CN117660189B - 一种微藻混合培养生产油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微藻混合培养生产油脂的方法，属于生物技术领域，具体涉及采用木糖和2‑呋喃甲酰肼在乙酸的催化作用下反应制备得到木糖衍生物，然后与其他碳源试剂、无机盐混合于水中，制备得到强化培养液，碳源试剂还包括葡萄糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠，本发明发现由木糖和2‑呋喃甲酰肼制成木糖衍生物后，将其与其他碳源试剂、无机盐混合后，得到强化培养液，对微藻进行强化培育后，最后可以将强化培育后的微藻应用废液处理中。本发明中微藻经强化培养液培养后，可以提高微藻的生物增长率；然后强化培养后的微藻应用于待处理废液中，可以提高微藻中油脂含量。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微藻混合培养生产油脂的方法。
背景技术
目前对于小球藻、栅藻等产油微藻研究的较多。CN102250773A公开了一株栅藻藻株，该藻株的生长可利用人工培养基或经适当处理的废水生长，其特点是油脂产率高于目前大多数分藻株，该藻株应用领域包括CO2的固定，废水的净化，油脂、蛋白质、色素、淀粉、多糖、核酸的生产。CN102660464A公开了一株富油海洋微藻微拟球藻(Nannochloropsisgaditana)藻株及其应用，该藻株可在pH=4.5的环境下正常生长，其油脂含量可达35%。CN102703326A公开了一种高CO2耐受性和固定率的微藻及其选育方法，但该专利所提供的藻株并未涉及该藻株的油脂含量。在实际应用中，当环境中CO2体积分数大于5v%时，大部分微藻的生长将受到抑制，固碳效率低；同时一般微藻在中性条件下适宜生长，在偏酸性或者偏碱性的条件下不利于微藻的生长，且微藻的产油效果一般。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高微藻生物增长率且微藻产油量高的微藻混合培养生产油脂的方法。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种微藻混合培养生产油脂的方法，包括：由强化培养液对微藻进行强化培养得到强化微藻，然后将强化微藻应用于待处理废液进行混合培养，最后收集混合培养的微藻，分离油脂；所述强化培养液中含有木糖衍生物，木糖衍生物中具有2-呋喃甲酰肼结构。本发明由2-呋喃甲酰肼与木糖反应制备得到一种木糖衍生物，通过将木糖衍生物加入适用培育微藻的培养液中，可以提高微藻的生长性能，提高微藻产量，并且在进一步的产油测试中，由含有木糖衍生物的培养液培养得到的微藻，其油脂含量进一步提高，表明本发明制备得到的木糖衍生物并非仅仅起到碳源的作用，其还以刺激微藻，从而提高微藻的产量及产油性能。
优选地，强化培养液包括碳源试剂和无机盐，碳源试剂包括葡萄糖；或，所述待处理废液中含有厨余废液、城市污水或畜牧业沼液；或，所述微藻包括栅藻和/或小球藻。
更优选地，碳源试剂为葡萄糖和木糖衍生物，木糖衍生物的量为葡萄糖的5-20wt%；或，所述无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙和碳酸钠；或，所述强化培养中，微藻的接种量为10-40wt%。
优选地，木糖衍生物的制备中，由木糖和2-呋喃甲酰肼在催化剂作用下反应制成木糖衍生物。
优选地，木糖衍生物的制备溶剂为乙醇；或，所述催化剂为乙酸，乙酸的使用量为木糖的40-80wt%；或，所述2-呋喃甲酰肼的使用量为木糖的1-3wt%。
优选地，强化培养中，将微藻接种到强化培养液中，调节pH为中性，生长培养得到强化微藻；或，所述强化培养中，光照强度2000-3000 lux，温度20-35℃，转速100-200 rpm，光暗比8-16h：16-8h，培养时间3-7d。
优选地，微藻混合培养生产油脂中，将厨余废液、稀释剂和强化微藻混合于光生物反应器中，培养至生长稳定期结束，收集混合微藻。
更优选地，微藻混合培养生产油脂中，稀释剂为水，厨余废液的使用量为稀释剂的10-30wt%。
更优选地，微藻混合培养生产油脂中，强化微藻为强化栅藻和强化小球藻。
更优选地，微藻混合培养生产油脂中，强化栅藻的接种量为厨余废液的10-50wt%。
更优选地，微藻混合培养生产油脂中，强化小球藻的接种量为厨余废液的10-50wt%。
本发明公开了一种木糖衍生物，所述木糖衍生物中具有2-呋喃甲酰肼键合基团。
优选地，木糖衍生物的制备中，将木糖和2-呋喃甲酰肼加入乙醇中，然后加入催化剂，回流反应2-6h，TLC监测反应，反应完成后，冷却，抽滤，干燥，得到木糖衍生物。
更优选地，木糖衍生物的制备中，木糖的使用量为乙醇的1-4wt%。
