CN104805136B - 一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，一种方式是液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，然后接种于木质纤维素原料的酶解液中，黑曲霉把酶解液中的葡萄糖转化为柠檬酸；另一种方式是先液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，再接种于含有一定固体含量的木质纤维素的发酵罐中，同时加入纤维素酶，纤维素酶把纤维素酶解为葡萄糖的同时，由黑曲霉将生成的糖同步发酵为柠檬酸。本发明以木质纤维素为原料生产柠檬酸，过程简单，成本低廉，特别是以木质纤维素为原料，具有广阔的应用和发展前景。

Description

一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法
【技术领域】
本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是利用玉米秸秆等木质纤维素原料经过分步糖化与发酵或者同步糖化与发酵的方式生产柠檬酸。
【背景技术】
柠檬酸，又名枸橼酸，是生命体主要代谢产物之一。广泛用于食品、医药、化工等各个领域，是重要的有机酸之一。当前世界上90％以上的柠檬酸都是通过黑曲霉发酵生产的。我国柠檬酸生产的主要原料包括淀粉、葡萄糖、玉米粉、稻米粉、木薯粉等，现在工业化生产大都选用薯干、玉米粉为原料，而欧美等国家则采用葡萄糖，淀粉等精料进行发酵。在柠檬酸发酵过程中，黑曲霉需要大量的糖作为生长和发酵的碳源。所以，利用传统的原料发酵柠檬酸，需要消耗大量的粮食。
秸秆等木质纤维素是最丰富的可再生碳水化合物资源，主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中可发酵性的纤维素和半纤维素约占秸秆干重的一半以上。而且我国的秸秆资源丰富，秸秆年产量约为7亿吨，但是由于缺乏合理的利用模式，这些秸秆通常被就地焚烧掉，从而造成了巨大的环境污染和交通安全。因此，利用储量丰富、价格低廉的的秸秆发酵柠檬酸，可显著降低柠檬酸生产成本，也减少了焚烧秸秆带来的环境和交通安全问题。
上世纪70-80年代，我国筛选了利用淀粉、木薯、葡萄糖母液、蜜糖等原料的黑曲霉菌株，并且已经获得比较可观的发酵结果。上海工业微生物研究所从土壤中经酸性平板分离获得的野生黑曲霉628作为出发菌株，经多次Co-γ射线和硫酸二乙脂等复合诱变，获得了高产柠檬酸菌株Co827(即黑曲霉Aspergillus niger M288)。该菌株可直接利用薯干粉发酵，产酸达12-13％，平均转化率为95％，发酵周期54-64h，发酵指数1.8-2.0kg/(m3.h)。朱亨政等利用Co-γ射线反复处理黑曲霉Co827，获得变异株黑曲霉Co8-60-7。经过连续5批6m3发酵罐中间试验，Co8-60-7平均产酸为19.05％，转化率为95％，发酵周期117.8h，生产产酸稳定在18％以上，发酵周期79h，转化率97.2％。
但是利用木质纤维素为原料的柠檬酸发酵还处于研究的初级阶段。发酵结果与以淀粉、木薯为底物的结果大相径庭。张建安等人(微生物学杂志，2001，21(3)，5-8)以麦草纤维素酶解液为原料，利用黑曲霉(Aspergillus niger Van Tieghem)发酵柠檬酸，发酵周期为104h，获得柠檬酸10.52g/L，糖转化率为60.80％。Gurpreet Singh Dhillon等(Biochemical Engineering Journal54(2011)83-92)利用黑曲霉(Aspergillus nigerNRRL567)在苹果渣超滤沉淀物-1(APS-1、悬浮颗粒45±5g/l)、苹果渣超滤沉淀物-2(APS-2、悬浮颗粒80g/l)、乳清(LS)、市政污泥(MSS)、淀粉工业水(SIW)中，筛选了最适合用于深层发酵的底物为APS-1，经3％乙醇诱导后，获得柠檬酸产量为18.2±0.4g/L。由于柠檬酸产量较低，所以，该工艺不具备产业化的前提。
因此，选择合适的木质纤维素原料为柠檬酸发酵的底物，获得高产量和高得率的柠檬酸是利用木质纤维素发酵柠檬酸工艺产业化的关键因素。本发明以秸秆等木质纤维素为原料，液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，接种于含有较高糖浓度的木质纤维素酶解液中发酵生产柠檬酸或者接种于含有一定固体含量的木质纤维素的反应器中，并加入纤维素酶进行同步糖化与发酵生产柠檬酸。
【发明内容】
本发明目的在于拓展工业用柠檬酸发酵的发酵基质，使用价格低廉、资源丰富的木质纤维素，提供一种利用木质纤维素水解液发酵生产柠檬酸的方法。
本发明的构思：以木质纤维素为原料低成本高效生产柠檬酸；使用黑曲霉Aspergillus niger M288作为发酵菌种，黑曲霉Aspergillus niger M288购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；需要高浓度糖作为发酵的碳源；以农业残留玉米秸秆为原料，经预处理、脱毒后作为培养基；液体培养获得作为种子的细胞，接种于木质纤维素酶解液或同步糖化与发酵体系中，黑曲霉Aspergillus niger M288把纤维素降解得到的葡萄糖转化为柠檬酸。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
(1)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理：
