CN109735578B - 一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，由秸秆原料预处理步骤、发酵纤维素酶浆液的制备步骤、纤维素酶水解混合物生产步骤、秸秆酶解糖液制备步骤、柠檬酸料液发酵步骤、柠檬酸纯化步骤组成。本发明具有以下有益效果：经过机械破碎再进行稀酸处理的纤维素浆液不需要脱毒处理步骤，大大减少了生产柠檬酸的时间成本和生产成本及效率；本方法不需要添加纤维素酶，用发酵纤维素酶浆液替换纤维素酶，发酵纤维素酶浆液包含的纤维素酶50％‑60％，比外购的纤维素酶的成本大大减少。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域中的柠檬酸的生产方法，具体涉及一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法。
背景技术
柠檬酸是一种用途广泛且生产量极大的化工原料，我国主要利用黑曲霉通过薯干粉、淀粉等粮食原料生产，因此成本比较高。近年来，人们正致力于开发多种多样的代替粮食原料的方法发酵生产柠檬酸。
我国是农业大国，秸秆资源十分丰富，农业秸秆是自然界中储量丰富的可再生资源，我国年产量高达7亿多吨。长期以来，这些资源未得到合理利用，除少量用作饲料、造纸外，其余多被焚烧，浪费了资源，污染了环境。农作物秸秆主要的成分中的纤维素和半纤维素降解以后分别可以得到葡萄糖和其他单糖和寡糖，如果能将这些糖类应用于发酵生产，将给秸秆的利用开辟一条新的利用途径。曾有人提出“以秸秆为原料生产柠檬酸的方法(CN1129739A)”，为秸秆的利用开辟了一条新路，但该专利发酵用纤维素酶是外购的，增加了生产成本，常规钙盐法提取柠檬，产酸率低，对环境破坏严重，不符合绿色发展理念。
专利号201410035236.9，公开了一种利用木质纤维素原料生产柠檬酸的方法，一种方式是液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，然后接种于木质纤维素原料的酶解液中，黑曲霉把酶解液中的葡萄糖转化为柠檬酸；另一种方式是先液体培养黑曲霉Aspergillus niger M288，再接种于含有一定固体含量的木质纤维素的发酵罐中，同时加入纤维素酶，纤维素酶把纤维素酶解为葡萄糖的同时，由黑曲霉将生成的糖同步发酵为柠檬酸。该发明以木质纤维素为原料生产柠檬酸，过程简单，成本低廉，特别是以木质纤维素为原料，具有广阔的应用和发展前景。但该专利(1)额外加纤维素酶增加了发酵成本，不利于秸秆的有效利用和效益最大化；(2)预处理过程中没有机械破碎过程，降低了预处理的接触面积，增加聚合度；(3)固态生物脱毒过程持续时间太长，大大拉长发酵周期，不利于产业化推广。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，由由秸秆原料预处理步骤、发酵纤维素酶浆液的制备步骤、纤维素酶水解混合物生产步骤、秸秆酶解糖液制备步骤、柠檬酸料液发酵步骤、柠檬酸纯化步骤组成。
优选的，秸秆原料预处理步骤具体为：秸秆原料预处理；秸秆经粉碎、稀酸预处理工艺制得纤维素浆液；
具体地，所述秸秆原料预处理步骤中，秸秆经粉碎机粉碎，秸秆长度3-5cm 粉碎完成；将粉碎后的秸秆加入稀酸得到纤维素浆液，所述秸秆和稀酸的质量体积比1:4-1:8，所述的稀酸浓度0.63-0.82％；秸秆在稀酸预处理的PH值为 2.1-2.4，反应温度150-190℃，反应时间3-4min。
具体地，稀酸可以是硫酸、盐酸、乙酸、碳酸、硝酸。
具体地，纤维素浆液固液比为1：3-3.7(m/V)。
优选的，发酵纤维素酶浆液制备步骤具体为：按重量百分比计，在粉碎的玉米秸秆中加1.6-2.0倍的水调浆，然后添加磷酸二氢钾0.20-0.25％、硫酸铵 0.90-1.20％、蔗糖0.45-0.5％进行混合，调PH值在5.6-6.2，再加入黑曲霉，通风量0.17-0.2VVM，在30±1℃发酵8-10小时得发酵纤维素酶浆液。
