CN102080119B - 混合培养酵母和藻类生产油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种混合培养酵母和藻类生产油脂的方法。该方法利用工业废水为培养基，混合培养酵母和藻类，生产微生物油脂。其特点是：酵母和藻类的混合培养与两种微生物单独培养相比，能够更有效地降解废水的COD，也促进了酵母和藻类对工业废水中营养成分的合理利用，利于油脂的合成。本发明微生物油脂的生产方法有操作简单、成本低廉和实用价值高的优点，既能减少高浓度的工业废水对环境的污染，又能变废为宝生产紧缺产品油脂，达到了废弃物资源化利用的目的。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，特别涉及培养油脂微生物发酵生产油脂的方法。
背景技术
随着人类社会资源压力和环境问题日益突出，特别是随着日趋严重的全球性能源短缺与环境恶化，使得人们积极开发替代化石燃料的可再生清洁新能源，生物柴油就是一种具有很大发展潜力的可再生清洁能源。生物柴油原料油脂的主要来源动物油脂、植物油脂已经不能满足生产需求，所以通过微生物转化可再生资源生产油脂，开展微生物油脂这一新的油脂资源的开发和研究，不但丰富了传统的油脂工业技术，而且也将是工业化生产油脂的一个重要途径。
产油微生物主要有细菌、酵母、霉菌和藻类，发现在酵母、霉菌等真核微生物中，某些产油种属能积累占其生物干重70％以上的油脂。有文献报道在氮源缺陷型培养基中，深黄被孢霉生长较好(其生物量达35.9g/L)，待氮源耗尽后，真菌菌体中将会大量积累脂肪(达菌体干重的50％～55％)，从而油脂产量可高达18.1g/L(Seraphim Papanikolaou，Michael Komaitis，George Aggelis.Single cell oil(SCO)production by Mortierella isabellina grown on high-sugarcontent media[J].Bioresource Technology，2004，95：287-291)。施安辉等通过对粘红酵母GRL513生产油脂最佳小型工艺发酵条件的探讨发现，最终油脂产量可达菌体干重的67.2％(施安辉，周波.粘红酵母GLR513生产油脂最佳小型工艺发酵条件的探讨[J].食品科学，2003，24(1)：48-51)。吴庆余、缪晓玲通过异养转化细胞工程技术获得了脂类含量高达细胞干重55％的异养藻细胞(缪晓玲.藻类可再生能源的利用及藻细胞抗环境胁迫的研究[D].北京：清华大学，2004)。
由于工业的迅速发展，工业废水的排放量在不断增加，造成了严重的环境污染。目前，每年我国味精废水排放量可达2500万吨，淀粉废水产量也高达2400万吨，造纸废水产量一年更是达到36.7亿吨，各种工业废水排放总量很高，严重污染生活环境，破坏生态平衡。这些废水有许多共同点，即有机物含量高，所以COD很高，可达几万；同时，这些工业废水中一般含有糖分、有机酸、少量维生素等微生物可以利用的营养物质，且有氮、磷等离子，可以综合利用工业废水，达到处理废水的目的。目前，关于工业废水的处理工艺和综合利用已经开发了一些方法，如石振清等报道了物化处理法：有絮凝沉淀、膜分离、离心、吸附等方法(石振清，王静荣，李书申.味精废水处理技术综述[J].环境污染治理技术与设备，2001，2(2)：81-90)；和生物处理法：如微藻培养、酵母培养、活性污泥等方法。杨清香等综述了酵母适合处理工业废水的特点：生长速度快，代谢旺盛，耐酸，耐高渗透压，耐高浓度有机底物，并且具有可做饲料蛋白、处理效率高、污泥负荷高、占地面积小等特殊的优越性，被用于多种有机废水的处理(杨清香，贾振杰，潘峰.酵母菌在废水处理中的应用[J].环境污染治理技术与设备，2005，6(2)：2-5.)。
申请号为200710179996.7的中国专利申请公开了一种利用工业废弃物发酵生产微生物油脂的方法及其专用菌株。该方法是一种利用工业废弃物(如淀粉、味精、造纸等工业生产废水和/或酱渣等发酵工业废渣)为培养基，发酵粘红酵母生产微生物油脂的方法。
但是目前，两种微生物混合培养生产油脂的研究较少，尤其是异养的酵母和自养的藻类混合培养，是否更有利于微生物生长和油脂合成，相关研究报道较少，而利用工业废水(淀粉、味精、柠檬酸、造纸等工业废水)混合培养微生物生产油脂的报道也是甚少。
由于化石能源的日趋减少以及使用化石能源造成的环境污染的加剧，使科研工作者把注意力集中到可再生能源的开发利用上。在各种可再生能源中，具有广泛实用价值的能源是生物质能。在生物质能源中，生物柴油的生产越来越引起人们的重视，因而生物柴油生产原料油也引起了人们的关注。