取干基玉米秸秆，按2∶1的固液比(w/w)加入质量浓度为5％(w/w)的稀硫酸，搅拌均匀后，将玉米秸秆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为190℃、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用；
预处理方法包括但不限于稀酸预处理，蒸汽爆破，氨纤维爆破、液氨膨爆、亚硫酸盐预处理、碱法预处理、机械磨碎预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理方法；木质纤维素原料经过了预处理，使木质纤维素的结构得到改变，提高其可酶解性。
所述的木质纤维素原料包括玉米秸秆、麦秸、稻草、棉杆、玉米芯及其残渣、木屑、能源植物或者林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物等。
(2)预处理后木质纤维素原料的脱毒处理
固态生物脱毒的具体过程为：将静置培养3天的脱毒菌种Amorphotheca resinaeZN1，其保藏编号CGMCC7452，斜面接入盛有200g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸秆的生物脱毒反应器中，维持25℃、60％的湿度进行脱毒共培养3天；将上述脱毒共培养的200g秸秆接入盛有2000g稀酸预处理后且pH调整至4.8-5.5的玉米秸秆的生物脱毒反应器中，维持25℃、60％的湿度进行脱毒共培养10-12天；脱毒后将物料保存于-20℃冰箱中待用；
脱毒处理方法包括但不限于生物脱毒、水洗、过碱化处理(Overliming)、离子吸附、减压蒸馏、活性炭脱色等，优选生物脱毒；经脱毒脱除的抑制物包括甲酸、乙酸等有机酸类化合物，糠醛、羟甲基糠醛等呋喃类化合物，香兰素、对羟基苯甲醛等酚类化合物等。
(3)利用液体培养基培养黑曲霉Aspergillus niger M288
黑曲霉Asperillus niger M288种子在20-50℃，50-800rpm的条件下培养。种子培养基的成分为葡萄糖50-100g/L，氯化铵1.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.0-4.0g/L，七水合硫酸镁0.1-0.5g/L，五水合硫酸铜0.1-0.5mg/L，七水合硫酸锌0.1-5.0mg/L，七水合硫酸亚铁1.0-10.0mg/L，氯化锰1.0-5.0mg/L；
所述柠檬酸的生产菌株为黑曲霉Aspergillus niger M288，黑曲霉Aspergillusniger M288购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心；但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产柠檬酸的其他菌种，如黑曲霉Asperillus Niger M203、黑曲霉Aspergillus niger M228等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。
(4)柠檬酸的生产
利用分别糖化与发酵柠檬酸的方式，糖化液的制备条件为：固体含量为10-40％，酶量为5-30FPU/g DM，温度为45-55℃，pH为4.5-5.5，糖化36-60小时，然后进行离心或压滤等方法获得水解液；利用糖化液进行柠檬酸生产的条件为：初始pH为2.0-6.0，菌种转接量为5-20％(体积百分比)，在25-40℃，50-800rpm发酵100-216小时，生产柠檬酸。柠檬酸生产中的营养物为：氯化铵0.5-4.0g/L，磷酸二氢钾1.0-4.0g/L，七水合硫酸镁0-0.5g/L，五水合硫酸铜0-0.5mg/L，七水合硫酸锌0-2.5mg/L，七水合硫酸亚铁0-10.0mg/L，氯化锰0-5.0mg/L。
或者利用木质纤维素同步糖化发酵柠檬酸，其条件为：初始pH为2.0-6.0，菌种转接量为5-20％(体积百分比)，固体含量为10-40％，酶量为5-30FPU/gDM，通气量为0.1-10vvm，在30-50℃，50-800rpm发酵100-216小时，生产柠檬酸。同步糖化与发酵中所需的营养物为：氯化铵0.5-4.0g/L，磷酸二氢钾1.0-4.0g/L，七水合硫酸镁0-0.5g/L，五水合硫酸铜0-0.5mg/L，七水合硫酸锌0-2.5mg/L，七水合硫酸亚铁0-10.0mg/L，氯化锰0-5.0mg/L。
(5)柠檬酸产品的分离提取
包括固液分离、沉淀提纯、硫酸溶解、离子交换、浓缩结晶步骤，即可得到结晶状的柠檬酸。
与现有技术相比，本发明的积极效果是：
(1)本发明以木质纤维素为原料发酵生产柠檬酸，基质成本低廉，来源广泛，充分利用了可再生资源，“不与人类争粮，不与粮争地”，能够满足柠檬酸不断扩大的市场需求；
(2)本发明在发酵过程几乎不需添加额外的碳源，成本低，柠檬酸浓度和产率高，便于后续分离和纯化；
【附图说明】
图1实施例1发酵过程曲线；
图2实施例2发酵过程曲线。
【具体实施方式】
以下提供本发明一种木质纤维素水解液发酵生产高浓度柠檬酸的具体实施方式。
实施例1
