JPH0722513B2

JPH0722513B2 - ビスホモ―γ―リノレン酸及びこれを含有する脂質の製造方法

Info

Publication number: JPH0722513B2
Application number: JP61158650A
Authority: JP
Inventors: 芳史新免; 昌清水; 秀明山田
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1986-07-08
Publication date: 1995-03-15
Anticipated expiration: 2010-03-15
Also published as: JPS6314696A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は醗酵法によるビスホモ−γ−リノレン酸、及び
これを含有する脂質の製造方法に関する。

〔従来技術〕

ビスホモ−γ−リノレン酸（エイコサトリエン酸）は魚
油、海藻等の構成脂肪酸のひとつとして存在することが
知られている。しかしながら、その含量はわずかである
ため単離精製品はたいへん高価なものとなっており、生
産効率の高い製法の開発が強く望まれている。なお、発
酵法によるビスホモ−γ−リノレン酸の製造方法は知ら
れていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、従来ビスホモ−γ−リノレン酸を生産する能
力を有することが知られていなかったモルティエレラ属
微生物を使用して、安価な常用の培地を用いて、高収率
で、しかも単純な工程でビスホモ−γ−リノレン酸、及
びこれを含有する脂質を製造することができる方法を提
供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

上記の目的はモルティエレラ属に属しビスホモ−γ−リ
ノレン酸生産能を有する微生物を培養してビスホモ−γ
−リノレン酸又はビスホモ−γ−リノレン酸を含有する
脂質を生成せしめ、そしてビスホモ−γ−リノレン酸を
採取することを特徴とするビスホモ−γ−リノレン酸の
製造方法；及びモルティエレラ属に属しビスホモ−γ−
リノレン酸生産能を有する微生物を培養してビスホモ−
γ−リノレン酸を含有する脂質を採取することを特徴と
するビスホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質の製造方
法により達成される。

〔具体的な説明〕

本発明においては、モルティエレラ属に属し、ビスホモ
−γ−リノレン酸生産能を有する微生物であれば、すべ
て使用することができる。このような微生物として、例
えばモルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elonga
ta）IFO 8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortiere
lla exigua）IFO 8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ
（Mortierella hygrophila）IFO 5941等を挙げることが
できる。これらの菌株はいずれも、財団法人醗酵研究所
からなんら制限なく入手することができる。

また、本発明者らが土壌から分離した菌株モルティエレ
ラ・エロンガタSAM 0219（微工研菌寄第8703号）（微工
研条寄第1239号）を使用することもできる。

次に、上記の菌株SAM 0219（微工研菌寄第8703号）（微
工研条寄第1239号）の菌学的性質を記載する。

各培地における生育状態培養条件:25℃、暗黒下 1. 麦芽エキス寒天培地コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径28
−31mm、培養５日目のコロニーは直径65−72mm、コロニ
ーは浅裂状を呈する、気菌糸の発達は乏しい、胞子のう
胞子の形成は良好、胞子のう柄は気菌糸より生じる。ニ
ンニクに類似した臭いあり。

2. バレイショ・ブドウ糖寒天培地コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーは直径27
−31mm、培養５日目のコロニーは直径75−80mm、コロニ
ーはバラの花状を呈する、コロニー中心部で気菌糸が著
しく発達する、コロニーの裏側は黄白色あるいは黄色、
胞子のう胞子の形成は不良、ニンニクに類似した臭いあ
り、臭いはやや強い。

3. ツァベック寒天培地コロニーの生育は比較的良好、培養２日目のコロニーの
直径は22−24mm、培養５日目のコロニーの直径は50−53
mm、気菌糸の発達は乏しい、気菌糸が密にからまりあう
ことがある。胞子のう胞子の形成は非常に良好、胞子の
う柄は気菌糸より生じる。ニンニクに類似した臭いあ
り。