更优选地，木糖衍生物的制备中，2-呋喃甲酰肼的使用量为木糖的1-3wt%。
更优选地，木糖衍生物的制备中，催化剂为乙酸，乙酸的使用量为木糖的40-80wt%。
本发明公开了一种强化培养液，包括上述木糖衍生物。
优选地，强化培养液的制备中，将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖和木糖衍生物，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。
更优选地，强化培养液的制备中，葡萄糖的使用量为水的0.5-2wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，木糖衍生物的使用量为葡萄糖的5-20wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，硝酸钠的使用量为葡萄糖的4-12wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.2-0.6wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.3-1.4wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.1-0.5wt%。
更优选地，强化培养液的制备中，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.1-0.4wt%。
更优选地，强化培养液中还可以加入乙酰丙酸苯腙内酰胺，乙酰丙酸苯腙内酰胺的使用量为葡萄糖的2-10wt%。本发明进一步发现，在木糖衍生物的使用下，同时使用乙酰丙酸苯腙内酰胺共同用于微藻的培育，然后再应用于产油处理即废水处理中，可以提高微藻的产油量，微藻可以由多种微藻共同混合。
本发明公开了一种强化微藻的培育方法，包括：将微藻接种于上述强化培养液中，培育得到强化微藻。
优选地，强化微藻的培育中，将微藻接种到强化培养液中，调节pH为中性，生长培养得到强化微藻。
更优选地，强化微藻的培育中，强化培养中，光照强度2000-3000 lux，温度20-35℃，转速100-200 rpm，光暗比8-16h：16-8h，培养时间3-7d。
更优选地，强化微藻的培育中，微藻的接种量为5-40wt%。
更优选地，强化微藻的培育中，微藻为栅藻或小球藻。
本发明公开了木糖衍生物在培育微藻中的用途。
本发明由于采用木糖和2-呋喃甲酰肼在乙酸的催化作用下反应制备得到木糖衍生物，然后与其他碳源试剂、无机盐混合于水中，制备得到强化培养液，碳源试剂还包括葡萄糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠，本发明发现由木糖和2-呋喃甲酰肼制成木糖衍生物后，将其与其他碳源试剂、无机盐混合后，得到强化培养液，对微藻进行强化培育后，最后可以将强化培育后的微藻应用废液处理中；因而具有如下有益效果：由强化培养液对微藻进行强化培养，可以提高微藻的生物增长率；然后强化微藻应用于待处理废液中，可以提高微藻中油脂含量。因此，本发明是一种提高微藻生物且微藻产油量高的微藻混合培养生产油脂的方法。
附图说明
图1为木糖衍生物红外图。
图2为生物增长率图。
图3为油脂含量图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
本发明中栅藻（Scenedesmus sp）CGMCC No.6649，小球藻（Chlorellasorokiniana）CGMCC No.22395。
实施例1：一种微藻混合培养生产油脂的方法
木糖衍生物的制备：将木糖和2-呋喃甲酰肼加入乙醇中，然后加入催化剂，回流反应4h，TLC监测反应，反应完成后，冷却，抽滤，干燥，得到木糖衍生物。乙醇的使用量为100g，木糖的使用量为2g，2-呋喃甲酰肼的使用量为0.04g，催化剂为乙酸，乙酸的使用量为1g。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖和木糖衍生物，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，木糖衍生物的使用量为1g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
强化栅藻的培育：将栅藻接种到强化培养液中，调节pH为中性，生长培养得到强化栅藻。强化培养中，光照强度2500 lux，温度25℃，转速150 rpm，光暗比12h：12h，培养时间5d。栅藻的接种量为10wt%。
强化小球藻的培育：将小球藻接种到强化培养液中，调节pH为中性，生长培养得到强化小球藻。强化培养中，光照强度2500 lux，温度25℃，转速150 rpm，光暗比12h：12h，培养时间5d。小球藻的接种量为10wt%。
