CN108203693A - 利用烟草废弃物生产高浓度l-型乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物发酵领域，涉及以米根霉利用高固体含量的烟草废弃物同步糖化发酵生产高浓度L‑型乳酸的方法。具体为：取烟草废弃物，加入纤维素酶和果胶酶进行液化，得液化底物，灭菌后，加入纤维素酶和本发明的米根霉种子培养基培养所得的米根霉菌体，进行同步糖化发酵，得L‑型乳酸。所述米根霉种子培养基为添加了葡萄糖和维生素C的烟草废弃物萃取液。这种种子培养基能够代替昂贵的传统葡萄糖种子培养基并能有效提高固定化米根霉的木糖代谢水平。本发明的方法减少了高固体含量发酵中93％的液体粘稠度并使得后续的同步糖化发酵缩短了40.0％的发酵时间和提高了66.2％的L‑型乳酸最终浓度。

Description

利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物发酵领域，涉及以米根霉利用高固体含量的烟草废弃物同步糖化发酵生产高浓度L-型乳酸的方法。

背景技术

我国是全球第一烟草种植大国也是全球第一烟草产品消费大国，每年卷烟消费接近4000万箱，将近占世界总消费的四分之一。在这巨量的烟草消费背后，是数量巨大的烟草废弃物的产生：卷烟工业多采用烟叶的边缘部分做为卷烟生产的原料，而剩余部分则被废弃。烟草废弃物产量占了烟叶总产量的三分之一强，包含了烟草行业在从种植到制作烟草产品过程中所产生的所有来自于烟草植株的固体废弃物，比如种植过程中的报废烟叶，收获以后留在田间的烟杆，烤烟过程中被淘汰的次级烟和烟梗，陈化过程中的发霉烟叶以及加工过程中烟叶剪切后剩下的烟末，如图1所示。这些废弃物的共同点为都含有潜在基因毒性的尼古丁。这种有毒废弃物因为其极易污染地下水资源而被禁止填埋处理。传统的处理方式就是像小麦秸秆一样焚烧处理，这种处理方式不但浪费了宝贵的烟草生物资源而且会产生新的污染，将烟草废弃物转化为高价值的产品不但能够有效的利用宝贵的生物资源，也符合我国对有机废弃物所出的资源化和无害化的要求。

烟草废弃物的主要特征是其含有极高比例的可溶水的有机物(～40％)，这些有机物中包含了许多高价值的成份如蛋白质、氨基酸、还原糖、烟酸等等，是微生物生长极佳的营养来源。另一方面，烟草废弃物的不可溶部分中含有大量细胞壁物质：纤维素(～20％)、半纤维素(～10％)、果胶(～12％)和木质素(～12％)，其中纤维素、半纤维素和果胶都能被水解成为可发酵的单糖。如何科学合理的利用这些组分，将是综合和高效利用烟草废弃物的关键。

L-型乳酸是一种重要的微生物代谢产物，在许多领域如食品，制药，材料合成等方面都有不可替代的作用。近年来，由于L-型乳酸能够作为拥有多种优秀医学性能的生物材料聚乳酸的主要构成原料，其需求量与日俱增。米根霉是目前实现工业化生产L-型乳酸最有前途的菌种之一，由于其拥有许多发酵优点：(a)能够生产生产几乎百分之百光学纯的L-型乳酸；(b)相比细菌对培养基要求不高；(c)不易被污染；(d)其菌丝可以作为菌体蛋白成为一种有价值的副产物以及(e)自身能够生产淀粉酶，可以直接利用淀粉类物质发酵产乳酸。在实际工业生产中，米根霉主要都是利用高淀粉物质作为发酵底物生产乳酸，如土豆，玉米等等。同时，米根霉的发酵前需要一个种子培养阶段为其孢子的发芽生长提供丰富的碳源和氮源，以便在发酵的开始阶段就有足够的成熟的米根霉细胞来生产乳酸。由于其能够被迅速吸收并提供大量的能量，目前主要使用的种子培养氮源为葡萄糖。

然而，随着全球粮食危机的日益加剧，使用淀粉类物质和单糖生产乳酸这种与人争粮的生产方式已经越来越难以为继。由于我国是一个人少地多的国家，粮食问题始终是我们国家最最重要的问题，再使用传统方式生产L-型乳酸已经显得越来越不合时宜。我国的L-型乳酸行业和聚乳酸生产企业都远远落后于国际水平，并且大量依赖于进口。近年来，将富含纤维素的农工业废弃物糖化为单糖，再利用这些可发酵单糖生产L-型乳酸已经成为一个研究热点。由于烟草废弃物的高纤维素含量和低木质素含量，烟草废弃物能够通过糖化反应为乳酸发酵提供大量的可发酵糖。利用米根霉从烟草废弃物中生产L-型乳酸是另外一条吸引人的工艺路线。图2为利用米根霉将烟草废弃物转化为乳酸的常用流程。

