CN105420291A - 利用木质纤维素生产丁醇的方法 - Google Patents

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顾春凯
刘宏娟
程可可
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Abstract

本发明提出利用木质纤维素生产丁醇的方法。所述方法包括：(1)将所述木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液；(2)利用所述水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇。本发明利用木质纤维素生产丁醇的方法能够有效地脱除木质纤维素经过酸水解处理得到的水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现木质纤维素的回收利用。

Description

利用木质纤维素生产丁醇的方法
技术领域
本发明涉及生物化工领域。具体地，本发明涉及利用木质纤维素生产丁醇的方法。
背景技术
丁醇是良好的石油替代燃料和重要的化工原料，广泛应用于食品、医药、塑料、印染等方面。与乙醇相比，丁醇具有能量密度高，腐蚀性低，可以任意比例与汽油互溶，对现有的发动机和输油管道无需改造而直接利用等优点，因而更具应用潜力。
木质纤维素作为自然界中来源最为广泛，价格极为低廉，且能再生的绿色资源，木质纤维素经过预处理后，能够降解为含有多种能够被利用的糖类的水解液，再利用生物转化方法，如微发酵过程，将产生的糖类转化成生物燃料，作为生产丁醇的原料。
然而，目前利用木质纤维素生产丁醇的方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供利用木质纤维素生产丁醇的方法。该方法能够有效地脱除木质纤维素经过酸水解处理得到的水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现木质纤维素的回收利用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
产丁醇梭菌本身缺乏分解纤维素的酶类，不能直接利用木质纤维素。由于纤维素酶的骨架蛋白架蛋白相对复杂，需要多种酶的协同作用才能完成降解纤维素，所以通过基因工程手段引入异源纤维素酶的基因，容易使异源酶在产丁醇梭菌中的表达“失速”，还会影响细胞本身总体的蛋白分泌，进而导致细胞死亡。添加纤维素酶，能够对木质纤维素进行酶解处理，但是其成本较高。相比于条件温和的酶解处理，酸或碱水解处理效率较高，尤其是酸处理。然而，酸处理过程中形成的单糖会进一步降解，产生抑制物，如糠醛、5-羟甲基糠醛和乙酸等，这些抑制物直接或间接抑制产丁醇梭菌生长及发酵。因此，需要对酸水解处理得到的水解液进行脱毒处理。然而，采用物理法(真空蒸发等)或化学法(活性炭吸附、离子交换树脂吸附、沉淀等)对设备和工艺要求较高，成本也相应增加，甚至超过直接利用淀粉类物质的成本，从而限制了木质纤维素作为丁醇发酵的原料。
本发明的发明人经过大量实验发现，将木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液，利用酵母菌能够代谢水解液中抑制物的特性，将酵母菌接种于水解液中进行发酵处理，有效地脱除水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，得到脱毒水解液，然后将产丁醇梭菌接种于脱毒水解液中进行发酵处理，产生丁醇。
本发明提出了一种利用木质纤维素生产丁醇的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)将所述木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液；(2)利用所述水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇。根据本发明的优选实施例，所述酵母菌为粘红酵母。由此，根据本发明实施例的方法能够有效地脱除水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛，同时降低了乙酸浓度，从而使产丁醇梭菌能够利用该水解液进行发酵处理，得到丁醇，以实现木质纤维素的回收利用。
根据本发明的实施例，上述利用木质纤维素生产丁醇的方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述产丁醇梭菌选自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，优选丙酮丁醇梭菌。
根据本发明的实施例，所述木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
根据本发明的实施例，所述酸水解处理包括：将所述木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及将所述混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，根据本发明的具体示例，所述酸溶液包括0.5质量体积％H2SO4和1.5质量体积％H3PO4。由此，能够有效地将木质纤维素降解为糖类，同时使较少的糖类进一步降解为抑制物。
根据本发明的实施例，将所述混合物在135摄氏度的温度下进行酸水解处理1小时，得到水解液。由此，能够有效地将木质纤维素降解为糖类，同时使较少的糖类进一步降解为抑制物。