微藻混合培养生产油脂：将厨余废液、稀释剂和强化微藻混合于光生物反应器中，培养至生长稳定期结束，收集混合微藻。稀释剂为水，稀释剂使用量为1000g，厨余废液的使用量为200g，强化微藻为强化栅藻和强化小球藻，强化栅藻的接种量为50g，强化小球藻的接种量为厨余废液的50g。
实施例2：一种微藻混合培养生产油脂的方法
本实施例与实施例1相比，不同之处在于强化培养液的制备。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖和木糖衍生物，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，木糖衍生物的使用量为1.5g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
实施例3：一种微藻混合培养生产油脂的方法
本实施例与实施例1相比，不同之处在于强化培养液的制备。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖、木糖衍生物和乙酰丙酸苯腙内酰胺，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，木糖衍生物的使用量为1g，乙酰丙酸苯腙内酰胺的使用量为0.6g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
实施例4：一种微藻混合培养生产油脂的方法
本实施例与实施例1相比，不同之处在于强化培养液的制备。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖和木糖衍生物，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，木糖衍生物的使用量为1.5g，乙酰丙酸苯腙内酰胺的使用量为0.6g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
对比例1：一种微藻混合培养生产油脂的方法
本对比例与实施例1相比，不同之处在于强化培养液的制备。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
对比例2：一种微藻混合培养生产油脂的方法
本对比例与实施例1相比，不同之处在于强化培养液的制备。
强化培养液的制备：将碳源试剂和无机盐混合于水中，制备得到强化培养液。碳源试剂包括葡萄糖和木糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠。水的使用量为1000g，葡萄糖的使用量为10g，木糖的使用量为1g，硝酸钠的使用量为葡萄糖的0.8g，磷酸氢二钾的使用量为葡萄糖的0.04g，硫酸镁的使用量为葡萄糖的0.07g，氯化钙的使用量为葡萄糖的0.03g，碳酸钠的使用量为葡萄糖的0.02g。
试验例：
本发明对实施例1制备得到的木糖衍生物进行了红外表征，测试结果如图1所示，其中，在3428cm-1处为羟基的红外吸收峰，酰肼的氮氢红外吸收峰与羟基重叠，形成宽的吸收峰，在1685cm-1处为羰基的红外吸收峰，在1052cm-1处为碳氧碳的红外吸收峰，表明得到木糖衍生物。
本发明各实施例和对比例的方法中采用微藻混合培养生产油脂，对培养前后混合微藻的生物增长率进行测试；培养前的微藻按比例1mL的藻液，离心洗涤，干燥称重，然后计算培养前微藻的量；培养后的微藻全部收集，离心洗涤，干燥，称重；生物增长率为培养后的微藻量与培养前的微藻量的差值占培养前的微藻量的比率。
本发明中实施例1-4及对比例1的方法中的生物增长率的测试结果如图2所示，其中，S1为实施例1，S2为实施例2，S3为实施例3，S4为实施例4，D1为对比例1，本发明由木糖和2-呋喃甲酰肼在乙酸的催化作用下反应制备得到木糖衍生物，然后与其他碳源试剂、无机盐混合于水中，制备得到强化培养液，碳源试剂还包括葡萄糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠，本发明发现由木糖和2-呋喃甲酰肼制成木糖衍生物后，将其与其他碳源试剂、无机盐混合后，得到的强化培养液可以提高微藻的生长性能，通过对生物增长率进行测试，发现木糖衍生物的使用效果优于木糖的使用效果，进一步相比于未使用木糖衍生物，含有木糖衍生物的强化培养液可以大幅提高混合微藻的生物增长率，而如果未对木糖进行衍生，则木糖仅起到普通碳源的使用效果，对混合微藻的生物增长率并没有较高的提升效果，通过对其分析，表明木糖衍生物中由2-呋喃甲酰肼生成的结构，对混合微藻具有优异的提高效果；进一步还可以在强化培养液中加入乙酰丙酸苯腙内酰胺，在木糖衍生物及其他试剂的存在下，得到的强化培养液可以进一步提高对混合微藻的强化培育效果，提高混合微藻的生物增长率。
