CN104263771A - 一种利用不脱毒纤维素水解液产微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用不脱毒纤维素水解液产微生物油脂的方法。本发明公开一种生产微生物油脂的方法，是将可产生微生物油脂的菌接种至含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养，在微生物油脂积累期之前，当发酵培养液中的总糖浓度降至10g/l以下时，补加未脱毒纤维素水解液。本发明的有益效果在于：微生物可直接利用预处理后不经脱毒的纤维素水解液生产油脂，省去了纤维素脱毒处理，简化了工艺，降低了生产成本；两阶段补料方式和两阶段溶氧控制显著提高了微生物油脂含量和油脂产量，易于实现大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种产微生物油脂的方法；特别涉及一种利用不脱毒纤维素水解液产微生物油脂的方法，属于生物化工领域。
背景技术
近年来，人口的迅速增长和工业的不断发展，化石资源的消耗强度日益增高，日趋严峻的燃油供应形势，使得能源短缺问题成为摆在人类面前不可避免的重要问题之一。生物柴油是近年来基于环境恶化和能源危机发展起来的一种可替代化石燃料的可再生新能源，具有很大发展潜力，但过高的成本成为限制微生物油脂产业化的主要原因。
微生物油脂(microbial oil)又称单细胞油脂(single cell oil)，是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定的条件下，利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂作为碳源，在菌体内产生的大量油脂，其较动物油脂及植物油脂具有细胞增殖快、生产周期短、生长所需的原料丰富、价格便宜等优点，因此，利用微生物发酵生产油脂作为制备生物柴油的原料在未来生物柴油产业中将发挥重要作用。
木质纤维素作为自然界中来源最为广泛，价格极为低廉，且能再生的绿色资源，有望成为持续稳定地生产微生物油脂的原料。但木质纤维素在预处理过程中产生的许多副产物会抑制菌体的生长和发酵，脱毒的预处理方法可以除去水解液中抑制物，但脱毒过程工艺复杂，且脱毒过程中有10-20％左右的糖损，因此，脱毒大大增加了微生物油脂的生产成本，是木质纤维类原料大规模生产微生物油脂的一个重要障碍。如果能够开发直接利用纤维素水解液的工艺，则可以简化操作过程，减少糖损失，降低生产成本，提高整个过程的经济性。
目前，微生物油脂的研究主要集中在以纯葡萄糖或木糖为原料，或是以脱毒后的纤维素水解液为原料生产微生物油脂。刘泽军等用圆红冬孢酵母在经Ca(OH)2脱毒处理后的玉米秸秆水解液中进行发酵产油脂，发酵时间5d，得到的生物量为13.5g/L，油脂产量4.71g/L，油脂含量为34.9％。黄等以经稀硫酸水解并由Ca(OH)2过中和及离子交换树脂脱毒处理后的稻杆为原料，由阿萨西丝孢酵母T.fermentans CICC1368发酵生产油脂，其生物量达到28g/l，油脂产量11g/l,油脂含量40％，而采用不脱毒的水解液，油脂产量仅1.7g/l。Tsigie等将甘蔗渣用稀盐酸进行水解，并用Ca(OH)2过中和脱毒，由解脂耶罗威亚酵母菌Y.lipolytica Po1g发酵生产油脂，油脂含量和浓度分别达到58.5％和6.68g/l。由于纤维素原料经预处理后，生成乙酸，糠醛，5-羟甲基糠醛，酚类物质等抑制物，抑制微生物的生长及油脂的合成，目前对不脱毒纤维素水解液直接利用生产油脂的报道还不多见。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用不脱毒纤维素水解液产微生物油脂的方法。
本发明提供一种生产微生物油脂的方法，是将可产生微生物油脂的菌接种至含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养，在微生物油脂积累期之前，当发酵培养液中的总糖浓度降至10g/l以下时，补加未脱毒纤维素水解液，使得发酵培养液中的总糖浓度维持在20g/l-30g/l，同时补加氮源，使得发酵培养液中的C/N为50-100，同时控制溶氧≥30％；在微生物油脂积累期，当发酵培养液中的总糖浓度降至10g/l以下时，只补加未脱毒纤维素水解液，使得发酵培养液中的总糖浓度维持在20g/l-30g/l，同时控制溶氧为5％-10％，直到发酵结束；
所述发酵培养基的初始总糖浓度为20g/l-30g/l；
所述微生物油脂积累期为所述可产生微生物油脂的菌的稳定期及以后的时期；
所述发酵培养液是指菌体发酵时的培养液，该培养液含有发酵培养基和可产生微生物油脂的菌。
上述方法中，所述发酵培养基的初始总糖浓度为30g/l、20g/l或25g/l；
所述发酵培养基是在所述未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节pH至6.0-7.0，即得；
所述发酵培养基的pH具体为6.0、6.5或7.0；
所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料用酸进行水解得到。
