CN105648023B

CN105648023B - 一种微藻混合培养制备油脂的方法

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Publication number: CN105648023B
Application number: CN201410731093.5A
Authority: CN
Inventors: 师文静; 廖莎; 姚新武; 樊亚超; 孙启梅; 王领民; 高大成; 李晓姝
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2019-01-25
Anticipated expiration: 2034-12-05
Also published as: CN105648023A

Abstract

本发明公开了一种微藻混合培养制备油脂的方法，包括如下内容：（1）将微藻培养基与斜生栅藻FSH‑Y2种子液加入到光生物反应器中，调节培养体系的pH值为10～12，通入气体中CO₂的含量控制在5v%以下，培养2～5天；（2）调节培养体系的pH值为8～10，接入纤维藻SS‑B7种子液进行混合培养，通入气体中CO₂含量为5v%～45v%；（3）培养至生长稳定期结束，收获微藻细胞；所述斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）FSH‑Y2和纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS‑B7，分别于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号分别为CGMCC No.6551和CGMCC No.7478。本发明方法提高了微藻培养体系对高浓度CO₂的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高，能够进行生物柴油的生产。

Description

一种微藻混合培养制备油脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术和生物能源领域，具体涉及一种能够耐受高浓度CO₂并在碱性环境下微藻混合培养制备油脂的方法。

背景技术

由于化石能源的日趋减少和使用化石能源造成温室效应的增加，越来越多的科研工作者把目光集中到可再生能源的开发和利用上。生物质能作为地球上最重要的可再生能源，它包括林业生物质、农作物、水生植物、农业废弃物等。在诸多的生物质能源中，微藻是重要的可再生资源。它们具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、生物量产量高等特点。其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂。微藻的太阳能转化效率可达到3.5%，是生产药品、精细化工品和新型燃料的潜在资源，从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲脂，即生物柴油。

随着世界经济的发展，大量的化石能源的使用和消耗，导致能源的短缺和环境的日益恶化，特别是CO₂的急剧增加引起的温室效应越来越严重，微藻的生长周期短、光合效率高，CO₂固定效率高，一定条件下可达陆生植物的10 倍以上，不仅可以减少CO₂排放，同时也降低了培养成本；除CO₂外，废气中的一些SOx、NOx 等成分也随着微藻的代谢被净化处理，有效减少有害气体排放，因此利用微藻油脂作为原料生产的生物柴油是目前最有可能满足世界运输所需燃料的可再生能源。

目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN20110144545.6公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO₂的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN20120154470.4公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsis gaditana )藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN20111019480.X公开了一株微藻藻株（Mychonases sp .）及其用于生产生物柴油的应用，利用该藻株可生产高附加值的多不饱和脂肪酸，包括亚麻酸 C18:3和神经酸C24:1，其在获得生物柴油的同时，获得高附加值的副产品。这些专利都未涉及藻种对二氧化碳的耐受性。CN102703326A公开了一种高CO₂耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。上述专利要么不能高效利用CO₂生产油脂，要么获得的生物质中油脂含量不够高。特别是在实际应用中，当环境中CO₂体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，而微藻利用CO₂一般是以溶解在水中的HCO₃ ^-离子形式存在的，二氧化碳在中性环境下溶解度低，不利于藻类吸收利用。

刘平怀等（有机碳源对单针藻细胞生长、油脂积累和光合作用的影响，生物工程,2012, 33(18): 224-246）介绍了利用有机碳源培养单针藻的一种生产方式，培养结束虽然生物量超过了10g/L，但该种方式为单针藻异养培养方式，培养过程中利用葡萄糖等有机碳源来实现细胞生长，这种培养方式没有利用CO₂等无机碳源经济，而且有机碳源的加入，在培养过程易产生染菌问题，影响藻细胞的生长。

发明内容

针对现有藻种不能满足耐受和吸收高浓度CO₂，固定CO₂效率低的问题，本发明提供了一种能够耐受高浓度CO₂并在碱性环境下微藻混合培养制备油脂的方法。本发明方法提高了微藻培养体系对高浓度CO₂的耐受性和溶解性，提高了固碳效率，微藻油脂的收获量明显提高，能够进行生物柴油的生产。

本发明微藻混合培养制备油脂的方法，包括如下内容：（1）将微藻培养基与斜生栅藻FSH-Y2种子液加入到光生物反应器中，调节培养体系的pH值为10～12，通入气体中CO₂的含量控制在5v%以下，培养2～5天；（2）调节培养体系的pH值为8～10，接入纤维藻SS-B7种子液进行混合培养，通入气体中CO₂含量为5v%～45v%，；（3）培养至生长稳定期结束，收获微藻细胞；所述的斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）FSH-Y2和纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS-B7，分别于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号分别为CGMCC No. 6551和CGMCC No. 7478。