根据本发明的实施例，所述酵母菌的接种量为5～10体积％，所述发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时，根据本发明的优选实施例，所述酵母菌的接种量为5体积％。由此，能够使酵母菌充分脱除水解液中的抑制物。
根据本发明的实施例，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止所述第一发酵处理。由此，能够使酵母菌充分脱除水解液中的抑制物。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将所述第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将所述第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到所述脱毒水解液。由此，能够有效地除去酵母菌。
根据本发明的实施例，将产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于所述脱毒水解液中。由此，能够使产丁醇梭菌充分脱毒水解液生产丁醇。
根据本发明的实施例，所述产丁醇梭菌预先经过活化处理，所述活化处理包括：(1)将保存于-80摄氏度的所述产丁醇梭菌接种于玉米培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到一级种子液；以及(2)将所述一级种子液按照5～10体积％的接种量接种于P2培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到二级种子液。由此，能够使产丁醇梭菌充分利用脱毒水解液生产丁醇。
根据本发明的实施例，所述玉米培养基包括玉米醪及水；所述P2培养基包括40g/L的葡萄糖、1g/L的酵母粉、1质量％缓冲液、1重量％营养液及水，所述缓冲液包括磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L，所述营养液包括1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠。由此，能够使产丁醇梭菌充分利用木质纤维素水解液生产丁醇。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提出利用木质纤维素生产丁醇的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：
(1)将木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液。
在该步骤中，通过酸水解处理降解木质纤维素，形成多种单糖，以使单糖被产丁醇梭菌利用。根据本发明的实施例，酸水解处理包括：将木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及将混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，根据本发明的具体示例，酸溶液包括0.5质量体积％H2SO4和1.5质量体积％H3PO4。根据本发明的优选实施例，将混合物在135摄氏度的温度下进行酸水解处理1小时，得到水解液。发明人经过大量实验优化得到最优酸处理条件，在此条件下能够有效地产生大量单糖，并使单糖较少地降解成抑制物。酸水解温度过高或者时间过长，会产生大量抑制物，且得到的糖含量较低；温度过低或者时间过短，降解得到的糖含量较低。
需要说明的是，本发明对木质纤维素的种类不作严格限定，只要能够将其水解，得到糖类，以供微生物利用即可。根据本发明的具体实施例，木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
(2)利用水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液。
在该步骤中，根据本发明的优选实施例，酵母菌为粘红酵母。发明人意外地发现，将粘红酵母接种于水解液中，开始时，粘红酵母主要代谢抑制物，当抑制物殆尽时再迅速代谢糖类。利用该特性能够除去水解液中的抑制物，同时糖损失较少，有效地起到脱毒的效果。根据本发明的实施例，酵母菌的接种量为5～10体积％，第一发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时。根据本发明的优选实施例，酵母菌的接种量为5体积％。发明人经过大量实验优化得到最优接种量及发酵条件。接种量过少，代谢抑制物的时间过长，接种量过多，酵母生长迅速，可能造成糖类的大量损失。发酵时间过短，不能充分代谢抑制物，导致水解液中抑制物含量较高，进而无法使产丁醇梭菌正常代谢产丁醇，甚至无法生长。发酵时间过长，酵母菌会进一步代谢糖类，造成糖损失。根据本发明的实施例，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止第一发酵处理。发明人经过大量实验发现，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，产丁醇梭菌能够利用该发酵液进行发酵生产。
根据本发明的实施例，该方法进一步包括：将第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到脱毒水解液。将发酵产物进行离心或者加热处理，能够有效地除去或杀死酵母菌。若产丁醇梭菌直接利用含有酵母菌的发酵处理产物，产丁醇梭菌会与酵母菌竞争性地生长代谢，进而影响产丁醇梭菌的代谢能力。
(3)利用脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇。
根据本发明的实施例，将产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于脱毒水解液中。发明人经过大量实验优化得到最优接种量，由此，能够有效地利用脱毒水解液进行发酵产丁醇。