上述任一所述的方法中，所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照体积比1:5-1:10混合，110℃-130℃水解1h-5h，过滤除渣，调节pH至6.0-7.0；
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为0.5g/100ml，磷酸具体为1.5g/100ml；
或，
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为1g/100ml，磷酸具体为1g/100ml；
或，
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为3g/100ml，磷酸具体为3g/100ml；
所述体积比具体为1:5、1:7或1:10；
所述水解的条件具体为123℃水解1h、130℃水解3h或110℃水解5h；
所述未脱毒纤维素水解液的pH具体为6.0、6.5或7.0；
所述未脱毒纤维素水解液中糖的浓度具体为200g/l。
上述任一所述的方法中，所述纤维素原料固体粉末为甘蔗渣固体粉末、玉米芯固体粉末或秸秆固体粉末；
所述秸秆固体粉末具体为玉米秸秆固体粉末。
上述任一所述的方法中，所述发酵培养的温度为30-35℃，pH为6.0-7.0，通气量为0.5-2.0vvm；
所述发酵培养的温度具体为30℃、32℃、35℃；
所述发酵培养的pH具体为6.0、6.5或7.0；
所述通气量具体为0.5vvm、1.0vvm或2.0vvm；
所述氮源为硫酸铵或硝酸钾；
所述微生物油脂积累期之前发酵培养液中的C/N为50、70或100；
所述在微生物油脂积累期的溶氧控制为5％、8％或10％；
所述发酵结束为从发酵开始120h-226h后；
所述发酵结束具体为从发酵开始120h、199h或226h后。
上述任一所述的方法中，所述将可产生微生物油脂的菌接种至含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养之前，还包括种子培养的步骤，是将所述可产生微生物油脂的菌接种到种子培养基，30-35℃，150-250rpm，培养20-30h，得到种子培养液；
所述种子培养的条件具体为30℃，150rpm，培养20h；或，35℃，250rpm，培养30h；或，32℃，200rpm，培养28h。
上述任一所述的方法中，所述种子培养液是按照体积百分含量5％-10％的比例接入所述含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养的；
所述接种量具体为5％、8％或10％；
所述种子培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母粉、KH2PO4、Na2HPO4和MgSO4；所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度为15g/L，所述(NH4)2SO4在所述种子培养基中的浓度为2g/L，所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度为1g/L，所述KH2PO4在所述种子培养基中的浓度为7g/L，所述Na2HPO4在所述种子培养基中的浓度为2g/L，所述MgSO4在所述种子培养基中的浓度为1.5g/L,调节培养基的pH为6。
上述任一所述的方法中，所述可产生微生物油脂的菌为粘红酵母或圆红冬孢酵母。
上述任一所述的方法中，所述可产生微生物油脂的菌为粘红酵母时，所述种子培养的条件为30℃，150rpm，培养20h；
所述接种量为10％；
所述发酵培养基是在所述未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至6.0；
所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含1.5g/100ml磷酸与0.5g/100ml硫酸的水溶液按照体积比1:5混合，123℃水解1h，过滤除渣，调节pH至6.0；
所述纤维素原料固体粉末为玉米芯固体粉末；
所述发酵培养基的初始总糖浓度为30g/l；
所述发酵培养的温度为30℃，pH为6.0，通气量为1.0vvm；
所述在微生物油脂积累期之前的溶氧控制为30％；
所述在微生物油脂积累期之前补加未脱毒纤维素水解液的时间分别在从发酵开始的48h，72h，共补料2次；
所述氮源为硫酸铵；
所述在微生物油脂积累期之前发酵培养液中的C/N为50；
所述在微生物油脂积累期补加未脱毒纤维素水解液的时间为从发酵开始的96h，120h，144h，共补料3次；
所述在微生物油脂积累期的溶氧控制为10％；
所述在微生物油脂积累期为从发酵开始的96h之后；
所述未脱毒纤维素水解液中糖的浓度具体为200g/l；
所述发酵结束为从发酵开始199h后。
上述任一所述的方法中，所述可产生微生物油脂的菌为粘红酵母时，所述种子培养的条件为35℃，250rpm，培养30h；
所述接种量为5％；
所述发酵培养基是在所述未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至6.5；
所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有1g/100ml硫酸和1g/100ml磷酸的水溶液按照体积比1:10混合，130℃水解3h，过滤除渣，调节pH至6.5；
