CN108587919A - 一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，属于环境工程和可再生生物能源技术领域。本发明的方法利用了小球藻和粘红酵母在气体和代谢物之间的相互作用，将小球藻与粘红酵母进行共培养，使得两者生产油脂的产量提高；本发明还针对小球藻与粘红酵母的共培养进行了一些培养基的优化，进一步提高了两者的生物量和生产油脂的产量。

Description

一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法
技术领域
本发明涉及一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，属于环境工程和可再生生物能源技术领域。
背景技术
目前，化石能源正面临枯竭的困境，寻找可持续再生、环境友好的新型能源势在必行，而通过含油微生物产生物油脂并转化为生物柴油以得到新型能源的方法近年来日益受到人们的关注。
常见的含油微生物一般为微藻、酵母菌、细菌和霉菌。
在这些含油微生物中，微藻的来源较多，其多数可广泛分布在江海湖泊，少数还可以在盐碱湖、滩涂和湿地等条件比较恶劣的环境生长。微藻类似日光驱动的细胞工厂，能将二氧化碳转化为有机物，光合效率高，生长速度快；可以多次收获藻体，不受季节限制；并且微藻还可以在光生物反应器中高密度、高速率的培养。经研究得知常见的含油微藻主要有葡萄藻(绿藻)、小球藻(绿藻)、杜氏藻(绿藻)、三角褐指藻(硅藻)。
酵母菌也有着独特的优势。它不仅是单细胞结构，具有离散脂质体质，较高的生长速率和积累脂质速率；同时，其产生的油脂适合作为生产生物柴油的原料；并且，其能在不同培养环境下独立生长，受环境因素变化的影响较小，具备一定条件可以一年四季进行连续生产。经研究发现的产油酵母主要有浅白色隐球酵母、弯隐球酵母、斯达氏油脂酵母、粘红酵母、茁芽丝抱酵母等。
但是，微藻与酵母菌在进行油脂积累时均存在一定的弊端。
微藻由于光合作用会释放出氧气，导致水体溶解氧浓度增加，而溶解氧浓度过高会抑制微藻的生长；酵母菌由于呼吸作用不断消耗O2释放出CO2，CO2会抑制酵母菌的有氧呼吸，使得其呼吸作用逐渐减弱，进而转为无氧呼吸，此时，会产生一些不利于酵母菌生长的物质，如醇类。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法。此方法为利用小球藻和粘红酵母在气体和代谢物之间的相互作用，将小球藻与粘红酵母进行共培养，使得两者生产油脂的产量提高；本发明还针对小球藻与粘红酵母的共培养进行了一些培养基的优化，进一步提高了两者的生物量和生产油脂的产量。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，所述方法为将小球藻(Chlorella vulgaris)进行藻种培养；将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)进行菌种培养；将藻种培养得到的小球藻与菌种培养得到的粘红酵母进行共培养；将共培养得到的细胞进行采收并干燥；从干燥后细胞进行油脂提取，即得生物油脂。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养为将小球藻接种至藻种培养基中，控制一定的温度、光照强度、转速，于光照摇床中培养一定的时间。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养中，小球藻的接种量为0.05～0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养中，小球藻的接种量为0.1g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养基的成分包含0.2～0.4g/L的NH4Cl、0.05～0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.01～0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.05～0.108g/L的K2HPO4、0.02～0.06g/L的KH2PO4、1～2.420g/L的NH2C(CH2OH)3、0.1～1mL/L的CH3COOH、0.5～1mL/L的微量元素储备液。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养基的成分包含0.4g/L的NH4Cl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.108g/L的K2HPO4、0.056g/L的KH2PO4、2.42g/L的NH2C(CH2OH)3、1mL/L的CH3COOH、1mL/L的微量元素储备液。