烘干的玉米秸秆与5％的稀硫酸溶液以2∶1的质量比混合均匀，然后于190℃、1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0，加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZN1(其保藏编号CGMCC7452)，25℃固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25％，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50℃，pH4.8的条件下糖化48h；然后离心得到的上清液即为秸秆酶解液。向酶解液中加入2.5g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，七水合硫酸锌1.1mg/L，七水合硫酸亚铁6.5mg/L，氯化锰3.6mg/L，并以10％的接种量接入培养好的黑曲霉Aspergillus niger M288(购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)，于33℃、200rpm的条件下发酵168小时。水解液中的初糖浓度为89.89g/L，最终柠檬酸浓度为58.04g/L，柠檬酸得率为64.56g/g葡萄糖。
实施例2
烘干的玉米秸秆与5％的稀硫酸溶液以2∶1的质量比混合均匀，然后于190℃、1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0，加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZN1(其保藏编号CGMCC7452)，25℃固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25％，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50℃，pH4.8的条件下糖化48h；然后离心得到的上清液即为秸秆酶解液。向酶解液中加入1.0g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，七水合硫酸锌1.1mg/L，七水合硫酸亚铁6.5mg/L，氯化锰3.6mg/L，并以10％的接种量接入培养好的黑曲霉Aspergillus niger M288(购自上海市工业微生物研究所菌种保藏中心)，用5M氢氧化钠调整初始pH值至6.0，于33℃、200rpm的条件下发酵216小时。水解液中的初糖浓度为107.55g/L，最终柠檬酸浓度为92.37g/L，柠檬酸得率为85.88g/g葡萄糖。
本发明所涉及的纤维质原料不限于玉米秸秆，还可以为麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物中的一种；木质纤维素处理物选自采用稀酸、蒸汽膨爆、液氨膨爆、生物法预处理后的麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物、废纸，纸板，建筑和拆迁木材废料和庭院废物中的一种。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，其方法为：
烘干的玉米秸秆与5％的稀硫酸溶液以2:1的质量比混合均匀，然后于190℃、1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0，加入生物脱毒所用菌种Amorphothecaresinae ZN1，其保藏编号CGMCC7452，25℃固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25％，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50℃，pH 4.8的条件下糖化48h；然后离心得到的上清液即为秸秆酶解液；向酶解液中加入2.5g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，七水合硫酸锌1.1mg/L，七水合硫酸亚铁6.5mg/L，氯化锰3.6mg/L，并以10％的接种量接入培养好的黑曲霉Aspergillus nigerM288，于33℃、200rpm的条件下发酵168小时；水解液中的初糖浓度为89.89g/L，最终柠檬酸浓度为58.04g/L，柠檬酸得率为64.56g/g葡萄糖。
2.一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，其特征在于，其方法为：
烘干的玉米秸秆与5％的稀硫酸溶液以2:1的质量比混合均匀，然后于190℃、1.2MPa的条件下预处理3分钟；预处理后物料调节pH至5.0，加入生物脱毒所用菌种Amorphothecaresinae ZN1，其保藏编号CGMCC7452，25℃固态脱毒10天；将脱毒后的物料加入发酵罐中，调整固含量为25％，纤维素酶用量为15FPU/克干固体，在50℃，pH 4.8的条件下糖化48h；然后离心得到的上清液即为秸秆酶解液；向酶解液中加入1.0g/L氯化铵，磷酸二氢钾2.5g/L，七水合硫酸镁0.25g/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，七水合硫酸锌1.1mg/L，七水合硫酸亚铁6.5mg/L，氯化锰3.6mg/L，并以10％的接种量接入培养好的黑曲霉AspergillusnigerM288，用5M氢氧化钠调整初始pH值至6.0，于33℃、200rpm的条件下发酵216小时；水解液中的初糖浓度为107.55g/L，最终柠檬酸浓度为92.37g/L，柠檬酸得率为85.88g/g葡萄糖。
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