然而，目前利用米根霉从烟草废弃物中生产L-型乳酸的产率均较低，当前主要的问题是米根霉细胞的木糖代谢水平和葡萄糖代谢相比很低。低水平的木糖代谢减少了木糖的消耗速率和L-型乳酸转化率，导致了米根霉在使用纤维素水解液时生产效率低下。氮源供应可能是导致这个现象的一个限制因素，因为相比于葡萄糖代谢，米根霉的木糖代谢对氮源的需求几乎是其3倍。米根霉胞内缺乏辅因子(如NADPH,NADH和NAD+)可能是导致低水平木糖代谢的另外 一个因素，因为L-型乳酸的合成伴随着NADH的消耗。除此之外，米根霉木糖代谢的第一步和第二步分别是NADPH依赖和NAD+依赖步骤。米根霉胞内ATP浓度或许是第三个限制木糖转化为L-型乳酸的因素，因为之前的文献中的代谢分析显示足够的ATP对米根霉的木糖代谢来说是必须的。然而，在工业L-型乳酸生产中加入以上这些提到的物质去提高产量是非常不经济而且不现实的。因此，寻找一种便宜的底物，能够提供足够的氮源、辅因子和ATP用以提高米根霉的木糖代谢这样的方案才在实际生产中可行。

木糖是烟草废弃物水解产物中最主要的单糖之一，高效的利用这种糖并把其转化为乳酸能够大大的提高米根霉转化烟草废弃物为乳酸的效率，对整个利用烟草废弃物生产乳酸的方案来说意义重大。因此，如何提高米根霉细胞的木糖代谢水平是亟需解决的问题之一。

此外，导致米根霉从烟草废弃物中生产L-型乳酸的产率均较低的另外一个问题是：高固体含量的同步糖化发酵是近年来最有商业潜力实现纤维素来源L-型乳酸工业化的技术，因为其能够达到较高的底物糖化率和利用率。然而高固含量液体的粘稠度，增加搅拌能源消耗，降低米根霉的氧气传递效率，最终使得高固体含量的同步糖化发酵效率变低。烟草废弃物中，除了纤维素物质(纤维素，半纤维素和木质素)以外，果胶是也是增加发酵底物粘稠度的一种大分子多糖。果胶主要是由半乳糖醛酸的骨架构成，和木质素、半纤维素混合在一起构成了植物细胞壁的中间层。这些物质的存在会大大增加纤维素水解液的粘度，阻碍纤维素酶和纤维素的接触，大大降低了整个发酵的转化。如何降低在同步糖化发酵中高浓度固体的粘稠度，实现高固体含量的同步糖化发酵的同时还能提高高固体含量的同步糖化发酵效率是亟需解决的另一个问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的首先在于提供一种米根霉种子培养基，利用烟草废弃物萃取液能够代替高浓度葡萄糖作为米根霉种子培养基，原料便宜易得，节约了成本，不但能够解决环境污染问题，还能满足日益增长的L-型乳酸市场 需求。利用该米根霉种子培养基培养所得的米根霉，在丝状真菌利用纤维素原料水解液发酵产乳酸的过程中提高了其木糖代谢的效率，提高了米根霉将纤维素原料水解液转化为L-型乳酸的转化率。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

米根霉种子培养基，所述种子培养基为添加了葡萄糖和维生素C的烟草废弃物萃取液，所述烟草废弃物萃取液为烟草废弃物水提取液。

在正式发酵之前，米根霉需要一个种子培养阶段以便使其从存储状态的孢子成长为菌丝，并为下一阶段发酵提供足够的细胞浓度，因此，种子培养基的组成能够非常直接的影响到其下一阶段的发酵情况。我们通过试验证明，在传统的种子培养基中加入微量的葡萄糖能极大的改变发酵中米根霉对乳酸的转化率，这是由于种子培养时期是其代谢系统构建的时期，此时对代谢系统进行调控肯定好于代谢系统成型以后再对其进行调控。

烟草废弃物是卷烟制作过程中产生的主要工农业纤维素副产物。首先，它包含了高浓度的蛋白质在其液体萃取液中。这些可溶性的蛋白质能够将便宜和足够的氮源提供给米根霉孢子的发芽和菌体初始生长。更引人注目的是，它的萃取也同样还含有大量的尼古丁酸(烟酸)以及ATP导向氨基酸，这两种物质能够分别有效的提高米根霉胞内的辅因子和ATP浓度。最后，烟草废弃物的萃取液含有高浓度的可溶性果胶和还原糖，但是缺乏葡萄糖。所有这些特点使得烟草废弃物萃取液有巨大的潜力能够成为一种理想的米根霉发酵产乳酸的种子培养基。因此，我们建立了一种以烟草废弃物萃取液为原料的米根霉种子培养基，并将其扩大化用于发酵罐的长期生产。结果显示，本发明的米根霉种子培养基能够代替昂贵的传统葡萄糖种子培养基并能有效的提升米根霉的木糖代谢水平并且提高了米根霉将纤维素原料水解液转化为L-型乳酸的转化率。本发明首次研究证明了利用烟草废弃物萃取液能够代替高浓度葡萄糖作为种子培养基并在丝状真菌利用纤维素原料水解液发酵产乳酸的过程中提高了其木糖代谢的效率。