发明内容
本发明的目的是通过混合培养酵母和藻类提高油脂的产量，提供一种利用微生物高效生产油脂的方法，同时也提供一种利用工业废水培养产油微生物并提高其油脂产量的方法。
本发明所提供的混合发酵生产微生物油脂的方法，包括以下内容：
将酵母和藻类种子液分别接种到装有混合培养基的培养装置中，在25～30℃下混合培养72～144h。接种量分别为5％～30％；收集发酵得到的酵母菌体细胞和藻细胞，菌体烘干粉碎后，提取油脂，得到微生物油脂。
本发明培养装置为搅拌罐、气流混合式反应器(包括气升式反应器)或敞口气流混合式反应器，对于敞口气流混合式反应器培养阶段通入空气或者CO2使发酵液充分混合，空气流速为2～25L/min。
本发明所述混合培养基为基础培养基、优化培养基或工业废水处理培养基。
为提高菌体的生长速率，在反应器中发酵时可流加废葡萄糖母液或糖蜜或高含糖废水，其中，废葡萄糖母液为淀粉厂生产葡萄糖的废液，主要成分为葡萄糖，浓度为400～500g/L。
本发明中所述工业废水为味精、淀粉、柠檬酸或乙醇发酵废水。
本发明中所述工业废水处理培养基制备方法如下：用工业废水制备发酵培养基，可用离心沉降的方法去除工业废水中的不溶性颗粒，再稀释2～8倍，加酸碱液调节至pH5～7。
由于所用酵母生长的适宜pH范围为3.5～6，藻类生长的适宜pH范围为6.5～9.5，采用的工业废水呈弱酸性时，不需要加酸碱溶液调节pH，可以先接种酵母，培养24～72h待pH有所升高后再接种藻类；同样，采用的工业废水呈弱碱性时，可以先接种藻类并通入CO2，培养24～72h待pH有所降低后再接种酵母。例如味精废水的pH值一般为2～3，需要用碱溶液调节至5～6；淀粉废水pH一般为3.5～5，柠檬酸废水pH一般为5～5.5，乙醇发酵废水pH一般为4～5，所以不需要用碱液调节，先接种酵母培养几天再接种藻类。
由于味精废水中有机物和COD浓度较高，酵母更适应废水有机环境，为提高生物量和油脂产量，接种时先接入酵母，使各种有机物和COD浓度降低，更适宜藻类生长，酵母培养24～72h后，再接入藻种培养48～72h。
本发明中所述酵母和藻类种子液培养方法如下：
将酵母菌接种到酵母种子液培养基中，在25～30℃、100～180rpm下培养24～30h，得到酵母种子液；
将藻种接种到藻类种子液培养基中，在25～30℃，光强1000～4000lx条件下，培养48～72h，得到藻类种子液。
其中，为获得更好的培养效果，酵母菌种进行种子培养前还需要对其活化。
所述酵母为粘红酵母、斯达油脂酵母、红冬孢酵母、假丝酵母或酿酒酵母。
所述藻类为螺旋藻或小球藻。
所述基础培养基的配方为：葡萄糖20.0～80.0g/L；(NH4)2SO40.1～5.0g/L；KH2PO40.5～10.0g/L；MgSO4·7H2O 0.1～5.0g/L；NaNO30.5～10.0g/L；K2SO40.5～5.0g/L；NaCl0.01～5.0g/L；NaHCO31.0～20g/L；FeSO4·7H2O 1.0～30mg/L；EDT A 40～100.0mg/L；CaCl20.5～10.0mg/L；H3BO30.1～10.0mg/L；(NH4)6Mo7O240.005～1.0mg/L；MnCl2·4H2O 0.5～5.0mg/L；CuSO4·5H2O 0.05～2.0mg/L；ZnSO4·7H2O 0.05～3.0mg/L；调pH至5.5；
所述优化培养基的配方为：MgSO4·7H2O 0.1～5.0g/L；K2HPO40.1～3.0g/L；KH2PO41.0～20.0g/L；Na2SO40.1～5.0g/L；K2SO40.5～5.0g/L；NaCl 0.1～5.0g/L；NaNO30.1～10.0g/L；(NH4)2SO40.1～8.0g/L；脲1.0～8.0g/L；大豆蛋白胨2.0～30.0g/L；酵母粉2.0～20.0g/L；葡萄糖20.0～100.0g/L；糖蜜1.0～20.0g/L；FeSO4·7H2O 1.0～30.0mg/L；EDTA 40～100.0mg/L；CaCl20.5～10.0mg/L；H3BO30.1～10.0mg/L；(NH4)6Mo7O240.005～1.0mg/L；MnCl2·4H2O 0.5～5.0mg/L；CuSO4·5H2O 0.05～2.0mg/L；ZnSO4·7H2O 0.05～3.0mg/L；调pH至5.5。
用上述方法得到的微生物油脂也属于本发明的保护范围。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
有益效果：