优选的，纤维素酶水解混合物生产步骤具体为：按重量百分比计，以所述纤维素浆液为底物，添加所述发酵纤维素酶浆液，添加量11.5％，在温度 48-55℃，PH值4.8-5.2条件下反应40-50h，得到纤维素酶水解混合物。
优选的，秸秆酶解糖液制备步骤具体为：按重量百分比计，往所述纤维素酶水解混合物中投入3-6倍的秸秆，在温度30-40℃、PH值5.8-6.2、压力 0.06-0.09MPa发酵50-60h，秸秆酶解糖液制备完成。
优选的，柠檬酸料液发酵步骤具体为：将所述的秸秆酶解糖液投入100m3发酵罐，通蒸汽实消至95-100℃，保温保压30-40分钟后，关闭蒸汽通风，通风量400-600m3/h，开冷却水降温至37℃，然后以体积百分比10％接种量接入黑曲霉种子液，在温度36±1℃、PH值5.8-6.2、压力0.06-0.09MPa进行发酵，在还原糖含量低于0.5％(W/V)后，柠檬酸料液发酵结束。
优选的，秸秆可以为玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、甘蔗秸秆、花生壳、玉米芯。
本方法是将预处理的秸秆加入黑曲霉，黑曲霉可以是黑曲霉菌株或者黑曲霉种子液或者黑曲霉孢子悬浮液，在配料中添加磷酸二氢钾、硫酸铵等，用黑曲霉发酵产生纤维素酶解液，再加入预处理后的纤维素浆液，利用纤维素酶的作用，破坏秸秆的细胞壁，释放其中的淀粉、蛋白质，再用淀粉酶水解淀粉作为发酵碳源，用蛋白质作为发酵氮源，淀粉酶将释放出来的淀粉水解成葡萄糖，再利用黑曲霉通过液态发酵法生产柠檬酸。
本发明具备以下有益效果：
(1)经过机械破碎再进行稀酸处理的纤维素浆液不需要脱毒处理步骤，大大减少了生产柠檬酸的时间成本和生产成本及效率；
(2)本方法不需要添加纤维素酶，用发酵纤维素酶浆液替换纤维素酶，发酵纤维素酶浆液包含的纤维素酶50％-60％，用发酵纤维素酶浆液比外购的纤维素酶的成本大大减少；
(3)本方法相比现有技术，主要利用秸秆和黑曲霉，利用的辅料很少，充分利用秸秆资源十分丰富、可再生的特点。
(4)本方法相比现有技术，成本和时间都大大降低，柠檬酸产率提高。
附图说明
图1为本发明的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，由秸秆原料预处理步骤、发酵纤维素酶浆液的制备步骤、纤维素酶水解混合物生产步骤、秸秆酶解糖液制备步骤、柠檬酸料液发酵步骤、柠檬酸纯化步骤组成。
本方法不需要脱毒处理步骤，大大减少了生产柠檬酸的时间成本和生产成本及效率，相比现有技术，成本和时间都大大降低，柠檬酸产率提高。
实施例二
如图1所示，一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，包括：
S01秸秆原料预处理步骤：秸秆经粉碎、稀酸预处理工艺制得纤维素浆液；
具体地，秸秆经粉碎机粉碎，秸秆长度3-5cm粉碎完成；将粉碎后的秸秆加入稀酸得到纤维素浆液，所述秸秆和稀酸的质量体积比1:4-1:8(可取1:4、 1:5、1:6、1:7、1:8)，所述的稀酸浓度0.63-0.82％(可取0.63％、0.68％、0.72％、 0.74％、0.77％、0.82％)；秸秆在稀酸预处理的PH值为2.1-2.4，反应温度 150-190℃(可取150℃、160℃、170℃、180℃、190℃)，反应时间3-4min。
具体地，稀酸可以是硫酸、盐酸、乙酸、碳酸、硝酸。
具体地，纤维素浆液固液比为1：3-3.7(m/V)，固液比可取1：3，1： 3.2、1：3.5、1：3.7。
经过机械破碎再进行稀酸处理的纤维素浆液不需要脱毒处理步骤，大大减少了生产柠檬酸的时间成本和生产成本及效率。