进一步，所述的米根霉种子培养基，所述烟草废弃物先经过预处理再进行 水提取，所述预处理选自稀酸预处理、蒸汽爆破预处理和氧化预处理中的一种或多种。

进一步，所述的米根霉种子培养基，所述预处理优选蒸汽爆破预处理。

进一步，所述的米根霉种子培养基，优选所述葡萄糖与烟草废弃物萃取液的比例为0-15g：1L。

进一步，所述的米根霉种子培养基，优选所述维生素C与烟草废弃物萃取液的比例为0-0.2g：1L。

本发明还提供了一种米根霉菌体，所述米根霉菌体是由米根霉孢子经本发明所述的米根霉种子培养基培养所得。利用本发明的米根霉种子培养基培养所得的米根霉，在丝状真菌利用纤维素原料水解液发酵产乳酸的过程中提高了其木糖代谢的效率，提高了米根霉将纤维素原料水解液转化为L-型乳酸的转化率。

本发明的另一目的还在于提供一种利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，该方法将烟草废弃物转化为高附加值的产品L-型乳酸，是一套绿色高效处理烟草废弃物的生产方案。烟草废弃物含有较高比例的纤维素和半纤维素，可以被认为是一种理想的可发酵糖来源。使用烟草废弃物作为乳酸发酵的原料，不但能够解决环境污染问题，还能满足日益增长的L-型乳酸市场需求。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，包括如下进行的步骤：

(1)液化

取烟草废弃物，加入纤维素酶和果胶酶进行液化，得液化底物；

(2)同步糖化发酵

取步骤(1)所得液化底物，灭菌后，加入纤维素酶和利用本发明的米根霉种子培养基培养所得的米根霉菌体，进行同步糖化发酵，得L-型乳酸。

进一步，所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，所述米根霉为固定化米根霉。在米根霉发酵过程中，其复杂的细胞形态导致了搅拌，分离， 过滤和转移等方面的困难，严重影响了发酵过程的进行和生产效率。固定化技术能够给米根霉细胞的附着提供足够的表面积并能在生产中反复使用，它能够控制米根霉细胞形态，改进米根霉细胞的氧气供应情况和提高细胞浓度，最终提高目标发酵产物的产率。此外，固定化技术还能省去发酵结束后菌体和发酵液的分离过程。本文使用一种星形的固定化载体固定米根霉细胞，用于改进氧气和物质传递，最终提高米根霉细胞的发酵效率。此外，固定化技术还能耦合发酵和分离过程，提高微生物的耐受性，简化生产过程，减少生产成本。

在本发明的一个具体实施例中，公开了一种具体的星型细胞固定化载体，是由不锈钢铁丝作为骨架，棉布作为表面手工组装缝合而成。支架能够为米根霉菌丝提供足够的空间和表面积供其附着并易于安装和拆解。在使用前，每个支架都使用蒸馏水水洗3次以后在121℃灭菌20分钟。

进一步，所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，所述烟草废弃物先经过预处理再加入纤维素酶和果胶酶进行液化，所述预处理选自稀酸预处理、蒸汽爆破预处理和氧化预处理中的一种或多种。由于米根霉无法将木质素和果胶物质转化为乳酸，并且这两种物质的存在都会影响到纤维素酶的水解效率，因此，优选先进行预处理步骤降低烟草废弃物中的木质素和果胶含量，以便提高其糖化效率。

进一步，所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，所述烟草废弃物先经过预处理，再进行水提取，水提取后的剩余固体干燥后再加入纤维素酶和果胶酶进行液化。烟草废弃物的最大特征是其高比例的水溶性物质，这些水溶性物质含有大量的蛋白质、氨基酸、还原糖和生物碱等，经过简单的热水萃取即可提取出。去除水溶组分以后的烟草废弃物含有更高比例的纤维素和半纤维素，分别为32.3％和12.3％，有利于提高底物的糖化率。

进一步，所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，所述步骤(2)中，同步糖化发酵的温度为25-40℃。

由于米根霉普遍报道的最适温度为30℃左右，而纤维素酶最佳温度为50℃，本发明优选最佳的同步糖化发酵过程中的温度设置为25-40℃。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种新型种子培养基，用于米根霉的预培养，这种种子培养基能够代替昂贵的传统葡萄糖种子培养基并能有效提高米根霉的木糖代谢水平。利用烟草废弃物萃取液能够代替高浓度葡萄糖作为米根霉种子培养基，原料便宜易得，节约了成本，解决了环境污染问题。利用该米根霉种子培养基培养所得的米根霉，在丝状真菌利用纤维素原料水解液发酵产乳酸的过程中提高了其木糖代谢的效率，提高了米根霉将纤维素原料水解液转化为L-型乳酸的转化率。