本发明微生物油脂的生产方法有很多优点，操作简单，油脂产量高，成本低廉，实用价值高。本工艺一个重要的特点是混合培养两种微生物发酵生产油脂，其中酵母利用有机物进行异养，产生的CO2为藻类提供碳源，进行光合自养，同时光合作用放出O2，供两类微生物生长代谢，各自代谢产物也利于对方生长，两者混合培养更促进微生物对培养基营养成分的利用，有利于微生物生长和油脂合成，总油脂产量比两种微生物单独培养时高许多；同时，藻类在葡萄糖为碳源时也可进行异养，产油能力提高。
本方法还有一个重要优点，就是可以利用工业废水混合培养两种微生物发酵生产油脂，不仅能减少工业生产排放的高浓度废水对环境的污染，又能变废为宝，生产当前市场上比较紧缺的油脂，达到了废弃物资源化利用的目的；而且混合培养两种微生物处理工业废水生产油脂，其处理废水的效果比单独培养两种微生物处理废水的效果好。
附图说明
图一为本发明发酵生产微生物油脂方法的工艺流程简图
图二为搅拌罐中混合培养粘红酵母和小球藻流加发酵生产微生物油脂
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
实施例1粘红酵母和钝顶螺旋藻在混合培养基中发酵与单独培养产油脂的比较
所用微生物为粘红酵母CGMCC No.2258(购自中国普通微生物菌种保藏中心)和钝顶螺旋藻Spirulina platens FACHB-Collection No.791(钝顶螺旋藻购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)。种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖4g；酵母粉0.15g；(NH4)2SO40.2g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
混合培养基是基础培养基，配方为：葡萄糖40g/L；(NH4)2SO41.0g/L；KH2PO45.0g/L；MgSO4·7H2O 1.0g/L；NaNO32.5g/L；K2SO41.5g/L；NaCl 1.0g/L；NaHCO310.0g/L；FeSO4·7H2O10mg/L；EDTA 80mg/L；CaCl24mg/L；H3BO32.86mg/L；(NH4)6Mo7O240.02mg/L；MnCl2·4H2O1.80mg/L；CuSO4·5H2O 0.125mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22mg/L。pH用氨水控制在5.5。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，其流程图如图1所示，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
(4)发酵培养：按以下五种方式培养
①分别按10％(v/v)的接种量，将步骤(1)所获得的螺旋藻种子液和步骤(3)所获得的粘红酵母种子液接种到装有50mL无菌基础培养基的250mL三角瓶中，在温度30℃、光强2000lx、振荡速率140rpm的条件下培养120h；
②按10％(v/v)的接种量，将步骤(1)所获得的螺旋藻种子液接种到装有50mL无菌螺旋藻种子培养基的250mL三角瓶中，在温度30℃、光强2000lx的条件下培养120h；
③按10％(v/v)的接种量，将步骤(3)所获得的粘红酵母种子液接种到装有50mL无菌粘红酵母种子培养基的250mL三角瓶中，在温度30℃、振荡速率140rpm的条件下培养120h；
④按10％(v/v)的接种量，将步骤(1)所获得的螺旋藻种子液接种到装有50mL无菌基础培养基的250mL三角瓶中，在温度30℃、光强2000lx的条件下培养120h；
⑤按10％(v/v)的接种量，将步骤(3)所获得的粘红酵母种子液接种到装有50mL无菌基础培养基的250mL三角瓶中，在温度30℃、振荡速率140rpm的条件下培养120h。
(5)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法发酵生产油脂，两种微生物混合培养，即培养方式①的总生物量为3673mg/L，油脂产量为467mg/L；方式②的生物量为743mg/L，油脂产量为119mg/L；方式③的生物量为4784mg/L，油脂产量为147mg/L；方式④的生物量为203mg/L，油脂产量为13mg/L；方式⑤的生物量为1702mg/L，油脂产量为135mg/L。经计算，两种微生物在各自培养基中单独培养总的生物量为5527mg/L，油脂产量为266mg/L；在混合培养基中单独培养总的生物量为1905mg/L，油脂产量为148mg/L。单独培养总的油脂产量均低于混合培养的油脂产量。