需要说明的是，发明人利用多种不同种类的产丁醇梭菌分别接种于步骤(1)所得到的水解液中，产丁醇梭菌均不能生长，表明其不耐受水解液中的抑制物。然而，产丁醇梭菌能够利用步骤(2)所得到的脱毒水解液进行发酵培养，生产丁醇。本发明对于产丁醇梭菌的种类不作严格限定。具体地，产丁醇梭菌可以为丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，优选丙酮丁醇梭菌。丙酮丁醇梭菌能够较好地利用脱毒水解液中的糖类进行发酵，以得到较多地丁醇。
根据本发明的实施例，产丁醇梭菌预先经过活化处理，活化处理包括：(1)将保存于-80摄氏度的产丁醇梭菌按照10％的接种量接种于玉米培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到一级种子液；以及(2)将一级种子液按照5～10体积％的接种量接种于P2培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到二级种子液。根据本发明的具体实施例，玉米培养基包括玉米醪及水；P2培养基包括40g/L的葡萄糖、1g/L的酵母粉、1质量％缓冲液、1重量％营养液及水，所述缓冲液包括磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L，所述营养液包括1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠。由于营养液不能进行高温灭菌，需要通过膜过滤除菌。葡萄糖和酵母粉为菌体提供碳源和氮源，所以需要时再进行配制，以避免染菌。而缓冲液中必需营养物质较少，不易染菌，灭菌后可长期保存。当需要进行发酵时，将预先经过高温灭菌的含有葡萄糖和酵母菌的培养基与缓冲液及营养素混合，以进行后续发酵。发明人经过大量实验优化得到最优活化处理条件，在此条件下使产丁醇梭菌具有较高的活性，从而使其能够充分利用脱毒水解液进行代谢产丁醇。
综上，根据本发明的实施例，本发明利用木质纤维素生产丁醇的方法具有下列优点的至少之一：
1、利用酵母菌在木质纤维素水解液中先主要代谢抑制物，再代谢糖类的特性，将木质纤维素经过酸水解得到的水解液进行脱毒处理，以便产丁醇梭菌能够利用脱毒的水解液进行代谢，生产丁醇。
2、酵母菌利用水解液进行发酵处理后，对发酵处理产物进行离心或加热处理，能够有效地除去或杀死酵母菌。若产丁醇梭菌直接利用含有酵母菌的发酵处理产物，该产丁醇梭菌会与酵母菌竞争性地生长代谢，进而影响产丁醇梭菌的代谢能力。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
产丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，购自美国模式培养物集存库，保藏号：ATCC824。
粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)：购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC2.107。
实施例1
在该实施例中，按照下列步骤生产丁醇：
1、水解液的制备
(1)将100g预先经过60目筛细化的玉米芯与300mL稀酸溶液(含0.5％(m/v)H2SO4和1.5％(m/v)H3PO4)进行混合，搅拌均匀，135℃加热1h，取出物料冷却至室温。
(2)将步骤(1)所得到的混合物进行抽滤，得到滤液1，再用200毫升自来水洗涤滤渣，再进行过滤，得到滤液2，合并两次滤液，得到水解液。
2、脱毒水解液的制备
(1)粘红酵母种子的活化
将储存于甘油冻存管中的粘红酵母接种于100ml活化培养基中，30℃及180rpm下培养24h，得到种子液。其中，活化培养基成分为：葡萄糖:15g/L，(NH4)2SO4:2g/L，酵母粉:1g/L，KH2PO4:7g/L，Na2HPO4:5g/L，MgSO4:1.5g/L。
(2)粘红酵母发酵培养
将10毫升种子液接种于100毫升发酵培养基中，在180rpm及30℃培养24h，得到发酵产物。
其中，发酵培养基制备方法为：分别称取KNO3、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、CaCl2及FeCl3，加入到脱毒水解液中，并用氢氧化钠调节pH值至6.0，使得发酵培养基中各组分浓度为KNO3：4g/L，KH2PO4：6g/L，Na2HPO4：5g/L，MgSO4：2g/L，CaCl2：0.1g/L，FeCl3：0.12g/L。
(3)离心去除粘红酵母细胞
将发酵产物装入离心管中，8000rpm下离心5min，弃酵母沉淀，所得上清即为脱毒水解液。
3、产丁醇梭菌发酵产丁醇
(1)产丁醇梭菌的一级活化处理
将甘油管保藏的产丁醇梭菌接种于装有10mL玉米培养基(玉米培养基制备方法：6g玉米醪与100mL水混合煮沸15min，115℃灭菌15min，冷却)的试管中，在37℃恒温培养箱中厌氧培养24h，得到一级种子液。
(2)产丁醇梭菌的二级活化处理
100mL三角瓶中进行二级活化处理，其中三角瓶装有60mLP2培养基。将一级种子液以7％(v/v)的接种量接入P2培养基。在37℃恒温培养箱中厌氧培养24h，得到二级种子液。
P2培养基成分：葡萄糖40g/L，酵母粉1g/L，将一级种子液接种于P2培养基之前，预先向P2培养基中加入1％的缓冲液(缓冲液含有磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L)以及1％的营养液(营养液含有1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠)。