(2)本发明的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，该方法将烟草废弃物转化为高附加值的产品L-型乳酸，是一套绿色高效处理烟草废弃物的生产方案。烟草废弃物含有较高比例的纤维素和半纤维素，可以被认为是一种理想的可发酵糖来源。使用烟草废弃物作为乳酸发酵的原料，不但能够解决环境污染问题，还能满足日益增长的L-型乳酸市场需求。

(3)本发明的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，使用液化技术，通过加入果胶酶和纤维素酶，减少了高固体含量发酵中93％的液体粘稠度，使用本发明的种子培养基培养所得的米根霉菌体进行发酵，使得后续的同步糖化发酵缩短了40.0％的发酵时间和提高了66.2％的L-型乳酸最终浓度。在优化了同步糖化发酵的条件以后，得到L-型乳酸浓度为125.2g/L，这是目前文献报道中同步糖化发酵产乳酸的最高浓度，并达到了工业有机酸生产的浓度要求。

附图说明

图1烟草废弃物产生示意图；

图2从烟草废弃物到乳酸的路线；

图3星型细胞固定化载体；

图4烟草废弃物提取液和传统种子培养基培养固定化米根霉的动力曲线(A)孢子固定化(B)生物量累积；

图5利用预处理萃取液作为米根霉种子培养基；

图6使用传统种子培养基(A)和本发明种子培养基(B)进行发酵；

图7重复批次发酵；

图8传统种子培养基(A)与本发明的种子培养基(B)补料式发酵；

图9添加的酶对液化的影响；

图10物料平衡；

图11使用液化的(A)和未液化的(B)烟草废弃物进行同步糖化发酵。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，还包括各具体实施方式间的任意组合，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中所用到的烟草废弃物，在处理之前被机械磨成50目，放置在干燥器中。

米根霉(Rhizopus oryzae)CICC 3158，从中国工业微生物保存中心购买。菌种在常温下活化菌体以后，接种PDA平板培养5天，观察孢子成熟以后放入冰箱，温度设置为4℃。为了维持米根霉细胞活性，每一个月传代一次。接种所使用的孢子悬浮液也是在PDA培养基上生长的。

实施例1烟草废弃物萃取液

(1)烟草废弃物萃取液A：取上述被磨成50目的烟草废弃物，按一定比例加入三蒸水和6mol/L的硫酸将pH值降至3.0后在常压下煮沸0.5小时。使用冰将其冷却到30℃以后，混合物使用真空抽滤机过滤，收集液体部分，使用盐酸和氢氧化钠将其pH调至5.0后加入柠檬酸(0.34g/L)和柠檬酸钠(0.17g/L)固体作为缓冲剂，121℃下灭菌20分钟，制得烟草废弃物萃取液A，固 体A干燥备用。

烟草废弃物萃取液B(稀酸预处理)：取上述被磨成50目的烟草废弃物，使用6％浓度的盐酸在90℃处理一个小时，然后使用蒸馏水萃取，收集萃取液，使用盐酸和氢氧化钠将其pH调至5.0后加入柠檬酸(0.34g/L)和柠檬酸钠(0.17g/L)固体作为缓冲剂，121℃下灭菌20分钟，制得烟草废弃物萃取液B，固体B干燥备用。

烟草废弃物萃取液C(蒸汽爆破预处理)：取上述被磨成50目的烟草废弃物，放入5L容量的蒸汽爆破机中，蒸汽压力设置为4MPa，温度为220℃，维持5分钟以后，瞬间释放出蒸汽。温度降至40摄氏度时，取出底物使用蒸馏水萃取，收集萃取液，使用盐酸和氢氧化钠将其pH调至5.0后加入柠檬酸(0.34g/L)和柠檬酸钠(0.17g/L)固体作为缓冲剂，121℃下灭菌20分钟，制得烟草废弃物萃取液C，固体C干燥备用。

烟草废弃物萃取液D(氧化剂次氯酸钠处理)：取上述被磨成50目的烟草废弃物，将氧化剂次氯酸钠(浓度10％)和蒸馏水1：5混合以后，在常温常压下加入烟草废弃物中，搅拌处理一个小时以后，使用蒸馏水萃取，收集萃取液，使用盐酸和氢氧化钠将其pH调至5.0后加入柠檬酸(0.34g/L)和柠檬酸钠(0.17g/L)固体作为缓冲剂，121℃下灭菌20分钟，制得烟草废弃物萃取液D，固体D干燥备用。

传统种子培养基：30g/L葡萄糖，2.5g/L酵母膏。

烟草废弃物包含了高浓度的蛋白质在其液体萃取液中。这些可溶性的蛋白质能够将便宜和足够的氮源提供给米根霉孢子的发芽和菌体初始生长。更引人注目的是，它的萃取也同样还含有大量的尼古丁酸(烟酸)以及ATP导向氨基酸，这两种物质能够分别有效的提高米根霉胞内的辅因子和ATP浓度。最后，烟草废弃物的萃取液含有高浓度的可溶性果胶和还原糖，所有这些特点使得烟草废弃物萃取液有巨大的潜力能够成为一种理想的米根霉发酵产乳酸的种子培养基。