本发明所述FSH-Y2藻株在显微镜下藻细胞呈纺锤形，丛生，有细胞壁膜包裹，颜色为深绿色；单个藻细胞直径约为6～10μm。该藻株在高pH值下能够更好的吸收利用二氧化碳，快速生长繁殖。

本发明所述纤维藻SS-B7藻株是一种淡水绿藻，在显微镜下藻细胞为绿色，镰形或弓形、丛生、弯曲，自中央向两端渐尖细，末端尖，长大约5～6μm，中央宽约2μm。该藻株能够耐受高浓度的CO₂和NOx，可以利用含CO₂和NOx的废气或烟气进行光照自养生长获取富含油脂的生物质，固碳效率高。

本发明中，微藻培养基采用本领域人员熟知的BG11、SE、BBM等培养微藻的液体培养基。斜生栅藻FSH-Y2种子液的制备如下：将培养基的pH调节为10～12，在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至对数生长期。光生物反应器中加入的斜生栅藻FSH-Y2种子液与培养基的体积比1:10～1:5，通入气体为二氧化碳和氮气，其中CO₂的含量控制在3v%～5v%。

本发明中，纤维藻SS-B7种子液的制备如下：将培养基的pH调节为7～9，在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至对数生长期；纤维藻SS-B7种子液与培养基的体积比为1:20～1:10。混合培养的培养温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux。通入气体优选使用含CO₂的废气或烟气，其中CO₂含量为10v%～45v%，NOx含量为100×10^-6～500×10^-6（v/v）。混合培养至生长稳定期结束，通过离心、沉降等方式收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到12g/L以上，油脂含量可达到细胞干重的45%以上。

与现有技术相比，本发明可以带来以下有益效果：

1、本发明采用两步法接入不同的微藻种子液进行混合培养，反应初期接入耐受高pH的斜生栅藻FSH-Y2藻株在碱性条件下生长，可以抑制微藻培养初期杂菌和病虫害的生长，使微藻处于生长优势；同时高pH培养有利于通入高浓度二氧化碳的溶解，使二氧化碳更容易被微藻吸收利用，有助于提高二氧化碳的固定效率；

2、在利用二氧化碳和光照获得生物质的培养过程中，微藻混合培养并非是微藻单独培养的简单组合，这两种藻种互相配合，比单一藻种具有更高的的固碳效率和获取更多的生物质和油脂含量；

3、本发明的混合培养体系能够耐受高浓度的CO₂和NOx，可以利用废气中的CO₂进行自养生长，固定CO₂，缓解目前工业社会带来的温室效应和废气污染问题。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。本发明中，wt%为质量分数，v%为体积分数。

实施例1 微藻种子液的制备

微藻培养采用BG11培养基，培养基配方如表1和表2所示。

表1 BG11培养基

*表2 表1中A5+Co solution的组成

首先按照表1和表2制备BG11液体培养基，将培养斜生栅藻FSH-Y2的培养基的pH调节为10，将培养纤维藻SS-B7的培养基的pH调节为7.5，然后将斜生栅藻FSH-Y2和纤维藻SS-B7分别接种于上述培养基中。在恒温光照摇床中培养，培养温度为25℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为5000Lux，120rpm振荡培养至对数生长期，获得斜生栅藻FSH-Y2种子液和纤维藻SS-B7种子液，将上述种子液在15℃弱光下保存备用。

实施例2 微藻油脂的制备

（1）在光生物反应器中，加入实施例1制备的FSH-Y2种子液和微藻培养基，FSH-Y2种子液与培养基的体积比为1:5，培养基采用BG11培养基，培养基的pH值控制为10，培养的光照强度为5000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为5v%。

（2）培养2天后，接入实施例1制备的纤维藻SS-B7种子液，种子液与培养基的体积比为1:20，培养基的pH控制在8，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中CO₂含量为30v%。

（3）培养7天后进入稳定期，结束培养，离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量。在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测细胞干重可达到13.3g/L，油脂含量为细胞干重的46.6%。

实施例3 微藻油脂的制备

（1）在光生物反应器中，加入实施例1制备的FSH-Y2种子液和微藻培养基，FSH-Y2种子液与培养基的体积比为1:10，培养基采用BG11培养基，培养基的pH值控制为12，培养的光照强度为5000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为5v%。

（2）培养3天后，接入实施例1制备的纤维藻SS-B7种子液，种子液与培养基的体积比为1:20，培养基的pH控制在10，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中CO₂含量为25v%。