S02发酵纤维素酶浆液的制备步骤：按重量百分比计，在粉碎的秸秆中加 1.6-2.0倍的水调浆，然后添加磷酸二氢钾0.20-0.25％(可取0.20％、0.21％、 0.22％、0.23％、0.24％、0.25％)、硫酸铵0.90-1.20％(可取0.90％、1.0％、 1.20％)、蔗糖0.45-0.5％(可取0.45％、0.46％、0.47％、0.48％、0.49％、0.50％) 进行混合，调PH值在5.6-6.2(可取5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2)，再加入黑曲霉，通风量0.17-0.2VVM(可取0.17VVM、0.18VVM、0.19VVM、 0.2VVM)，在30±1℃发酵8-10小时(可取8小时、9小时、10小时)得发酵纤维素酶浆液。
上述VVM表示立方米/(立方米*分钟)，不需要添加纤维素酶，用发酵纤维素酶浆液替换纤维素酶，发酵纤维素酶浆液包含的纤维素酶50％-60％，比外购的纤维素酶的成本大大减少；
黑曲霉可以用商购的黑曲霉菌种或者黑曲霉种子液或者黑曲霉孢子悬浮液，黑曲霉菌种可以是上海工业微生物研究所的Co827，黑曲霉也可以是利用Co827按照如下方法培养获得：
(1)土豆汁制备：马铃薯200g，水1000mL，将马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤取得土豆滤液，加入20％蔗糖煮沸，冷却后待用，土豆汁制备完成；
(2)平板培养基：所述土豆汁加入2％琼脂，121℃灭菌30min后，冷却到40-50℃后在超净工作台上倒平板，冷却后待用；斜面培养基同上；
(3)取Φ20×200mm试管四支，试管内装9mL蒸馏水，500mL三角瓶1 个，三角瓶内装30ml蒸馏水，20—30个玻璃珠，灭菌40—60分钟；
(4)用无菌操作法从黑曲霉菌种斜面上取一接种环孢子于三角瓶内，用振荡法振荡15—20分钟；
(5)用1mL灭菌细管吸取振荡后的孢子液1mL于上述灭菌试管中，用手摇匀，连续稀释2—3支，稀释液制备完成；
(6)吸取稀释液0.05—0.1mL于空白培养皿中，用玻璃棒涂匀，用牛皮纸包好放入培养室，培养2—3天；
(7)从生长好的培养皿中，选取长势好的单菌落于试管斜面中，放入培养室培养4—5天；
(8)取斜面孢子进行摇床鉴定，鉴定产酸10％以上，菌球生长良好后，用于发酵纤维素酶浆液制备。
黑曲霉还可以是利用如下步骤获得：取生产用黑曲霉菌种(用试管斜面培养基保藏于冰箱)制作孢子悬液，在无菌环境下用稀释法将菌种悬液稀释，然后用吸管或是移液枪转移到制作好的空白培养皿中(平板)，保证每个培养皿中单个孢子数在7-10个左右，在适宜的条件下培养，培养完成后挑选形态好的菌落转移到空白试管培养基中(试管斜面)培养，试管斜面培养完成后进行摇瓶鉴定，鉴定产酸10％以上，菌球生长良好后，用于发酵纤维素酶浆液制备。培养基都是本领域技术人员公知的黑曲霉培养基。
上述两种方法获得的黑曲霉，产纤维素酶活性较高。
S03纤维素酶水解混合物生产步骤：按重量百分比计，以所述纤维素浆液为底物，添加所述发酵纤维素酶浆液，添加量11.5％，在温度48-55℃(可取 48℃、50℃、52℃、55℃)，PH值4.8-5.2(可取4.8、4.9、5.0、5.1、5.2) 条件下反应40-50h(可取40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、 49h、50h)，得到纤维素酶水解混合物。
纤维素酶解得到葡萄糖、纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、乙酸、糠醛、羟甲基糠醛等混合物；其中，葡萄糖70-73g/L、纤维二糖4.4-4.6g/L、木糖4.0-4.3 g/L、阿拉伯糖0.28-0.42g/L、乙酸8.26-8.45g/L、糠醛0.88-0.98g/L、羟甲基糠醛0.40-0.45g/L。
根据发酵纤维素酶浆液中纤维素酶的活性，大量试验研究发现纤维素酶浆液的添加量为11.5％，提高葡萄糖、纤维二糖转化率大于80％。