实施例2在搅拌罐中混合培养圆红冬孢酵母和钝顶螺旋藻批次发酵生产微生物油脂
所用微生物为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)CGMCC No.2.1609，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，钝顶螺旋藻(同例1)。种子液培养基配方为：
圆红冬孢酵母：葡萄糖20g；酵母粉1.5g；(NH4)2SO40.1g；KH2PO40.4g；MgSO4·7H2O1.5g，用水定容至1L，调pH至6.0。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
混合培养基是优化培养基，配方为：MgSO4·7H2O 1.5g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO47.0g/L；Na2SO41.0g/L；K2SO41.0g/L；NaCl 1.0g/L；NaNO32.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；脲2.0g/L；大豆蛋白胨10.0g/L；酵母粉6.0g/L；葡萄糖80.0g/L；糖蜜5.0g/L；FeSO4·7H2O 10mg/L；EDTA80mg/L；CaCl24mg/L；H3BO32.86mg/L；(NH4)6Mo7O240.02mg/L；MnCl2·4H2O 1.80mg/L；CuSO4·5H2O 0.125mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22mg/L。pH用氨水控制在5.5。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)圆红冬孢酵母菌种活化：将保藏的斜面圆红冬孢酵母菌种在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面圆红冬孢酵母菌种，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、180rpm下，振荡培养24h，得到种子液；
(4)发酵培养：分别按10％(v/v)的接种量，将所得螺旋藻种子液和圆红冬孢酵母种子液接到装有2L无菌优化培养基的5L搅拌罐中，在温度30℃、通气量2L/min、光强4000lx、搅拌转速300rpm的条件下培养105h。
(5)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法发酵生产油脂。其中，总的生物量在65h达到最高32.5g/L，油脂产量在56h达到最高3.9g/L。
实施例3在搅拌罐中混合培养粘红酵母和小球藻流加发酵生产微生物油脂
所用微生物为粘红酵母(同例1)和小球藻(Chlorella vulgaris)FACHB-Collection No.791(小球藻购自中国科学院典型培养物保藏委员会淡水藻种库)。
种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖4g；酵母粉0.15g；(NH4)2SO40.2g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
小球藻：NaNO31.5g；K2HPO4·3H2O 0.04g；MgSO4·7H2O 0.075g；CaCl2·2H2O 0.036g；柠檬酸0.006g；柠檬酸铁铵0.006g；EDTA 0.001g；Na2CO30.02g；A51mL；加水定容至1L。A5配方：H3BO32.86g；MnCl2·H2O 1.81g；ZnSO4·7H2O 0.222g；CuSO4·5H2O 0.079g；Na2MoO4·2H2O 0.390g；Co(NO3)2·6H2O 0.049g。