4. LCA寒天培地（培地の調製方法は、三浦宏一郎、工
藤光代著“水生不完全菌のための一寒天培地”日本菌学
会会報11巻、116−118頁、1970年に従った）コロニーの生育は良好、培養２日目のコロニーの直径は
27−29mm、培養５日目のコロニーは直径64−66mm、コロ
ニーは浅裂状を呈する、気菌糸の発達はコロニーの中心
部を除いて乏しい、胞子のう胞子の形状は良好。胞子の
う柄は気菌糸より生じる。ニンニクに類似した臭いあ
り。

検鏡観察各培地の検鏡標本およびコロニーの直接検鏡で、胞子の
う柄、胞子のう柄の分岐の仕方、胞子のう、胞子のう胞
子などを観察した。

胞子のう柄は長さ87.5−320μｍ、幅は基部で３−7.5μ
ｍ、先端に向けて先細り、1.0−2.5μｍとなる。胞子の
う柄はしばしば基部で分岐する。胞子のうは球形、直径
15−30μｍ、内部に多数の胞子のう胞子を含む、脱離後
やや不明瞭なカラーを残す。胞子のう胞子は楕円形、希
に腎臓形、表面は平滑、7.5−12.5×５−7.5μｍ、厚膜
胞子は比較的多数形成される。単独、希に連鎖すること
がある。時に数本の菌糸を周囲に出すことがある。楕円
形また亜球形、12.5−30×7.5−15μｍ。または直径12.
5−15μｍ。接合胞子は観察されない。

3. 生理的性質最適生育条件 pH:6−９温度:20−30℃ 生育の範囲 pH:4−10 温度:5−40℃ 以上の菌学的諸性質に従い本発明の菌株（SAM−0219）
の分類学的位置の検索を、J.A.von Arx,“The Genera o
f Fungi sporulating in Pure Culture,"3rd ed.,J.Cra
mer,1981、およびK.H.Domsch,W.Gams,＆ T.H.Anderson,
“Compendium of soil Fungi,"Academic Press.1980に
準拠して求めると、胞子のう柄の先端に球状の胞子のう
を形成する、柱軸を持たない、胞子のう胞子に付属糸が
ない、培養菌糸がニンニクに類似した臭いを発する、と
いうことから本菌株はMortierella属に属する真菌であ
ると考えられる。

そこで、W.Gams,“A Key to the species of Mortierel
la,"Persoonia ９,381−391,1977準拠して既知のMortie
rella属の種類と菌学的諸性質を比較すると、本菌株は
コロニーがビロード状でない、培養菌糸がニンニクに類
似した臭いを発っする、胞子のう柄が長さ87.5−320μ
ｍで分岐は下部でのみ生じ、葡萄の房状に分岐しない、
胞子のうは内部に多数の胞子のう胞子を含む、というこ
とからMortierella属Mortierella亜属（Sugen.Mortiere
lla）Hygrophila節（Sect.Hygrophila）に含まれると考
えられる。

Hygrophila節には22種が含まれている。本菌株とこれら
22種と菌学的諸性質を比較すると、本菌株はMortierell
a zychae,M.elongatula,およびM.elongataの３種に類似
すると考えられる。そこで、K.H.Domsch,W.Gams,＆ T.
−H.Anderson,“Compendium of Soll Fungi,"Academic
Press,1980、W.Gams、“Some new or noteworthy speci
es of Mortierella,"Persoonia９,111−140,1977）、お
よびG.Linnemann,“Mortierella Coemans 1863."H.Zych
a ＆ R.Siepmann.“Mucorales Eine Besch−reibung Al
ler Gattungen and Arten dieser Pilz−gruppe."pp.15
5−140,J.Cramer,1969を参考にして、本菌株とこれら３
種と菌学的諸性質を比較した。本菌株は、M.zychaeとは
胞子のう柄の長さと基部の幅、胞子のうの大きさで、明
瞭に異なる。M.elongatulaとは胞子のう胞子の形態と大
きさで、明瞭に異なる。M.elongataとは胞子のう柄がや
や短い、厚膜胞子の形態が楕円形または亜球形でときに
連鎖することがあり、さらに厚膜胞子がときに数本の菌
糸を周囲に出す、という点で異なるが、本発明者らはこ
のような差異は本菌株をMortierella elongataと別種で
あるとするには十分でないと判断した。そこで、本発明
者らは本菌株をMortierella elongata SAM 0219と同定
した。SAM 0219株は昭和61年３月19日に通商産業省工業
技術院微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM P
−8703として寄託され、FERM BP−1239として国際寄託
に移管された。