S04秸秆酶解糖液制备步骤：按重量百分比计，往所述纤维素酶水解混合物中投入3-6倍(可取3倍、4倍、5倍、6倍)的秸秆，在温度30-40℃(可取30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃)、 PH值5.8-6.2(可取4.8、4.9、5.0、5.1、5.2)、压力0.06-0.09MPa(可取0.06MPa、 0.07MPa、0.08MPa、0.09MPa)发酵50-60h(可取50h、51h、52h、53h、54h、 55h、56h、57h、58h、59h、60h)，秸秆酶解糖液制备完成。
S05柠檬酸料液发酵步骤：将所述的秸秆酶解糖液投入100m3发酵罐，通蒸汽实消至95-100℃(可取95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃)，保温保压30-40分钟(可取30分钟、31分钟、32分钟……39分钟、40分钟)后，关闭蒸汽通风，通风量400-600m3/h(可取400m3/h、450m3/h、500m3/h、550m3/h、 600m3/h)，开冷却水降温至37℃，然后以体积百分比10％接种量接入黑曲霉种子液，在温度36±1℃、PH值5.8-6.2(可取4.8、4.9、5.0、5.1、5.2)、压力0.06-0.09MPa(可取0.06MPa、0.07MPa、0.08MPa、0.09MPa)进行发酵，在还原糖含量低于0.5％(W/V)后，柠檬酸料液发酵结束。
具体地，柠檬酸料液发酵步骤中，黑曲霉种子液接种后0.5-1h后测总糖，发酵过程中用0.1429mol/L氢氧化钠溶液滴定测产酸量，发酵50小时开始测还原糖。
黑曲霉种子液可以采用先用公开文献中记载的黑曲霉种子液，如申请号201310275581.5公开的黑曲霉种子液，也可以采用前述黑曲霉利用本领域技术人员已知的方法用公知的黑曲霉种子培养基制备获得，也可将前述黑曲霉接种到前述斜面培养基中进行培养，得到黑曲霉种子液。
整个发酵周期小于60h，提高发酵液的转化率80％以上。
S06柠檬酸纯化步骤，柠檬酸纯化步骤可以采用现有技术，柠檬酸纯化也可以采用如下步骤：发酵后的柠檬酸料液，经板式换热器杀菌，控制温度在 70-80℃，杀菌后经板框压滤机过滤，得发酵液清液，然后经膜过滤设备精密过滤得到浊度小于5NTU的清液，清液经MVR系统浓缩清液酸度至50-60％，经法国诺华赛色谱处理系统得到酸度为25-30％的高纯度料液，经碳柱脱色透光率98％以上，经全自动离交系统后的离交液钠离子≤3mg/kg，氯离子≤3mg/kg，所述离交液再经密闭浓缩、结晶、离心、烘干，既得柠檬酸。
上述秸秆可以为玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、甘蔗秸秆、花生壳、玉米芯。
本方法相比现有技术，主要利用秸秆和黑曲霉，利用的辅料很少，充分利用秸秆资源十分丰富、可再生的特点，成本和时间都大大降低，生产的柠檬酸质量高、产率高。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (2)
1.一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，特征在于：由秸秆原料预处理步骤、发酵纤维素酶浆液的制备步骤、纤维素酶水解混合物生产步骤、秸秆酶解糖液制备步骤、柠檬酸料液发酵步骤、柠檬酸纯化步骤组成；其具体步骤为：
S01步骤，秸秆原料预处理：秸秆经粉碎机粉碎，秸秆长度3-5cm粉碎完成；将粉碎后的秸秆加入稀酸得到纤维素浆液，所述秸秆和稀酸的质量体积比1:4-1:8，所述的稀酸浓度0.63-0.82％；秸秆在稀酸预处理的pH值为2.1-2.4，反应温度150-180℃，反应时间3-4min，制得纤维素浆液，所述纤维素浆液固液比为1:3-3.7(m/V)；所述稀酸是硫酸、盐酸、乙酸、碳酸、硝酸；