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素储备液的成分包含10～60mg/L的Na2EDTA、10～30mg/L的ZnSO4·7H2O、10～60mg/L的CaCl2·2H2O、10～20mg/L的H3BO3、1～10mg/L的MnCl2·4H2O、1～10mg/L的FeSO4·7H2O、1～10mg/L的CoCl2·6H2O、1～10mg/L的CuSO4·5H2O、1～10mg/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O、1～20mg/L的KOH。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素储备液的成分包含50mg/L的Na2EDTA、22mg/L的ZnSO4·7H2O、50mg/L的CaCl2·2H2O、11.4mg/L的H3BO3、5.06mg/L的MnCl2·4H2O、4.99mg/L的FeSO4·7H2O、1.61mg/L的CoCl2·6H2O、1.57mg/L的CuSO4·5H2O、1.1mg/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O、16mg/L的KOH。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养的温度为20～30℃、光暗时间比为1～2:1、光照强度为4000～8000LUX、转速为100～150r/min、时间为2～3d。
在本发明的一种实施方式中，所述藻种培养的温度为27℃、光照强度为6000LUX、转速为150r/min、光暗时间比为2:1、时间为2d。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养为将粘红酵母接种至菌种培养基中，控制一定的温度、光暗时间比、转速，于光照摇床中培养一定的时间。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养中，粘红酵母的接种量为0.1～0.3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养中，粘红酵母的接种量为0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养基的成分包含1～20g/L的葡萄糖、1～2g/L的(NH4)2SO4、0.5～1g/L的酵母提取物、0.5～1.5g/L的MgSO4·7H2O、1～2g/L的NaSO4、1～7g/LKH2PO4，pH为5～6。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养基的成分包含15g/L的葡萄糖、2g/L的(NH4)2SO4、1g/L的酵母提取物、1.5g/L的MgSO4·7H2O、2g/L的NaSO4、7g/LKH2PO4，pH为5.5。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养的温度为25～35℃、转速为100～150r/min、时间为2～3d。
在本发明的一种实施方式中，所述菌种培养的温度为30℃、转速为150r/min、时间为2d。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养为将小球藻与粘红酵母共同接种至共培养培养基，控制一定的温度、光暗时间比、光照强度、转速，于光照摇床中培养一定的时间
在本发明的一种实施方式中，所述共培养中，小球藻的接种量为0.01～0.2g/L、粘红酵母的接种量为0.1～0.5g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养中，小球藻的接种量为0.1g/L、粘红酵母的接种量为0.2g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养培养基的成分包含0.2～0.4g/L的NH4Cl、0.05～0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.01～0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.05～0.108g/L的K2HPO4、0.02～0.06g/L的KH2PO4、1～2.420g/L的NH2C(CH2OH)3、0.1～1mL/L的CH3COOH、0.5～1mL/L的微量元素储备液以及0～15g/L的有机碳源。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养培养基的成分包含0.4g/L的NH4Cl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.108g/L的K2HPO4、0.056g/L的KH2PO42.42g/L的NH2C(CH2OH)3、1mL/L的CH3COOH、1mL/L的微量元素储备液以及7g/L的有机碳源。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素储备液的成分包含10～60mg/L的Na2EDTA、10～30mg/L的ZnSO4·7H2O、10～60mg/L的CaCl2·2H2O、10～20mg/L的H3BO3、1～10mg/L的MnCl2·4H2O、1～10mg/L的FeSO4·7H2O、1～10mg/L的CoCl2·6H2O、1～10mg/L的CuSO4·5H2O、1～10mg/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O、1～20mg/L的KOH。