(2)以烟草废弃物萃取液进行种子培养

①如图3所示，支架高0.5cm直径2cm呈六角星型。是由不锈钢铁丝作为骨架，棉布作为表面手工组装缝合而成。支架能够为米根霉菌丝提供足够的空间和表面积供其附着并易于安装和拆解。在使用前，每个支架都使用蒸馏水水洗3次以后在121℃灭菌20分钟。

将分别装有50mL上述烟草废弃物萃取液A和传统种子培养基的250ml锥形瓶连同加入的固定化载体一起灭菌以后，被接种2mL的米根霉孢子液，然后放置于设置为170r/min和30℃的恒温摇床中，图4A显示了使用烟草废弃物萃取液A和传统葡萄糖(30g/L)分别作为种子培养基时，米根霉孢子的固定化动力曲线，图4B显示了在这两种种子培养基中固定化米根霉生物量的累积情况。可以看出，由于星型载体提供了足够的表面积供米根霉孢子附着，在两种种子培养基中的米根霉孢子都在12个小时以内完全附着在了载体上并发芽生成了菌丝，发酵液中没有游离的孢子和菌体存在。但是相比于传统葡萄糖种子培养基，烟草废弃物萃取液中的孢子固定化速率要长2个小时，这可能和烟草废弃物中含有的大分子物质较多而导致的液体粘稠度更高有关。固定化米根霉在传统葡萄糖种子培养基中培养24小时以后停止生长，菌重为4.2g/L；而在烟草废弃物萃取液中，固定化米根霉生长到了48小时，菌重将近提高了一倍(8.5vs.4.2g/L)，这意味着更高浓度的米根霉菌体将参与到接下来的发酵过程中。综上所述，烟草废弃物萃取液A能够为固定化米根霉着床、发芽和生长提供足够的营养，因此能够作为米根霉的种子培养基。

②将分别装有50mL上述烟草废弃物萃取液B、烟草废弃物萃取液C、烟草废弃物萃取液D和传统种子培养基的250ml锥形瓶一起灭菌以后，被接种2mL的米根霉孢子液，然后放置于设置为170r/min和30℃的恒温摇床中，培养24小时后测定固定化米根霉细胞的生物量。结果如图5所示，米根霉在稀酸预处理萃取液中生长的最好，这可能和稀酸溶出了更多的木糖有关；蒸汽爆破预处理的萃取液果胶酶活性最高，米根霉生物量次之；而氧化预处理萃取液中生长的米根霉细胞的生物量明显不如其余两组，显示了氧化预处理产生的抑制米根霉生长的物质最多，而蒸汽爆破最少。因为蒸汽爆破由于极少的化学制剂的 添加而被认为是一种绿色技术，因此，蒸汽爆破预处理技术被确定为最优选的预处理技术。

实施例2米根霉种子培养基

虽然实施例1证实了烟草废弃物萃取液可以直接用于米根霉种子培养。但是本申请的发明人发现，向烟草废弃物萃取液中加入葡萄糖和维生素C进行优化后所得的本发明的米根霉种子培养基能够有效的提升米根霉的木糖代谢水平并且提高了米根霉将纤维素原料水解液转化为L-型乳酸的转化率。

(1)传统种子培养基：50g/L葡萄糖，3g/L(NH4)2SO4，0.75g/LMgSO4·7H2O，0.20g/LZnSO4·7H2O，0.30g/LKH2PO4，10g/LCaCO3。

(2)本发明的米根霉种子培养基：以实施例1所得的烟草废弃物萃取液A为原料，并向其中加入葡萄糖和维生素C进行优化。本实施例以加入葡萄糖5.0g/L，加入维生素C0.1g/L为例。

(3)纤维素水解液发酵培养基：制备烟草废弃物萃取液种子培养基剩余的固体物质，使用三蒸水冲洗两次以后干燥然后使用前都储存在一个干冷的环境中。固体物质被纤维素酶水解，酶用量为0.06g/g剩余固体物质质量(Zhang et al.,2013)，固液比1：10，放入一个设置为50℃和180rpm转速的摇床中。持续3天后，粗水解液被99℃处理10分钟用以酶灭活，然后加入2％(w/v)的活性炭去吸收那些抑制乳酸发酵的物质，然后离心机15000g下15分钟。收集上清液然后使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液被测含有61.4g/L葡萄糖，37.1g/L木糖。在被加入60％的碳酸钙并在121℃下灭菌以后，纤维素水解液制备完成。