所述纤维素原料固体粉末为甘蔗渣固体粉末；
所述发酵培养基的初始总糖浓度为20g/l；
所述发酵培养的温度为35℃，pH为6.5，通气量为2.0vvm；
所述在微生物油脂积累期之前的溶氧控制为40％；
所述在微生物油脂积累期之前补加未脱毒纤维素水解液的时间分别在从发酵开始的24h，48h，共补料2次；
所述氮源为硝酸钾；
所述在微生物油脂积累期之前发酵培养液中的C/N为100；
所述在微生物油脂积累期补加未脱毒纤维素水解液的时间为从发酵开始的72h，96h，共补料2次；
所述在微生物油脂积累期的溶氧控制为5％；
所述在微生物油脂积累期为从发酵开始的72h之后；
所述未脱毒纤维素水解液中糖的浓度具体为200g/l。
所述发酵结束为从发酵开始120h后。
上述任一所述的方法中，所述可产生微生物油脂的菌为圆红冬孢酵母时，所述种子培养的条件为32℃，200rpm，培养28h；
所述接种量为8％；
所述发酵培养基是在所述未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至7.0；
所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有3g/100ml硫酸和3g/100ml磷酸的水溶液按照体积比1:7混合，110℃水解5h，过滤除渣，调节pH至7.0；
所述纤维素原料固体粉末为秸秆固体粉末，具体为玉米秸秆固体粉末；
所述发酵培养基的初始总糖浓度为25g/l；
所述发酵培养的温度为32℃，pH为7.0，通气量为0.5vvm；
所述在微生物油脂积累期之前的溶氧控制为30％；
所述在微生物油脂积累期之前补加未脱毒纤维素水解液的时间分别在从发酵开始的36h,60h，80h共补料3次；
所述氮源为硝酸钾；
所述在微生物油脂积累期之前发酵培养液中的C/N为70；
所述在微生物油脂积累期补加未脱毒纤维素水解液的时间为从发酵开始的100h，130h,160h,190h共补料4次；
所述在微生物油脂积累期的溶氧控制为8％；
所述在微生物油脂积累期为从发酵开始的100h之后；
所述未脱毒纤维素水解液中糖的浓度具体为200g/l；
所述发酵结束为从发酵开始226h后。
一种未脱毒纤维素水解液也属于本发明的保护范围，其制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照体积比1:5-1:10混合，110℃-130℃水解1-5h，过滤除渣，调节pH至6.0-7.0；
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为0.5g/100ml，磷酸具体为1.5g/100ml；
或，
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为1g/100ml，磷酸具体为1g/100ml；
或，
所述含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液中硫酸具体为3g/100ml，磷酸具体为3g/100ml；
所述体积比具体为1:5、1:7或1:10；
所述水解的条件具体为123℃水解1h、130℃水解3h或110℃水解5h；
所述未脱毒纤维素水解液的pH具体为6.0、6.5或7.0；
所述纤维素原料固体粉末具体为甘蔗渣固体粉末、玉米芯固体粉末或秸秆固体粉末；
所述秸秆固体粉末具体为玉米秸秆固体粉末。
上述未脱毒纤维素水解液在制备微生物油脂中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明提供的产微生物油脂的方法是以不脱毒纤维素水解液为原料，通过两阶段补料方式进行高密度培养，同时采用两阶段溶氧控制，显著提高了生物量，同时可获得较高的微生物油脂产量。
本发明的有益效果在于：微生物可直接利用预处理后不经脱毒的纤维素水解液生产油脂，省去了纤维素脱毒处理，简化了工艺，降低了生产成本；两阶段补料方式和两阶段溶氧控制显著提高了微生物油脂含量和油脂产量，易于实现大规模生产。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中未脱毒纤维素水解液的浓度表示未脱毒纤维素水解液中的糖占未脱毒纤维素水解液的比例，比如200g/l未脱毒纤维素水解液表示每升未脱毒纤维素水解液中含有糖200g。
下述实施例中的菌体生物量(即细胞干重)是指菌体的质量与发酵培养液的比例，油脂产量是指油脂的质量与发酵培养液的比例，油脂含量是指油脂的质量占菌体的质量百分含量。发酵培养液是指菌体发酵时的培养液，该培养液含有发酵培养基和菌体。
粘红酵母(Rhodotorula Glutinis)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC2.704。
圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC2.107。
玉米芯购自高唐宏达玉米芯颗粒有限公司。
甘蔗渣、玉米秸秆购自北京本地市场。
下述实施例中的微生物油脂积累期为所述可产生微生物油脂的菌的稳定期及以后的时期。
实施例1、粘红酵母发酵生产油脂方式1
一、菌种：粘红酵母(Rhodotorula Glutinis)