在本发明的一种实施方式中，所述微量元素储备液的成分包含50mg/L的Na2EDTA、22mg/L的ZnSO4·7H2O、50mg/L的CaCl2·2H2O、11.4mg/L的H3BO3、5.06mg/L的MnCl2·4H2O、4.99mg/L的FeSO4·7H2O、1.61mg/L的CoCl2·6H2O、1.57mg/L的CuSO4·5H2O、1.1mg/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O、16mg/L的KOH。
在本发明的一种实施方式中，所述有机碳源为葡萄糖。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养为将小球藻与粘红酵母共同接种至共培养培养基，控制一定的温度25～30℃、光暗时间比为1～2:1、光照强度为4000～6000LUX、转速为100～150r/min，于光照摇床中培养一定的时间。
在本发明的一种实施方式中，所述共培养为将小球藻与粘红酵母共同接种至共培养培养基，控制一定的温度30℃、光暗比为2:1、光照强度为6000LUX、转速为150r/min，于光照摇床中培养一定的时间。
在本发明的一种实施方式中，所述采收为将共培养得到的培养液进行离心，得到细胞沉淀。
在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为3000～4000r/min、时间为5～10min。
在本发明的一种实施方式中，所述离心的转速为4000r/min、时间为10min。
在本发明的一种实施方式中，所述干燥为通过冷冻干燥或喷雾干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述提取为通过氯仿甲醇提取法进行提取。
在本发明的一种实施方式中，所述氯仿与甲醇的比例在2:1、超声的时间为40min、抽提的次数为3次、烘干的温度为105℃。
本发明提供了上述一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法生产得到的生物油脂。
本发明提供了上述一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法在生产油脂、生产柴油方面的应用。
有益效果：
(1)本发明利用小球藻和粘红酵母在气体和代谢物之间的相互作用，将小球藻与粘红酵母进行共培养，使得两者生产油脂的产量提高，最高可将产量提升至162.2mg/L，比小球藻单独培养时的产量提高40.5mg/L，比粘红酵母单独培养时的产量提高79.5mg/L；
(2)本发明还针对小球藻与粘红酵母的共培养进行了一些培养基的优化，进一步提高了两者的生物量和生产油脂的产量，可将生物量提高至3.85g/L，产量提高至960mg，比小球藻单独培养时分别提高3.08g/L、838.3mg/L，比粘红酵母单独培养时分别提高2.91g/L、877.3mg/L；
(3)利用本发明的方法生产油脂，产量高，且具有可持续再生、环境友好的优势。
附图说明
图1微藻与酵母单独培养与共培养的生物量积累和油脂含量的对比；
其中，A，普通小球藻、Y，粘红酵母、A+Y，普通小球藻与粘红酵母共培养；
图2不同葡萄糖浓度下微藻与酵母共培养的生长曲线；
图3不同浓度葡萄糖对共培养的生物积累，油脂含量和油脂产量的影响；
图4有机碳源浓度为7g/L时葡萄糖，乙酸钠，甘油生物量与油脂产量的对比。
具体实施方式
下面通过具体实施例和对比例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
生物量检测方法：取培养液5mL，经烘干至恒重的0.22μm滤膜进行抽滤，将抽滤好的滤膜放在105℃的电热恒温烘箱中进行烘干至恒重(质量记为M0)，取出烘干好的滤膜放在干燥器中进行冷却并称量(质量记为M1)，生物量的干重为滤膜前后的质量差，重复操作三次。
计算公式：
M＝(M1-M0)×200(单位：gL-1)
油脂产量检测方法：将冷冻干燥得到的固体在玛瑙研钵中研磨成粉末，准确称取50.00mg的粉末，在通风橱中将50.00mg粉末与5毫升氯仿/甲醇(V氯仿：V甲醇＝2:1)混合，超声40min使其充分混合，将混合物放置在5mL离心管中，在6000r/min的转速下离心10min，收集得到的溶剂相，放置在已经烘干至恒重的锥形瓶(w1)中，重复提取三次.将装有提取液的锥形瓶放在105℃烘箱中进行烘干恒重(w2)。
油脂含量的计算：
P(％，dcw)＝[(w2-w1)/0.05]×100
下述实施例中涉及的培养基如下：
藻种培养基：0.4g/L的NH4Cl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.108g/L的K2HPO4、0.056g/L的KH2PO4、2.42g/L的NH2C(CH2OH)3、1mL/L的CH3COOH、1mL/L的微量元素储备液。