(4)种子培养及摇瓶发酵

将传统高浓度葡萄糖种子培养基与本发明的米根霉种子培养基中预培养的米根霉细胞用于单批次乳酸摇瓶发酵，纤维素水解液作为发酵底物，具体方法如下：

将分别装有50mL传统种子培养基和本发明的米根霉种子培养基的250ml锥形瓶灭菌以后，被接种5mL(10⁶per/mL)的米根霉孢子液，然后放置于设置 为170r/min和30℃的恒温摇床中。在经过36小时的种子培养以后，米根霉孢子发芽生长，取出转移入已经灭菌的装有50mL纤维素水解液发酵培养基的250mL锥形瓶中，然后一起放回恒温摇床开始发酵培养，摇床设置为32℃和200rpm，pH维持在5.5，发酵时间3天。在发酵期间，样品被取出用以测定L-型乳酸，葡萄糖和木糖的变化。发酵结果如图6A和图6B所示。

在使用传统种子培养基培养出的米根霉发酵实验中，葡萄糖在36小时以后被耗尽。在这个点以后木糖才开始被消耗，而且由于木糖的消耗速率是如此的慢以至于在72小时候发酵结束以后还有几乎三分之一的木糖没有被利用。计算得出木糖和葡萄糖的糖利用速率为0.34和1.69g/L/h。最终，39.6g/L的L-型乳酸被生产出来(图6A)。相反的，在使用本发明的种子培养基的情况下，米根霉对葡萄糖和木糖的消耗几乎都是同时开始。葡萄糖在48小时以后消耗完同时只有4％的木糖没有在72小时之类被消耗完了。计算得出木糖和葡萄糖的消耗速率为0.51和1.27g/L。最终L-型乳酸的浓度为77.6g/L(图6B)。因此，相比于传统的种子培养基，本发明的种子培养基中预培养的米根霉能取得更高的L-型乳酸转化率(79.6％vs.46.0％)，生产速率(1.08vs.0.55g/L/h)和木糖吸收速率(0.51vs.0.34g/L/h)。即本发明的种子培养基最高提高了木糖2.12倍的吸收速率和1.73倍L-型乳酸的转化率。

实施例3发酵罐发酵

(1)重复批次发酵

为了比较米根霉由本发明种子培养基和传统种子培养基预培养在长时间多批次发酵中的稳定性，由这两种种子培养基培养的米根霉被分别用于放大发酵中，纤维素水解液作为发酵底物，一种气升式发酵罐被用于进行重复批次发酵，温度稳定在32℃，pH维持在5.5，通气量0.5vvm。图7展示了总共七个批次的重复发酵的情况：本发明的种子培养基和传统种子培养基相比，明显在每一批次都提高了L-型乳酸的产率。更引人注目的是，由本发明的种子培养基预培养的米根霉在多批次发酵中L-型乳酸产量一直上升直到第四批次，而传统种子 培养基所预培养的米根霉在第二批次开始L-型乳酸产量就出现了明显的下降，原因在于传统种子培养基预培养的米根霉形成了更大的菌团，严重影响了米根霉内部细胞获取养分和氧气。最终，本发明的种子培养基组在前5个批次的L-型乳酸浓度都超过了50g/L，而传统种子培养基组只有两个批次达到了这一标准。这些结果说明了本发明种子培养基相比于传统种子培养基能够维持更长时间的米根霉细胞活性和更好的木糖吸收利用率。

(2)补料式发酵

为了进一步获取米根霉能够生产的最高浓度L-型乳酸，补料式发酵模式被适用于本试验中。补料式发酵模式：使用补料方式补充发酵所消耗的碳源。每当发酵罐中葡萄糖浓度降至0g/L的时候，加入160mL的浓缩纤维素水解液，包含了41.1g的木糖和70.7的葡萄糖并添加67.1g的碳酸钙，用于提升发酵罐中还原糖浓度至大约60g/L。浓缩的纤维素水解液被三次加入到发酵罐中。为了比较米根霉由本发明的种子培养基和传统种子培养基预培养在补料式发酵中的表现，由这两种种子培养基培养的米根霉被分别用于发酵罐补料发酵中，纤维素水解液作为发酵底物，一种气升式发酵罐被用于进行重复批次发酵，温度稳定在32℃，pH维持在5.5，通气量0.5vvm。如图8A所示，使用传统种子培养基的米根霉发酵结束于96小时，在这个时间点51.3g/L的木糖还未被利用，虽然葡萄糖已经完全被利用了。L-型乳酸的最终浓度为95.6g/L，总转化率为0.58g/g总消耗的还原糖，对应于L-型乳酸平均生产速率为1.00g/L g/L/h。相比于摇瓶发酵，米根霉能够有更高的L-型乳酸转化率和生产速率应该归因于气升式发酵罐能够提供更高的菌体活力和溶氧度。然而，L-型乳酸的总转化率依然很低，由于传统种子培养基导致的低木糖吸收和利用率。