（3）培养7天后进入稳定期，结束培养，离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测细胞干重可达到12.4g/L，油脂含量为细胞干重的45.7%。

实施例4 微藻油脂的制备

（1）在光生物反应器中，加入实施例1制备的FSH-Y2种子液和微藻培养基，FSH-Y2种子液与培养基的体积比为1:5，培养基采用BG11培养基，培养基的pH值控制为11，培养的光照强度为5000Lux，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中二氧化碳含量为4v%。

（2）培养4天后，接入实施例1制备的纤维藻SS-B7种子液，种子液与培养基的体积比为1:10，培养基的pH控制在9，通入氮气和二氧化碳的混合气体，其中CO₂含量为40v%。

（3）培养8天后进入稳定期，结束培养，离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷：乙酸乙酯法测得总脂含量。经检测细胞干重可达到12.6g/L，油脂含量为细胞干重的46.1%。

实施例5 利用烟气制备微藻油脂

制备条件与实施例2相同，不同之处在于步骤（2）通入气体更换为含NO、NO₂和CO₂的烟气，烟气中CO₂的含量为10v%～45v%，NO和NO₂含量为100×10^-6～500×10^-6（v/v）。

斜生栅藻FSH-Y2种子液、纤维藻SS-B7种子液单独培养时的接种量为20%；混合培养时，斜生栅藻FSH-Y2种子液和纤维藻SS-B7种子液的接种量分别为培养基体积的5%和15%。单独培养条件与混合培养的条件相同，开始维持pH为10，培养3天后，通入含NO_x和CO₂的烟气，烟气中CO₂的含量为10v%～45v%，NO_x含量为100×10^-6～500×10^-6（v/v），维持反应体系的pH为9。

培养8天后进入稳定期，结束培养，离心收集藻细胞，在-60℃条件下真空冷冻干燥至恒重后测量藻粉干重，计算生物质产量，并采用正己烷:乙酸乙酯法测得总脂含量，结果如表3所示。

表3混合培养与单一藻的培养效果

由表3可见，相对于单一藻，两步法混合培养不仅可以耐受高浓度的CO₂，而且可以耐受一定浓度的SO₂，获得了更高的生物量和油脂含量。由此可见，可以利用两步法混合培养及烟气制备微藻油脂，即实现了油脂的生产，同时可以净化废气。

比较例1微藻油脂的制备

制备条件与实施例2相同，不同之处在于FSH-Y2种子液和纤维藻SS-B7种子液在培养起始加入反应器中。培养7天后进入稳定期，结束培养，离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到11.1g/L，油脂含量为细胞干重的45.5%。

比较例2微藻油脂的制备

制备条件与实施例2相同，不同之处在于FSH-Y2种子液和纤维藻SS-B7的种子液在培养起始加入反应器中。培养7天后进入稳定期，结束培养，离心收获微藻细胞，测定细胞干重和油脂含量，细胞干重可达到11.3g/L，油脂含量为细胞干重的43.6%。

Claims

1.一种微藻混合培养制备油脂的方法，其特征在于包括如下内容：（1）将微藻培养基与斜生栅藻FSH-Y2种子液加入到光生物反应器中，调节培养体系的pH值为10～12，通入气体中CO₂含量的体积分数控制在5%以下，培养2～5天；（2）调节培养体系的pH值为8～10，接入纤维藻SS-B7种子液进行混合培养，通入气体中CO₂含量的体积分数为5%～45%；（3）培养至生长稳定期结束，收获微藻细胞；所述斜生栅藻（Scenedesmus obliqnus）FSH-Y2和纤维藻（Ankistrodesmus sp.）SS-B7，分别于2012年9月11日和2013年4月15日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏编号分别为CGMCC No. 6551和CGMCC No.7478。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）斜生栅藻FSH-Y2种子液的制备方法如下：将培养基的pH调节为10～12，在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至对数生长期。

3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）光生物反应器中加入的斜生栅藻FSH-Y2种子液与培养基的体积比为1:10～1:5。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：微藻培养基采用BG11、SE或BBM液体培养基。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）通入气体为二氧化碳和氮气，其中CO₂含量的体积分数控制在3%～5%。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维藻SS-B7种子液的制备方法如下：将培养基pH调节为7～9，在温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux，振荡培养至对数生长期；纤维藻SS-B7种子液与培养基的体积比为1:20～1:10。

7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述混合培养的温度为20～30℃，光照周期为24h，光暗时间比为14:10，光照强度为2000～10000Lux。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述通入气体为废气或烟气，其中CO₂含量的体积分数为10%～45%，NOx含量为100×10^-6～500×10^-6（v/v）。