二、培养基的制备
(1)种子培养基：由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质为葡萄糖、(NH4)2SO4、酵母粉、KH2PO4、Na2HPO4和MgSO4；所述葡萄糖在所述种子培养基中的浓度为15g/L，所述(NH4)2SO4在所述种子培养基中的浓度为2g/L，所述酵母粉在所述种子培养基中的浓度为1g/L，所述KH2PO4在所述种子培养基中的浓度为7g/L，所述Na2HPO4在所述种子培养基中的浓度为2g/L，所述MgSO4在所述种子培养基中的浓度为1.5g/L,调节培养基的pH为6，115℃灭菌15min备用。
(2)未脱毒纤维素水解液的制备：将玉米芯固体粉末和含1.5g/100ml磷酸与0.5g/100ml硫酸的水溶液按照体积比1:5混合，并在123℃水解1小时，用真空泵抽滤除滤渣，得到未脱毒纤维素水解液，调节溶液的pH至6.0，115℃灭菌15min备用。
(3)发酵培养基的制备：在灭菌前的未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至6.0，115℃灭菌15min备用。
三、发酵
(1)在500ml摇瓶中装种子培养基50ml，将粘红酵母接种于种子培养基中，进行有氧培养，温度30℃，摇床转速150rpm，培养20h，得到种子液。
(2)将种子液以体积百分含量10％的接种量接入5L发酵罐中进行发酵，发酵罐装发酵培养基3L(发酵培养基的初始总糖浓度为30g/l)。pH6.0，通气量1.0vvm，溶氧控制30％，30℃培养，搅拌；当总糖浓度降至10g/l以下时，开始补加200g/l未脱毒纤维素水解液进行补料(分别在48h，72h共补料2次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l，同时补加硫酸铵，使得发酵培养液中的C/N为50；在微生物油脂积累期，当总糖浓度降至10g/l以下时，只补加200g/l未脱毒纤维素水解液(96h，120h，144h共补料3次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l。在微生物油脂积累期前(具体为发酵开始的96h前)溶氧控制在30％，到达微生物油脂积累期之后(具体为发酵开始的96h后)溶氧控制在10％。
四、发酵结果
发酵结束(从发酵开始199h)后，菌体生物量(即细胞干重)达到77.8g/l，利用气相色谱测得的油脂产量为36.4g/l，计算得到的油脂含量为47％。
实施例2、粘红酵母发酵生产油脂方式2
一、菌种：粘红酵母(Rhodotorula Glutinis)
二、培养基的制备
(1)种子培养基的制备同实施例1的步骤二中种子培养基的制备。
(2)未脱毒纤维素水解液的制备：用粉碎机对甘蔗渣进行粉碎，得到甘蔗渣固体粉末，将甘蔗渣固体粉末和含1g/100ml硫酸和1g/100ml磷酸的水溶液按照体积比1:10混合，并在130℃水解3小时，用真空泵抽滤除滤渣，得到未脱毒纤维素水解液，调节溶液的pH至6.5，115℃灭菌15min备用。
(3)发酵培养基的制备：在灭菌前的未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至6.5，115℃灭菌15min备用。
三、发酵
(1)在500ml摇瓶中装种子培养基50ml，将粘红酵母接种于种子培养基中，进行有氧培养，温度35℃，摇床转速250rpm，培养30h，得到种子液。
(2)将种子液以体积百分含量5％的接种量接入5L发酵罐中进行发酵，发酵罐装发酵培养基3L(发酵培养基的初始总糖浓度为20g/l)。pH6.5，通气量2.0vvm，溶氧控制40％，35℃培养，搅拌。当总糖浓度降至10g/l以下时，开始补加200g/l未脱毒纤维素水解液进行补料(分别在24h、48h共补料2次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l，同时补加硝酸钾，使得发酵培养液中的C/N为100；在微生物油脂积累期，当总糖浓度降至10g/l以下时，只补加200g/l未脱毒纤维素水解液(72h，96h共补料2次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l。在微生物油脂积累期前(具体为发酵开始的72h前)溶氧控制在40％，到达微生物油脂积累期之后(具体为发酵开始的72h后)溶氧控制在5％。
四、发酵结果
发酵结束(从发酵开始120h)后，菌体生物量(即细胞干重)达到45.1g/l，利用气相色谱测得的油脂产量为27.1g/l，计算得到的油脂含量为60％。
实施例3、圆红冬孢酵母发酵生产油脂
一、菌种：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
二、培养基的制备
(1)种子培养基的制备同实施例1的步骤二中种子培养基的制备。
(2)未脱毒纤维素水解液的制备：用粉碎机对玉米秸秆进行粉碎，得到秸秆固体粉末，将秸秆固体粉末和含3g/100ml硫酸和3g/100ml磷酸的水溶液按照体积比1:7在110℃水解5小时，用真空泵抽滤除滤渣，调节溶液的pH至7.0，115℃灭菌15min备用。