混合培养基为优化培养基，配方为：MgSO4·7H2O 1.5g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO47.0g/L；Na2SO41.0g/L；K2SO41.0g/L；NaCl 1.0g/L；NaNO32.0g/L；(NH4)2SO42.0g/L；脲2.0g/L；大豆蛋白胨10.0g/L；酵母粉6.0g/L；葡萄糖80.0g/L；糖蜜5.0g/L；FeSO4·7H2O 10mg/L；EDTA80mg/L；CaCl24mg/L；H3BO32.86mg/L；(NH4)6Mo7O240.02mg/L；MnCl2·4H2O 1.80mg/L；CuSO4·5H2O 0.125mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22mg/L。pH用氨水控制在5.5。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)小球藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌小球藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
(4)发酵培养：分别按10％(v/v)的接种量，将所得小球藻种子液和粘红酵母种子液接到装有2L无菌优化培养基的5L搅拌罐中，在温度30℃、无菌空气通气量2L/min、光强4000lx、搅拌转速300rpm的条件下培养144h，葡萄糖浓度低于10.0g/L时，开始流加葡萄糖，流加量为60g/L，并通过控制葡萄糖流加速率将其浓度保持在20g/L左右。
(5)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，结果如图二所示。用上述方法发酵生产油脂，在53h以后，总的生物量均在45g/L之上，保持较高菌体浓度，同时在132h达到最高，可达79.4g/L；在65h以后油脂产量均在6.5g/L之上，同时在132h达到最高，可达16.0g/L。
实施例4味精废水中粘红酵母和螺旋藻混合培养和单独培养生产油脂的比较
所用微生物为粘红酵母和钝顶螺旋藻(同例1)。种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖4g；酵母粉0.15g；(NH4)2SO40.2g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
味精废水制备发酵培养基：将味精废水(味精废水母液是一种低酸性高浓度有机废水，废水水质为：COD＝50000～70000mg/L，BOD5＝25000～35000mg/L，N-NH3＝8000～10000mg/L，含谷氨酸约1.5％，pH＝2～3。)离心沉淀去除不溶性颗粒后，稀释5倍，用0.1mol/L KOH将废水的pH值调节到5～6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
(4)发酵培养：按五种方式培养，即单独培养粘红酵母，接种量分别为10％和20％；单独培养钝顶螺旋藻，接种量分别为10％和20％；混合培养粘红酵母和螺旋藻，各自接种量为10％。在装有50mL无菌发酵培养基的250mL三角瓶中，温度30℃、光强4000lx、振荡速率180rpm的条件下培养120h。
(5)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法发酵生产油脂，接种10％粘红酵母的COD去除率为30.2％，油脂产量为13.0mg/L；接种20％粘红酵母的COD去除率为39.8％，油脂产量为38.1mg/L；接种10％螺旋藻的COD去除率为25.3％，油脂产量为24.8mg/L；接种20％螺旋藻的COD去除率为28.5％，油脂产量为25.6mg/L；混合培养的COD去除率为62.3％，油脂产量为215mg/L。混合培养的COD去除率明显高于两种微生物单独培养的，混合培养的油脂产量也远远高于两种微生物单独培养的。混合培养明显有利于油脂的积累，也利于废水COD的去除。
实施例5味精废水中斯达油脂酵母和螺旋藻混合培养和单独培养生产油脂的比较
所用微生物为斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi CGMCC No.2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)和钝顶螺旋藻(同例1)。种子液培养基配方为：
斯达氏油脂酵母：葡萄糖1.5g；酵母膏0.1g；(NH4)2SO40.25g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.2g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