菌种培养基：15g/L的葡萄糖、2g/L的(NH4)2SO4、1g/L的酵母提取物、1.5g/L的MgSO4·7H2O、2g/L的NaSO4、7g/LKH2PO4、pH调节至5.5。
共培养培养基：.4g/L的NH4Cl、0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.108g/L的K2HPO4、0.056g/L的KH2PO42.42g/L的NH2C(CH2OH)3、1mL/L的CH3COOH、1mL/L的微量元素储备液以及7g/L的有机碳源。
实施例1：
向装有300mL小球藻藻种培养基的锥形瓶接种0.1g/L小球藻，放置在温度27℃、光照强度为6000LUX、转速为150r/min、光暗时间比为2:1的光照摇床中培养2d作为小球藻藻种。
向装有300mL粘红酵母菌种培养基的锥形瓶接种0.2g/L粘红酵母，放置在温度30℃、转速为150r/min的光照摇床中培养2d作为粘红酵母菌种。
将得到的小球藻藻种以0.08g/L的接种量接入到含有300mL共培养基(不加有机碳源)的锥形瓶中，将锥形瓶放置在光照摇床中，摇床参数设置为光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min。在培养的不同时间，测定微生物的干重，在最高生物量获得时采收并进行油脂测量。
将得到的粘红酵母菌种以0.16g/L的接种量接入到含有300mL共培养基(不加有机碳源)的锥形瓶中，将锥形瓶放置在光照摇床中，摇床参数设置为光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min。在培养的不同时间，测定微生物的干重，在最高生物量获得时采收并进行油脂测量。
将得到的小球藻藻种与粘红酵母菌种分别以0.08g/L、0.16g/L的接种量接入到含有300mL共培养基(不加有机碳源)的锥形瓶中，将锥形瓶放置在光照摇床中，摇床参数设置为光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min。
在培养的不同时间，测定微生物的干重，在最高生物量获得时采收并进行油脂测量。
结果如图1所示，小球藻单独培养获得最大生物量0.72g/L，油脂含量为16.9％，油脂产量为121.7mg/L。粘红酵母单独培养获得最大生物量0.94g/L，油脂含量为8.8％，油脂产量为82.7mg/L。小球藻与粘红酵母共培养获得最大生物量0.78g/L，油脂含量为20.8％，油脂产量为162.2mg/L。小球藻与粘红酵母共培养的油脂含量相对于小球藻与粘红酵母单独培养分别提高了3.9％、12％，油脂产量分别增加40.5mg/L、79.5mg/L。
实施例2：
向装有300mL小球藻藻种培养基的锥形瓶接种0.1g/L小球藻，放置在温度27℃、光照强度为6000LUX、转速为150r/min、光暗时间比为2:1的光照摇床中培养2d作为小球藻藻种。
向装有300mL粘红酵母菌种培养基的锥形瓶接种0.2g/L粘红酵母，放置在温度30℃、转速为150r/min的光照摇床中培养2d作为粘红酵母菌种。
将得到的小球藻与粘红酵母分别以0.12g/L、2g/L的接种量接入分别有机碳源为葡萄糖的共培养基中，葡萄糖的浓度分别为0、2、5、7、10g/L，放置在光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min的光照摇床中。
检测油脂产量与生物量。
结果如图2所示，前24h不同葡萄糖浓度下共培养的生长曲线变化相似，呈增长趋势。当葡萄糖浓度为2g/L时，从第36h起，共培养的生长速度缓慢，并在48h获得最大生物量2.12g/L。从图中也可以看出当葡萄糖浓度为5g/L和10g/L的生长曲线变化相似，都在48h获得最大生物量分别为3.4g/L和3.62g/L。然而最高生物量是在葡萄糖浓度为7g/L时获得为4.2g/L。当葡萄糖浓度在2g/L，5g/L和7g/L时，在反应后期葡萄糖皆被利用完，唯有葡萄糖浓度为10g/L时在96h时仍剩余。
如图3所示当加入的葡萄糖浓度在2、5、7、10g/L时，共培养的油脂含量分别为17.03％、24.66％、25.01％、25.65％，油脂产量分别是0.32g/L，0.75g/L，0.96g/L，0.83g/L。在葡萄糖浓度为7g/L时获得最大油脂产量，比小球藻单独培养时提高838.3mg/L，比粘红酵母单独培养时分别提高2.91g/L、877.3mg/L，比未加葡萄糖菌藻共培养组提高800mg/L。
实施例3：
向装有300mL小球藻藻种培养基的锥形瓶接种0.1g/L小球藻，放置在温度27℃、光照强度为6000LUX、转速为150r/min、光暗时间比为2:1的光照摇床中培养2d作为小球藻藻种。
向装有300mL粘红酵母菌种培养基的锥形瓶接种0.2g/L粘红酵母，放置在温度30℃、转速为150r/min的光照摇床中培养2d作为粘红酵母菌种。
将得到的小球藻与粘红酵母分别以0.12g/L、0.22g/L的接种量接入有机碳源为乙酸钠的共培养培养基中，乙酸钠浓度为7g/L，放置在光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min的光照摇床中。
