将步骤2)所得上清液浓缩至溶液中可溶性固形物浓度达20％-30％，得所述榆树皮提取液；
所述桦褐孔菌发酵液的制备方法为：在5L的发酵罐中加入2-3L的桦褐孔菌培养基，之后将桦褐孔菌种子悬液接种于发酵罐中，接种量为10％-15％，在通气量为1:0.5-1.5vvm，温度为27-30℃，罐压为0.01-0.03MPa下发酵培养8-10天，过滤，收集发酵液，发酵液经高压灭菌后浓缩至溶液折光率达35％-40％，即为所述桦褐孔菌发酵液；其中，桦褐孔菌培养基为榆树木屑与溶液A按料液比为10:1-15:1g/L混合后所得培养基。
2.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：所述溶液A的制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为20-25℃，离心时间为15-20min；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到15％-20％，得溶液A。
3.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：所述桦褐孔菌种子悬液的制备方法为：先将保存的桦褐孔菌菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在27-30℃活化5-7d；之后，用接种针勾取4块0.5cm2大小的活化后的桦褐孔菌菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为180-200rpm，在27-30℃的条件下振荡培养10-12d，得所述桦褐孔菌种子悬液。
4.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(1)的具体方法为：将保存的桑黄菌种转接至含有PDA固体培养基的斜面上，在25-30℃活化6-8d。
5.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(2)的具体方法为：用接种针勾取5块0.5cm2大小的活化后的桑黄菌株接种于250mL的三角瓶中，加入100mL的PDA液体培养基，然后用脱脂棉塞封住瓶口，摇床转速设定为200-250rpm，在25-30℃的条件下振荡培养5-7d，得所述桑黄种子悬液。
6.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(3)的具体方法为：将85-95ml发酵培养基置于250mL的三角瓶中；接着将步骤(2)所得的桑黄种子悬液接种于三角瓶中，接种量为3％-5％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得一级液体菌种。
7.根据权利要求1所述的桑黄液体深层发酵培养工艺，其特征在于：步骤(4)的具体方法为：将200-250mL发酵培养基置于500mL的三角瓶中；接着将步骤(3)所得的一级液体菌种接种于三角瓶中，接种量为10％-15％，接种之后在25-30℃，转速为150-200rpm，持续培养5-7d，得二级液体菌种。
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CN112791108B (zh) * 2021-02-07 2022-05-03 青岛农业大学 一种桑黄活性成分的制备方法及其在辅助降血糖药物中的应用
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JP2013021966A (ja) * 2011-07-20 2013-02-04 Hiroyuki Obara アミノ酸の製造方法
CN104311240A (zh) * 2014-09-28 2015-01-28 铜陵市香江食用菌种植有限责任公司 一种用榆树皮制备香菇培养基质的方法
CN105315383B (zh) * 2015-10-19 2018-02-23 闽南师范大学 由双孢蘑菇罐头加工废水中提取纯化的活性多糖及其提取纯化工艺以及应用
CN108330072A (zh) * 2018-02-02 2018-07-27 山西康欣药业有限公司 桦褐孔菌液态深层发酵培养组合物及其制备方法及应用

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