S02步骤，发酵纤维素酶浆液制备：按重量百分比计，在粉碎的秸秆中加1.6-2.0倍的水调浆，然后添加磷酸二氢钾0.20-0.25％、硫酸铵0.90-1.20％、蔗糖0.45-0.5％进行混合，调pH值在5.6-6.2，再加入黑曲霉，通风量0.17-0.2VVM，在30±1℃发酵8-10小时得发酵纤维素酶浆液；
S03步骤，纤维素酶水解混合物生产：按重量百分比计，以所述纤维素浆液为底物，添加所述发酵纤维素酶浆液，添加量11.5％，在温度48-55℃，pH值4.8-5.2条件下反应40-50h，得到纤维素酶水解混合物；
S04步骤，秸秆酶解糖液制备：按重量百分比计，往所述纤维素酶水解混合物中投入3-6倍的秸秆，在温度30-40℃、pH值5.8-6.2、压力0.06-0.09MPa发酵50-60h，秸秆酶解糖液制备完成；
S05步骤，柠檬酸料液发酵：将所述的秸秆酶解糖液投入100m3发酵罐，通蒸汽实消至95-100℃，保温保压30-40分钟后，关闭蒸汽通风，通风量400-600m3/h，开冷却水降温至37℃，然后以体积百分比10％接种量接入黑曲霉种子液，在温度36±1℃、pH值5.8-6.2、压力0.06-0.09MPa进行发酵，在还原糖含量低于0.5％(W/V)后，柠檬酸料液发酵结束。
2.根据权利要求1所述的一种黑曲霉发酵秸秆生产柠檬酸的方法，其特征在于：所述黑曲霉为商购的黑曲霉菌种或者黑曲霉种子液或者黑曲霉孢子悬浮液；
所述黑曲霉按照如下方法培养获得：
1)土豆汁制备：马铃薯200g，水1000mL，将马铃薯去皮切碎，煮烂后过滤取得土豆滤液，加入20％蔗糖煮沸，冷却后待用，土豆汁制备完成；
2)平板培养基：所述土豆汁加入2％琼脂，121℃灭菌30min后，冷却到40-50℃后在超净工作台上倒平板，冷却后待用；斜面培养基同上；
3)取Φ20×200mm试管四支，试管内装9mL蒸馏水，500mL三角瓶1 个，三角瓶内装30ml蒸馏水，20-30个玻璃珠，灭菌40-60分钟；
4)用无菌操作法从黑曲霉菌种斜面上取一接种环孢子于三角瓶内，用振荡法振荡15-20分钟；
5)用1mL灭菌细管吸取振荡后的孢子液1mL于上述灭菌试管中，用手摇匀，连续稀释2-3支，稀释液制备完成；
6)吸取稀释液0.05-0.1mL于空白培养皿中，用玻璃棒涂匀，用牛皮纸包好放入培养室，培养2-3天；
7)从生长好的培养皿中，选取长势好的单菌落于试管斜面中，放入培养室培养4-5天；
8)取斜面孢子进行摇床鉴定，鉴定产酸10％以上，菌球生长良好后，用于发酵纤维素酶浆液制备；
黑曲霉利用如下步骤获得：取生产用黑曲霉菌种制作孢子悬液，在无菌环境下用稀释法将菌种悬液稀释，然后用吸管或是移液枪转移到制作好的空白培养皿平板中，保证每个培养皿中单个孢子数在7-10个左右，在适宜的条件下培养，培养完成后挑选形态好的菌落转移到空白试管培养基中试管斜面培养，试管斜面培养完成后进行摇瓶鉴定，鉴定产酸10％以上，菌球生长良好后，用于发酵纤维素酶浆液制备。
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Denomination of invention: A method for producing citric acid from fermented straw by Aspergillus niger Effective date of registration: 20231215 Granted publication date: 20220517 Pledgee: Bank of Rizhao Co.,Ltd. Juxian sub branch Pledgor: DAZIRAN BIOLOGICAL GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2023980071960 |