在本发明的种子培养基被使用的情况下，L-型乳酸的最终浓度和最终转化率分别为173.5g/L(补料式发酵获取了目前所有文献报道的真菌利用纤维素水解液生产L-型乳酸的最高浓度)和0.86g/g消耗的总还原糖，对应了总生产速率为1.45g/L/h(图8B)，发酵持续时间为120个小时。这个L-型乳酸最终浓度是所有关于真菌利用纤维素水解液发酵产L-型乳酸的文献中最高的，而 且能符合工业聚合物级L-型乳酸的要求：浓度大于100g/L。发酵结束后剩余的木糖为10.5g/L。总之，和传统种子培养基相比，本发明的种子培养基在补料式发酵中提高了米根霉48.3％的L-型乳酸转化率，81.5％的最终L-型乳酸浓度和112.0％的木糖吸收速率。

实施例4高固体含量的烟草废弃物的预处理

烟草废弃物中不可溶组分主要由四种细胞壁物质构成：纤维素(20.2％)，半纤维素(9.8％)，木质素(11.3％)和果胶(10.7％)。在这其中，纤维素和半纤维主要构成细胞壁的骨架，果胶和木质素起着粘合剂的作用，四种物质混合在一起，共同构成了烟草细胞的细胞壁。根据前期的研究，米根霉无法将木质素和果胶物质转化为乳酸，并且这两种物质的存在都会影响到纤维素酶的水解效率。因此，优选的方案是先进行预处理步骤降低烟草废弃物中的木质素和果胶含量，以便提高其糖化效率。近二十年，主要的预处理方法有三种：稀酸处理，蒸汽爆破预处理和氧化预处理。

表1为蒸汽爆破预处理前后烟草废弃物的组分变化，经过计算可得，蒸汽爆破预处理后烟草废弃物的纤维素和半纤维素相比对照组分别增加了55.4％和86.6％，而木质素减少了61.0％。这是由于蒸汽爆破预处理过程中的在高温高压将烟草废弃物中的木质素结构破坏，降低了其含量。因此，实施例5中优选以蒸汽爆破预处理后的烟草废弃物为原料。

但是需要注意的是，预处理以后的果胶含量仍然较高(10.3％)，这会提高水解液中的粘稠度并降低糖化效率和最终的发酵效率。优选的，液化步骤将用于进一步的去除果胶物质以提高糖化烟草废弃物的转化率。

表1蒸汽爆破预处理前后烟草废弃物的组分变化(％)

实施例5固定化米根霉使用高固体含量的烟草废弃物进行同步糖化发酵生产高浓度的L-型乳酸

(1)固定化载体的制备

同实施例1。

(2)米根霉种子培养基：取上述被磨成50目的烟草废弃物，放入5L容量的蒸汽爆破机中，蒸汽压力设置为4MPa，温度为220℃，维持5分钟以后，瞬间释放出蒸汽。温度降至40摄氏度时，取出底物使用蒸馏水萃取，收集萃取液，使用盐酸和氢氧化钠将其pH调至5.0后加入柠檬酸(0.34g/L)和柠檬酸钠(0.17g/L)固体作为缓冲剂，121℃下灭菌20分钟，制得烟草废弃物萃取液C，固体C干燥备用。以所得的烟草废弃物萃取液C为原料，并向其中加入葡萄糖和维生素C进行优化后作为米根霉种子培养基。本实施例以加入葡萄糖5.0g/L，加入维生素C 0.1g/L为例。以萃取水溶性组分后剩下的固体C作为发酵底物。

(3)米根霉的种子培养

步骤(2)的米根霉种子培养基在灭菌以后，发酵罐加入3L种子培养基和10mL(10⁶per/mL)的孢子悬浮液进行接种。在24小时的30℃不通入空气的种子生长阶段过后，米根霉细胞已经完全固定在了载体上。

(4)发酵底物的液化

步骤(2)的固体C按照一定比例加入0.06g/g底物干重的纤维素酶和果胶酶并一起放入重力搅拌器。该纤维素酶和果胶酶的酶活分别为81FPU/mL和140U/mL。底物在50℃和7rpm的条件下，一分钟内顺时针和逆时针各转两次进行底物液化。为了探究果胶酶和纤维素酶添加对烟草废弃物的影响，设置了三组实验组，分别只使用果胶酶、只使用纤维素酶和使用纤维素加果胶酶在50℃，7rpm和固体含量25％的条件下进行液化处理，对照组为固体C浸泡在等比例等条件下的的蒸馏水中。

(5)同步糖化发酵

将步骤(4)液化后的底物灭菌以后，加入20FPU/g的纤维素酶然后重新 加入至步骤(3)中有固定化米根霉的发酵罐中，开始L-型乳酸的同步糖化发酵。发酵过程被控制在温度25-40℃和pH 5.5的条件下。为了更加防止碳酸钙固体的发酵的干扰，10M氢氧化钠被用来调节调节发酵罐中的pH。每隔一段时间，发酵液都被取出检测其中的还原糖和L-型乳酸的浓度。