(3)发酵培养基的制备：在灭菌前的未脱毒纤维素水解液中加入4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节溶液的pH至7.0，115℃灭菌15min备用。
三、发酵
(1)在500ml摇瓶中装种子培养基50ml，将圆红冬孢酵母接种于种子培养基中，进行有氧培养，温度32℃，摇床转速200rpm，培养28h，得到种子液。
(2)将种子液以体积百分含量8％的接种量接入5L发酵罐中进行发酵，发酵罐装发酵培养基3L(发酵培养基的初始总糖浓度为25g/l)。pH7.0，通气量0.5vvm，溶氧控制30％，32℃培养，搅拌。当总糖浓度降至10g/l以下时，开始补加200g/l未脱毒纤维素水解液进行补料(36h,60h，80h共补料3次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l，同时补加硝酸钾，使得发酵培养液中的C/N为70；在微生物油脂积累期，当总糖浓度降至10g/l以下时，只补加200g/l未脱毒纤维素水解液(100h，130h,160h,190h共补料4次)，维持发酵培养液的总糖浓度为20-30g/l。在微生物油脂积累期前(具体为发酵开始的100h前)溶氧控制在30％，到达微生物油脂积累期之后(具体为发酵开始的100h后)溶氧控制在8％。
四、发酵结果
发酵结束(从发酵开始226h)，菌体生物量(即细胞干重)达到80.1g/l，利用气相色谱测得的油脂产量为40.5g/l，计算得到的油脂含量为50％。
Claims (10)
1.一种生产微生物油脂的方法，是将可产生微生物油脂的菌接种至含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养，在微生物油脂积累期之前，当发酵培养液中的总糖浓度降至10g/l以下时，补加未脱毒纤维素水解液，使得发酵培养液中的总糖浓度维持在20g/l-30g/l，同时补加氮源，使得发酵培养液中的C/N为50-100，同时控制溶氧≥30％；在微生物油脂积累期，当发酵培养液中的总糖浓度降至10g/l以下时，只补加未脱毒纤维素水解液，使得发酵培养液中的总糖浓度维持在20g/l-30g/l，同时控制溶氧为5％-10％，直到发酵结束；
所述发酵培养基的初始总糖浓度为20g/l-30g/l。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的初始总糖浓度为30g/l、20g/l或25g/l；
所述发酵培养基是在所述未脱毒纤维素水解液中加入终浓度为4g/L的(NH4)2SO4、6g/L的KH2PO4、2g/L的Na2HPO4、2g/L的MgSO4、0.1g/L的CaCl2、0.12g/L的FeCl3，并调节pH至6.0-7.0，即得；
所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料用酸进行水解得到。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述未脱毒纤维素水解液的制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照体积比1:5-1:10混合，110℃-130℃水解1h-5h，过滤除渣，调节pH至6.0-7.0。
4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：所述纤维素原料固体粉末为甘蔗渣固体粉末、玉米芯固体粉末或秸秆固体粉末。
5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为30-35℃，pH为6.0-7.0，通气量为0.5-2.0vvm；
所述氮源为硫酸铵或硝酸钾；
所述微生物油脂积累期之前发酵培养液中的C/N为50、70或100；
所述在微生物油脂积累期的溶氧控制为5％、8％或10％；
所述发酵结束为从发酵开始120h-226h后。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于：所述将可产生微生物油脂的菌接种至含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养之前，还包括种子培养的步骤，是将所述可产生微生物油脂的菌接种到种子培养基，30-35℃，150-250rpm，培养20-30h，得到种子培养液。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于：所述种子培养液是按照体积百分含量5％-10％的比例接入所述含有未脱毒纤维素水解液的发酵培养基中进行发酵培养的。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于：所述可产生微生物油脂的菌为粘红酵母或圆红冬孢酵母。
9.一种未脱毒纤维素水解液，其制备方法如下：将纤维素原料固体粉末与含有0.5g/100ml-3g/100ml的硫酸和1g/100ml-3g/100ml的磷酸的水溶液按照体积比1:5-1:10混合，110℃-130℃水解1-5h，过滤除渣，调节pH至6.0-7.0。
10.权利要求9所述的未脱毒纤维素水解液在制备微生物油脂中的应用。
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