本発明に使用される菌株を培養する為には、その菌株の
胞子、菌糸又は予め培養して得られた前培養液を、液体
培地又は固体培地に接種し培養する。液体培地の場合
に、炭素源としてはグルコース、フラクトース、キシロ
ース、サッカロース、マルトース、可溶性デンプン、糖
密、グリセロール、マンニトール等の一般的に使用され
ているものがいずれも使用できるが、これらに限られる
ものではない。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、
麦芽エキス、肉エキス、カザミノ酸、コーンステイプリ
カー等の天然窒素源の他に、尿素等の有機窒素源、なら
びに硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム等の無機窒素源を用いることができる。この他必要
に応じリン酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸銅等
の無機塩及びビタミン等も微量栄養源として使用でき
る。これらの培地成分は微生物の生育を害しない濃度で
あれば特に制限はない。実用上一般に、炭素源は0.1〜3
0重量％、好ましくは１〜10重量％、窒素源は0.01〜５
重量％、好ましくは0.1〜２重量％の濃度とするのが良
い。又、培養温度は５〜40℃、好ましくは20〜30℃と
し、培地のpHは４〜10、好ましくは６〜９として、通気
撹拌培養、振盪培養、又は静置培養を行なう。培養は通
常２〜10日間行う。

固体培地で培養する場合は、固形物重量に対して50〜10
0重量％の水を加えたふすま、もみがら、米ぬか等を用
い、５〜40℃、好ましくは20〜30℃の温度において、３
〜14日間培養を行う。この場合に必要に応じて培地中に
窒素源、無機塩類、微量栄養源を加えることができる。

このように培養して、菌体内に、ビスホモ−γ−リノレ
ン酸を含有する脂質が生成蓄積される。液体培地を使用
した場合には、培養菌体から、次のようにしてビスホモ
−γ−リノレン酸の採取を行なう。

培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過等の常用の固
液分離手段により培養菌体を得る。菌体は十分水洗し、
好ましくは乾燥する。乾燥は凍結乾燥、風乾等によって
行うことができる。乾燥菌体は、好ましくは窒素気流下
で有機溶媒によって抽出処理する。有機溶媒としてはエ
ーテル、ヘキサン、メタノール、エタノール、クロロホ
ルム、ジクロロメタン、石油エーテル等を用いることが
でき、またメタノールと石油エーテルの交互抽出や、ク
ロロホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いた抽
出によっても良好な結果を得ることができる。抽出物か
ら減圧下で有機溶媒を留去することにより、高濃度のビ
スホモ−γ−リノレン酸を含有した脂質が得られる。

また、上記の方法に代えて湿菌体を用いて抽出を行うこ
とができる。この場合にはメタノール、エタノール等の
水に対して相溶性の溶媒、又はこれらと水及び／又は他
の溶媒とから成る水に対して相溶性の混合溶媒を使用す
る。その他の手順は上記と同様である。