(6)结果

①如图9所示：果胶酶加纤维素酶的组合，液化步骤结束以后，38.1％的碳水化合物被降解成为了可发酵的可溶性糖，还有61.9％的总糖仍然以纤维素和半纤维素的形式存在于烟草废弃物中。同时，粘稠度从15527cP降低到了957cP，为高效的进行高浓度固体含量的同步糖化发酵创造了条件。同时，从释放的还原糖浓度和糖化率来看，果胶酶加纤维素酶的组合也为最高，达到了46.8g/L。与之相比，只加纤维素酶的实验组只在其所释放的还原糖浓度中排名第二，而且在降低粘稠度方面也并不尽人意，只降低了43％。而只加果胶酶的组在降低粘稠度方面位居第二，但是在释放还原糖和提高糖化率方面和其它两组差距很大。这些结果说明了，要降低烟草废弃物的粘稠度和提高其糖化率，需要纤维素酶和果胶酶的共同作用，纤维素酶主要作用在于提高糖化率，而果胶酶的作用主要在于降低粘稠度。同时，降低粘稠度也有利于提高底物的纤维素酶可接触性，进一步的提高了糖化率和还原糖释放量。因此，优选使用果胶酶加纤维素酶协同作用进行烟草废弃物的液化。

②对同步糖化发酵条件进行优化，发酵温度设置为40℃，pH为5.5，发酵时间60h，0.5vvm的通气量时得到了最大的最终L-型乳酸浓度，为125.2g/L。这是目前米根霉同步糖化发酵生产L-型乳酸的相关报道中获得的最高最终乳酸浓度。

③为了确定米根霉能够利用烟草废弃物生产多少L-型乳酸，使用前述得到的最优条件进行物料平衡测试。如图10所示，1000g干重的烟草废弃物能够生产359g的L-型乳酸和54.8g的菌体蛋白。菌体蛋白是一种高附加值的发酵副产物，能够用于动物饲料的制作和几丁质的提取，能够降低生产成本。由于烟草废弃物中纤维素加半纤维素的比例为44.6％，可算出烟草废弃物中纤维 素物质的L-型乳酸转化率为80.4％。这个结果证明了工业化利用烟草废弃物生产L-型乳酸的巨大潜力。

实施例6对比有无液化步骤对米根霉发酵过程的影响

参照实施例5，为了验证液化步骤对高浓度固体同步糖化发酵的影响，液化后的固体C(图11A)和未被液化的固体C(图11B)被分别用于米根霉的L-型乳酸的同步糖化发酵，每隔一段时间取出发酵液，测试其葡萄糖、木糖和L-型乳酸的浓度。相比于传统的未液化的底物发酵模式，液化后的同步糖化发酵缩短了50.0％的发酵时间(96h vs.48h)和提高了66.2％(37.3g/L vs.62.0g/L)的L-型乳酸最终浓度，对应乳酸生产速率提升了65％(0.35g/L vs.1.00g/L)。另一方面，使用液化处理的底物的发酵组几乎没有木糖和葡萄糖的累积；相反的，不使用液化的对照组有超过40g/L的葡萄糖和20g/L的木糖直到发酵结束都没有被使用，显示了在高固体含量的同步糖化发酵中，液化步骤能够有效的提高米根霉利用葡萄糖和木糖的的效率，这个可能和液化后的烟草废弃物有更低的粘稠度和更高的搅拌效率有关，提高了发酵液中的溶氧度。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.米根霉种子培养基，其特征在于，所述种子培养基为添加了葡萄糖和维生素C的烟草废弃物萃取液，所述烟草废弃物萃取液为烟草废弃物水提取液。

2.根据权利要求1所述的米根霉种子培养基，其特征在于，所述烟草废弃物先经过预处理再进行水提取，所述预处理选自稀酸预处理、蒸汽爆破预处理和氧化预处理中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的米根霉种子培养基，其特征在于，所述葡萄糖与烟草废弃物萃取液的比例为0-15g：1L。

4.根据权利要求1所述的米根霉种子培养基，其特征在于，所述维生素C与烟草废弃物萃取液的比例为0-0.2g：1L。

5.米根霉菌体，其特征在于，所述米根霉菌体是由米根霉孢子经权利要求1-4任一项所述的米根霉种子培养基培养所得。

6.利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，其特征在于，包括如下进行的步骤：

(1)液化

取烟草废弃物，加入纤维素酶和果胶酶进行液化，得液化底物；

(2)同步糖化发酵

取步骤(1)所得液化底物，灭菌后，加入纤维素酶和权利要求5所述的米根霉菌体，进行同步糖化发酵，得L-型乳酸。

7.根据权利要求6所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，其特征在于，所述米根霉为固定化米根霉。

8.根据权利要求6所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，其特征在于，所述烟草废弃物先经过预处理再加入纤维素酶和果胶酶进行液化，所述预处理选自稀酸预处理、蒸汽爆破预处理和氧化预处理中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，其特征在于，所述烟草废弃物先经过预处理，再进行水提取，水提取后的剩余固体干燥后再加入纤维素酶和果胶酶进行液化。

10.根据权利要求6所述的利用烟草废弃物生产高浓度L-型乳酸的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，同步糖化发酵的温度为25-40℃。