检测油脂产量与生物量。
如图4所示向共培养基中加入7g/L乙酸钠获得生物量为2.74g/L，油脂产量为0.52g/L，相对于7g/L葡萄糖组，生物量减少1.11g/L，油脂产量减少440mg/L。
实施例4：
向装有300mL小球藻藻种培养基的锥形瓶接种0.1g/L小球藻，放置在温度27℃、光照强度为6000LUX、转速为150r/min、光暗时间比为2:1的光照摇床中培养2d作为小球藻藻种。
向装有300mL粘红酵母菌种培养基的锥形瓶接种0.2g/L粘红酵母，放置在温度30℃、转速为150r/min的光照摇床中培养2d作为粘红酵母菌种。
将得到的小球藻与粘红酵母分别以0.12g/L、0.22g/L的接种量接入有机碳源为甘油的共培养培养基中，甘油浓度为7g/L，放置在光暗比为2:1，温度为30℃，光照强度为6000lux，转速为150r/min的光照摇床中。
检测油脂产量与生物量。
如图4所示向共培养基中加入7g/L甘油获得生物量为2.32g/L，油脂产量为0.29g/L，相对于7g/L葡萄糖组，生物量减少1.53g/L，油脂产量减少670mg/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述方法为将小球藻(Chlorella vulgaris)进行藻种培养；将粘红酵母(Rhodotorula glutinis)进行菌种培养；将藻种培养得到的小球藻与菌种培养得到的粘红酵母进行共培养；将共培养得到的细胞进行采收并干燥；从干燥后细胞进行油脂提取，即得生物油脂。
2.如权利要求1所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述藻种培养为将小球藻接种至藻种培养基中，控制一定的温度、光照强度、转速，于光照摇床中培养一定的时间。
3.如权利要求1或2所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述藻种培养基的成分包含0.2～0.4g/L的NH4Cl、0.05～0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.01～0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.05～0.108g/L的K2HPO4、0.02～0.06g/L的KH2PO4、1～2.420g/L的NH2C(CH2OH)3、0.1～1mL/L的CH3COOH、0.5～1mL/L的微量元素储备液。
4.如权利要求1-3任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述微量元素储备液的成分包含10～60mg/L的Na2EDTA、10～30mg/L的ZnSO4·7H2O、10～60mg/L的CaCl2·2H2O、10～20mg/L的H3BO3、1～10mg/L的MnCl2·4H2O、1～10mg/L的FeSO4·7H2O、1～10mg/L的CoCl2·6H2O、1～10mg/L的CuSO4·5H2O、1～10mg/L的(NH4)6Mo7O24·4H2O、1～20mg/L的KOH。
5.如权利要求1-4任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述菌种培养为将粘红酵母接种至菌种培养基中，控制一定的温度、光暗时间比、转速，于光照摇床中培养一定的时间。
6.如权利要求1-5任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述菌种培养基的成分包含1～20g/L的葡萄糖、1～2g/L的(NH4)2SO4、0.5～1g/L的酵母提取物、0.5～1.5g/L的MgSO4·7H2O、1～2g/L的NaSO4、1～7g/LKH2PO4，pH为5～6。
7.如权利要求1-6任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述共培养为将小球藻与粘红酵母共同接种至共培养培养基，控制一定的温度、光暗时间比、光照强度、转速，于光照摇床中培养一定的时间。
8.如权利要求1-7任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法，其特征在于，所述共培养培养基的成分包含0.2～0.4g/L的NH4Cl、0.05～0.1g/L的MgSO4·7H2O、0.01～0.05g/L的CaCl2·2H2O、0.05～0.108g/L的K2HPO4、0.02～0.06g/L的KH2PO4、1～2.420g/L的NH2C(CH2OH)3、0.1～1mL/L的CH3COOH、0.5～1mL/L的微量元素储备液以及0～15g/L的有机碳源。
9.如权利要求1-8任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法生产得到的生物油脂。
10.权利要求1-8任一所述的一种通过共培养小球藻和粘红酵母生产生物油脂的方法在生产油脂、生产柴油方面的应用。
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