上記のようにして得られた脂質中には、ビスホモ−γ−
リノレン酸が脂質化合物、例えば脂肪の構成成分として
含まれている。これらを、直接分離することもできる
が、低級アルコールとのエステル、例えばビスホモ−γ
−リノレン酸メチルとして分離するのが好ましい。この
ようなエステルにすることにより、他の脂質成分から容
易に分離することができ、また、培養中に生成する他の
脂肪酸、例えばパルミチン酸、オレイン酸、リノール酸
等（これらも、ビスホモ−γ−リノレン酸のエステル化
に際してエステル化される）から容易に分離することが
できる。例えば、ビスホモ−γ−リノレン酸のメチルエ
ステルを得るには、前記の抽出脂質を無水メタノール−
塩酸５％〜10％、BF₃−メタノール10％〜50％等によ
り、室温にて１〜24時間処理するのが好ましい。

前記の処理液からビスホモ−γ−リノレン酸メチルエス
テルを回収するにはヘキサン、エーテル、酢酸エチル等
の有機溶剤で抽出するのが好ましい。次に、この抽出液
を無水酢酸ナトリウム等により乾燥し、有機溶媒を好ま
しくは減圧下で留去することにより主として脂肪酸エス
テルから成る混合物が得られる。この混合物中には、目
的とするビスホモ−γ−リノレン酸メチルエステルの他
に、パルミチン酸メチルエステル、ステアリン酸メチル
エステル、オレイン酸メチルエステル等が含まれてい
る。これらの脂肪酸メチルエステル混合物からビスホモ
−γ−リノレン酸メチルエステルを単離するには、カラ
ムクロマトグラフィー、低温結晶化法、尿素包接体法等
を、単独で、又は組み合わせて使用することができる。

こうして単離されたビスホモ−γ−リノレン酸メチルか
らビスホモ−γ−リノレン酸を得るには、アルカリで加
水分解した後、エーテル、酢酸エチル等の有機溶媒で抽
出すればよい。

また、ビスホモ−γ−リノレン酸をそのメチルエステル
を経ないで採取するには、前記の抽出脂質をアルカリ分
解（例えば５％水酸化ナトリウムにより室温にて２〜３
時間）した後、この分解液から、脂肪酸の抽出・精製に
常用されている方法により抽出・精製することができ
る。

次に、実施例により、この発明をさらに具体的に説明す
る。

〔ビスホモγ−リノレン酸の製造方法〕

実施例１グルコース５％、ペプトン0.5％、酵母エキス0.3％及び
麦芽エキス0.3％を含む培地（pH6.0）50mlを500ml溶坂
口フラスコに入れ、120℃で20分間殺菌した。モルティ
エレラ・エロンガタSAM 0219（FERM P−8703）（FERMBP
−1239）１白金耳を接種し、レシプロシェーカー（110r
pm）により28℃で５日間振盪培養した。培養後、濾過に
て菌体を回収し、十分水洗した後、凍結乾燥した。これ
により、1.2gの乾燥菌体を得た。この菌体より、クロロ
ホルム−メタノール−水の一層系の溶媒を用いるBligh
＆ Dyerの抽出法によって総脂質を抽出したところ、290
mgの脂質が得られた。この脂質を無水メタノール−塩酸
（95:5）を用いて20℃にて３時間処理することによって
メチルエステル化し、エーテルで抽出して180mgの脂肪
酸メチルを得た。これをさらにカラムクロマトグラフィ
ーによって分離し、ビスホモ−γ−リノレン酸メチル画
分を分取し、ロータリーエバポレーターによって溶媒を
留去した結果、5.2mgの精製されたビスホモ−γ−リノ
レン酸メチルを得た。本標品と市販のビスホモ−γ−リ
ノレン酸をメチルエステル化し、カラムクロマトグラフ
ィーによって単離精製して調製したビスホモ−γ−リノ
レン酸メチル標準サンプルについて、ガスクロマトグラ
フィー分析、高速液体クロマトグラフィー分析、質量分
析、及びNMR分析によって比較を行なったところ、両者
はいずれの分析においても一致した。精製前及び精製後
のビスホモ−γ−リノレン酸メチル量は培地当り、それ
ぞれ0.18mg/ml及び0.10mg/ml、乾燥菌体当り、それぞれ
7.5mg/g及び4.3mg/gであった。