味精废水制备发酵培养基：将味精废水离心沉淀去除不溶性颗粒后，稀释5倍，用0.1mol/LKOH将废水的pH值调节到5～6，灭菌待用。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)斯达氏油脂酵母菌种活化：将保藏的斜面斯达氏油脂酵母菌种在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斯达氏油脂酵母，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养28h，得到种子液；
(4)发酵培养：按五种方式培养，即单独培养斯达氏油脂酵母，接种量分别为10％和20％；单独培养钝顶螺旋藻，接种量分别为10％和20％；混合培养斯达氏油脂酵母和螺旋藻，各自接种量为10％。在装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，温度30℃、光强4000lx、振荡速率180rpm的条件下培养120h。
(5)发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法(GB/T5009.6-1985)提取微生物油脂。
经检测，用上述方法发酵生产油脂，接种10％斯达氏油脂酵母的COD去除率为28.5％，油脂产量为20.3mg/L；接种20％粘红酵母的COD去除率为37.1％，油脂产量为42.7mg/L；接种10％螺旋藻的COD去除率为26.1％，油脂产量为23.6mg/L；接种20％螺旋藻的COD去除率为28.4％，油脂产量为26.5mg/L；混合培养的COD去除率为56.8％，油脂产量为232mg/L。混合培养的COD去除率明显高于两种微生物单独培养的，混合培养的油脂产量也远远高于两种微生物单独培养的。混合培养明显有利于油脂的积累，也利于废水COD的去除。
实施例6气升式反应器中味精废水混合培养粘红酵母和螺旋藻流加发酵生产油脂
所用微生物为粘红酵母和钝顶螺旋藻(同例1)。种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖4g；酵母粉0.15g；(NH4)2SO40.2g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
味精废水制备发酵培养基：将味精废水离心沉淀去除不溶性颗粒后，稀释5倍，用0.1mol/LKOH将废水的pH值调节到5～6。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面粘红酵母菌种Rh.g CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
(4)发酵培养：按10％(v/v)的接种量，将所得粘红酵母种子液接到装有50L发酵培养基的60L敞口气升式反应器中，在温度30℃、通气量20L/min的条件下培养48h，然后按10％(v/v)的接种量，将所得螺旋藻种子液接到反应器中，在温度30℃、空气通气量20L/min的条件下再培养32h。为提高生物量和油脂产量，在发酵培养基中添加废葡萄糖母液，初始浓度为40g/L，然后流加废葡萄糖母液，控制流加速率将其浓度保持在10g/L左右。发酵时间自接种粘红酵母后80h结束。
经检测，用上述方法发酵生产油脂，生物量最高可达53g/L，油脂产量达到12.4g/L。每天跟踪监测发酵培养对废水的处理情况，COD降解可达50％。
实施例7气升式反应器中淀粉废水混合培养粘红酵母和螺旋藻批次发酵生产油脂
所用微生物为粘红酵母和钝顶螺旋藻(同例1)。种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖4g；酵母粉0.15g；(NH4)2SO40.2g；KH2PO40.7g；Na2SO40.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5。
钝顶螺旋藻：NaHCO316.8g；K2HPO40.5g；NaNO32.5g；NaCl 1.0g；MgSO4·7H2O 0.2g；K2SO41.0g；FeSO4·7H2O 10mg；EDTA 80mg；CaCl24mg；H3BO32.86mg；(NH4)6Mo7O240.02mg；MnCl2·4H2O 1.8mg；CuSO4·5H2O 0.125mg；ZnSO4·7H2O 0.22mg，用水定容至1L。
淀粉废水制备发酵培养基：将淀粉废水(淀粉废水主要含淀粉，还富含葡萄糖、果糖和麦芽糖等糖类物质，另外还含有蛋白质、纤维素以及氮、磷等无机物。废水水质为：CODcr＝10000～20000mg/L，BOD5＝5000mg/L，SS＝1000mg/L，pH＝5。)离心沉淀去除不溶性颗粒后，稀释2倍。