本发明对各实施例和对比例的方法制备的混合微藻进行油脂含量的测试，将混合微藻离心，采用0.1M磷酸缓冲液清洗，然后加入20mL有机溶剂(氯仿、甲醇和水以体积比1：2：1的比例混合)，超声波细胞破碎仪处理20min，超声完成后，充分震荡完成油脂萃取，萃取后离心，甲醇和水位于最上层，藻细胞碎片位于中层，含油脂组分的氯仿位于最下层，吸取氯仿层，氮吹至有机溶剂全部挥发，恒重得到油脂，重复3次萃取，合并油脂，计算微藻的油脂含量。油脂含量由相同体积混合微藻的油脂和生物量干重的比率。
本发明中实施例1-4及对比例1的方法中的油脂含量的测试结果如图3所示，其中，S1为实施例1，S2为实施例2，S3为实施例3，S4为实施例4，D1为对比例1，本发明由木糖和2-呋喃甲酰肼在乙酸的催化作用下反应制备得到木糖衍生物，然后与其他碳源试剂、无机盐混合于水中，制备得到强化培养液，碳源试剂还包括葡萄糖，无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸钠，本发明发现由木糖和2-呋喃甲酰肼制成木糖衍生物后，将其与其他碳源试剂、无机盐混合后，得到的强化培养液可以提高微藻中油脂的含量，通过对微藻中油脂的含量进行测试，发现木糖衍生物的使用效果优于木糖的使用效果，进一步相比于未使用木糖衍生物，含有木糖衍生物的强化培养液可以大幅提高混合微藻中的油脂含量，而如果未对木糖进行衍生，则木糖仅起到普通碳源的使用效果，对混合微藻中的油脂含量并没有较高的提升效果，通过对其分析，表明木糖衍生物中由2-呋喃甲酰肼生成的结构，对混合微藻具有优异的使用效果；进一步还可以在强化培养液中加入乙酰丙酸苯腙内酰胺，在木糖衍生物及其他试剂的存在下，得到的强化培养液可以进一步提高对混合微藻的强化培育效果，提高混合微藻中的油脂含量。
以上所述的实施例及/或实施方式，仅是用以说明实现本发明技术的较佳实施例及/或实施方式，并非对本发明技术的实施方式作任何形式上的限制，任何本领域技术人员，在不脱离本发明内容所公开的技术手段的范围，当可作些许的更动或修改为其它等效的实施例，但仍应视为与本发明实质相同的技术或实施例。
本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。以上所述仅是本申请的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以作出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其他场合的，均应视为本申请的保护范围。
Claims (8)
1.一种微藻混合培养生产油脂的方法，包括：由强化培养液对微藻进行强化培养得到强化微藻，然后将强化微藻应用于待处理废液进行混合培养，最后收集混合培养的微藻，分离油脂；所述强化培养液中含有木糖衍生物，木糖衍生物中具有2-呋喃甲酰肼结构；所述木糖衍生物的制备中，由木糖和2-呋喃甲酰肼在催化剂作用下反应制成木糖衍生物，所述木糖衍生物的制备溶剂为乙醇；所述催化剂为乙酸，乙酸的使用量为木糖的40-80wt%；所述2-呋喃甲酰肼的使用量为木糖的1-3wt%；
所述微藻包括栅藻和/或小球藻。
2.根据权利要求1所述的一种微藻混合培养生产油脂的方法，其特征是：所述强化培养液包括碳源试剂和无机盐，碳源试剂包括葡萄糖；或，所述待处理废液中含有厨余废液、城市污水或畜牧业沼液。
3.根据权利要求2所述的一种微藻混合培养生产油脂的方法，其特征是：所述碳源试剂为葡萄糖和木糖衍生物，木糖衍生物的量为葡萄糖的5-20wt%；或，所述无机盐包括硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙和碳酸钠；或，所述强化培养中，微藻的接种量为10-40wt%。
4. 根据权利要求1所述的一种微藻混合培养生产油脂的方法，其特征是：所述强化培养中，将微藻接种到强化培养液中，调节pH为中性，生长培养得到强化微藻；或，所述强化培养中，光照强度2000-3000 lux，温度20-35℃，转速100-200 rpm，光暗比8-16h：16-8h，培养时间3-7d。
5.一种木糖衍生物，所述木糖衍生物中具有2-呋喃甲酰肼键合基团，所述木糖衍生物的制备中，由木糖和2-呋喃甲酰肼在催化剂作用下反应制成木糖衍生物，所述木糖衍生物的制备溶剂为乙醇；所述催化剂为乙酸，乙酸的使用量为木糖的40-80wt%；所述2-呋喃甲酰肼的使用量为木糖的1-3wt%。
6.一种强化培养液，包括：权利要求5所述的木糖衍生物。
7.一种强化微藻的培育方法，包括：将微藻接种于权利要求6所述的强化培养液中，培育得到强化微藻。
8.权利要求5所述的木糖衍生物在培育微藻中的用途。
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