(3)产丁醇梭菌的发酵培养
在100ml三角瓶中，加入60ml脱毒水解液(预先用氨水将步骤2所得到的脱毒水解液的pH值调至7.0)，将二级种子液以7％(v/v)的接种量接入脱毒水解液，同时加入1％的缓冲液(缓冲液含有乙酸铵220g/L)和1％的营养液(营养液含有1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠)，在37℃恒温培养箱中厌氧培养60h，进行丁醇发酵。
实施例2
按照实施例1的方法生产丁醇，区别在于，
区别1：步骤2(3)替换为：将包含酵母的发酵产物在80℃摄氏度的温度下静置10分钟；
区别2：步骤3(3)中静置培养时间为72小时。
实施例3
按照实施例1的方法生产丁醇，区别在于，不进行步骤2的操作，直接将步骤1所得到的水解液取代步骤3中的脱毒水解液，进行步骤3的操作。
实施例4
按照实施例1的方法生产丁醇，区别在于，步骤2(2)中，酵母菌发酵时间为12小时。
实施例5
按照实施例1的方法生产丁醇，区别在于，步骤2(2)中，酵母菌发酵时间为60小时。
实施例6
采用液相色谱法测定实施例1～5中水解液及脱毒水解液中的主要成分。结果如表1所示，可以看出，采用实施例1和2的方法能够完全除去水解液中的糠醛和5-羟甲基糠醛。实施例3中，水解液未经脱毒处理，抑制物含量较高。实施例4中，粘红酵母发酵时间较短，抑制物含量较高。实施例5中，虽然抑制物被除去，但是糖损失较严重。
表1水解液和脱毒水解液的主要成分
实施例7
采用常规的气相色谱法测定丁醇含量的方法对实施例1～5得到的丁醇产量进行检测，结果如表2。可以看出，对酵母发酵处理的产物进行离心处理，最终丁醇与丁酸分别达到5.4g/L和2.55g/L，将所述发酵处理的产物进行加热处理，最终丁醇与丁酸分别达到5.02g/L和3.01g/L，表明产丁醇梭菌利用经过脱毒处理的水解液能够进行发酵处理，产丁醇。未经脱毒处理的水解液与脱毒不完全的水解液，抑制物含量较高，产丁醇梭菌株在其中无法生长，进而无法发酵产丁醇。脱毒时间过长则会导致糖剩余量很少，丁醇与丁酸产量大大降低。
表2丁醇产量
丁醇(g/L)
实施例1 5.4
实施例2 5.02
实施例3 0
实施例4 0
实施例5 0.8
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种利用木质纤维素生产丁醇的方法，其特征在于，包括：
(1)将所述木质纤维素进行酸水解处理，得到水解液；
(2)利用所述水解液对酵母菌进行第一发酵处理，得到脱毒水解液；以及
(3)利用所述脱毒水解液对产丁醇梭菌进行第二发酵处理，以便得到丁醇，
优选地，所述酵母菌为粘红酵母。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产丁醇梭菌选自丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌，优选丙酮丁醇梭菌，
任选地，所述木质纤维素选自甘蔗渣、玉米芯或秸秆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸水解处理包括：
将所述木质纤维素与酸溶液按照1:3～5的质量体积比进行混合处理，得到混合物；以及
将所述混合物在123～135摄氏度的温度下进行酸水解处理1～2小时，得到水解液，
任选地，
所述酸溶液包括0.5质量体积％的H2SO4和1.5质量体积％的H3PO4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
将所述混合物在135摄氏度的温度下进行酸水解处理1小时，得到水解液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酵母菌的接种量为5～10体积％，所述第一发酵处理是在30摄氏度的温度以及180rpm的转速下进行24～48小时，
优选地，所述酵母菌的接种量为5体积％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当发酵液中无糠醛和5-羟甲基糠醛时，停止所述第一发酵处理。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，进一步包括：
将所述第一发酵处理的产物进行离心处理，或者将所述第一发酵处理的产物进行加热处理，以便得到所述脱毒水解液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述产丁醇梭菌按照5～10体积％接种于所述脱毒水解液中。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产丁醇梭菌预先经过活化处理，所述活化处理包括：
(1)将保存于-80摄氏度的所述产丁醇梭菌接种于玉米培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到一级种子液；以及
(2)将所述一级种子液按照5～10体积％的接种量接种于P2培养基中，37摄氏度下厌氧培养24～48小时，得到二级种子液。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，
所述玉米培养基包括玉米醪及水；
所述P2培养基包括40g/L的葡萄糖、1g/L的酵母粉、1质量％缓冲液、1重量％营养液及水，
所述缓冲液包括磷酸氢二钾65.5g/L、磷酸二氢钾50g/L和乙酸铵220g/L，
所述营养液包括1g/L对-氨基苯甲酸、1g/L硫胺素、0.1g/L生物素、200g/L硫酸镁、10g/L硫酸锰、10g/L硫酸亚铁以及10g/L氯化钠。
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