用本发明的方法发酵生产微生物油脂，具体方法包括以下步骤：
(1)螺旋藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌螺旋藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
(2)粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
(3)用接种针刮一环步骤(2)经活化的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
(4)发酵培养：按10％(v/v)的接种量，将所得粘红酵母种子液接到装有50L发酵培养基的60L敞口气升式反应器中，在温度30℃、通气量20L/min的条件下培养48h，然后按10％(v/v)的接种量，将所得螺旋藻种子液接到反应器中，在温度30℃、通气量20L/min的条件下再培养48h。为提高生物量和油脂产量，在发酵培养基中添加废葡萄糖母液，初始浓度为40g/L，并且流加废葡萄糖母液，控制流加速率将其浓度保持在10g/L左右。发酵时间自接种粘红酵母后96h结束
经检测，用上述方法发酵生产油脂，生物量最高可达46g/L，油脂产量达到11.7g/L。每天跟踪监测发酵培养对废水的处理情况，COD降解可达55％以上。
Claims (1)
1.混合培养酵母和藻类生产油脂的方法，其特征在于，
所用微生物为粘红酵母和小球藻（Chlorella vulgaris ）FACHB-Collection No.791
种子液培养基配方为：
粘红酵母：葡萄糖 4g；酵母粉 0.15g；(NH4)2SO4 0.2g；KH2PO40.7g； Na2SO4 0.2g；MgSO4·7H2O 0.15g，用水定容至100ml，调pH至5.5；
小球藻：NaNO3 1.5g；K2HPO4·3H2O 0.04g；MgSO4·7H2O 0.075g；CaCl2·2H2O 0.036g；柠檬酸 0.006g；柠檬酸铁铵 0.006g；EDTA 0.001g； Na2CO3 0.02g；A5 1mL；加水定容至1L；A5配方：H3BO3 2.86g；MnCl2·H2O 1.81g；ZnSO4·7H2O 0.222g；CuSO4·5 H2O 0.079g；Na2MoO4·2H2O 0.390g；Co(NO3)2·6H2O 0.049g；
混合培养基为优化培养基，配方为：MgSO4·7H2O 1.5g/L；K2HPO40.5g/L；KH2PO4 7.0g/L；Na2SO4 1.0g/L；K2SO4 1.0g/L；NaCl1.0g/L；NaNO3 2.0g/L；(NH4)2SO4 2.0g/L；脲2.0g/L；大豆蛋白胨10.0g/L；酵母粉6.0g/L；葡萄糖80.0g/L；糖蜜5.0g/L；FeSO4·7H2O 10mg/L；EDTA 80mg/L；CaCl2 4mg/L； H3BO3 2.86mg/L；(NH4)6Mo7O24 0.02mg/L；MnCl2·4H2O 1.80mg/L；CuSO4·5H2O 0.125mg/L；ZnSO4·7H2O 0.22mg/L，pH用氨水控制在5.5；
具体方法包括以下步骤：
（1）小球藻种子液的制备：取10ml悬液接种于装有90ml无菌小球藻培养基的250ml三角瓶中，在28℃，光强2000lx条件下，培养72h，得到种子液；
（2）粘红酵母菌种活化：将保藏的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258在28℃下活化12h；
（3）用接种针刮一环步骤（2）经活化的斜面粘红酵母菌种CGMCC No.2258，将其接种于装有50ml无菌种子液培养基的250ml三角瓶中，在30℃、140rpm下，振荡培养30h，得到种子液；
（4）发酵培养：分别按10%的接种量，将所得小球藻种子液和粘红酵母种子液接到装有2L无菌优化培养基的5L搅拌罐中，在温度30℃、无菌空气通气量2L/min、光强4000lx、搅拌转速300rpm的条件下培养144h，葡萄糖浓度低于10.0g/L时，开始流加葡萄糖，流加量为60g/L，并通过控制葡萄糖流加速率将其浓度保持在20 g/L；
（5）发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，烘干、研磨后用索氏提取法提取微生物油脂。
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