実施例２実施例１と同じ組成の培地５を15ジャーファーメン
ターに仕込み、120℃で40分間殺菌後、モルティエレラ
・エロンガタSAM 0219（FERM P−8703）（FERM BP−123
9）の前培養液200mlを接種した。30℃、通気量0.5v.v.m
で３日間通気撹拌培養を行ない、得られた湿菌体370g
（乾燥重量120g）について、実施例１と同様に抽出、加
水分解、メチルエステル化を行なったところ、総脂質31
g、混合脂肪酸メチル19gを得た。このもののビスホモ−
γ−リノレン酸メチル含量は５％、生成量は培地当り0.
19g/、乾燥菌体当り7.9mg/gであった。

又、培養終了後、濾過によって得られた培養濾液4,050m
lを乾燥後、実施例１と同様に抽出、加水分解、及びメ
チルエステル化を行なったところ、５％のビスホモ−γ
−リノレン酸メチルを含む混合脂肪酸メチル127mgを得
た。

実施例３モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua,IFO
8571）、及びモルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortier
ella hygrophila,IFO 5941）について実施例１と同様な
操作を行なったところ、それぞれ65mg,93mgの脂肪酸メ
チルを得た。

これらの脂肪酸メチル中に含まれるビスホモ−γ−リノ
レン酸メチルを単離・精製したところ、それぞれの菌株
について2.7mg、及び4.5mgが得られた。

実施例４グルコース２％、酵母エキス１％、Tween 20 0.2％及び
種々の炭化水素、脂肪酸ナトリウム又は油脂0.5％を含
む培地（pH6.0）20mlを100ml容マイヤーに入れ、120℃
で20分間殺菌した。モルティエレラ・エロンガタSAM 02
19（FERM P−8703）（FERM BP−1239）１白金耳を接種
し、ロータリーシェーカー（200rpm）により28℃で５日
間培養した。得られた菌体について、実施例１と同様に
抽出、加水分解、及びメチルエステル化を行なった。培
地に添加した種々の炭化水素、脂肪酸ナトリウム、及び
油脂それぞれについて、得られた乾燥菌体重量、総脂質
量、総脂肪酸メチル量、ビスホモ−γ−リノレン酸含
量、及び培地当りのビスホモ−γ−リノレン酸メチル生
成量は下表のようになった。

標準培地に脂肪酸ナトリウム又は油脂類を添加した場
合、ビスホモ−γ−リノレン酸の生成量は無添加区にく
らべ、２〜20％向上した。

実施例５グルコース２％、酵母エキス１％を含む培地（pH6.0）2
0mlを100ml容マイヤーに入れ、120℃で20分間殺菌し
た。モルティエレラ・エロンガタSAM 0219（FERM P−87
03）（FERM BP−1239）１白金耳を接種し、ロータリー
シェーカー（200rpm）により28℃で４日間培養後、種々
の脂肪酸ナトリウム又は油脂100mgを120℃で15分間殺菌
後、添加し、さらに同様にして２日間培養した。得られ
た菌体について、実施例１と同様に抽出、加水分解、及
びメチルエステル化を行なった。培地に添加した種々の
脂肪酸ナトリウム、及び油脂それぞれについて、得られ
た乾燥菌体当り、及び培地当りのビスホモγ−リノレン
酸メチル生成量は下表のようになった。

培養途中（培養４日後）に脂肪酸、油脂類などを添加す
ることにより対照である無添加区よりもビスホモγ−リ
ノレン酸生成量は10〜80％上昇した。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】モルティエレラ（Mortierella）属に属
し、ビスホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微生物を
培養して、ビスホモ−γ−リノレン酸、又はビスホモ−
γ−リノレン酸を含有する脂質を生成せしめ、そしてビ
スホモ−γ−リノレン酸を採取することを特徴とするビ
スホモ−γ−リノレン酸の製造方法。
【請求項２】培地へ炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩または
油脂を添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。
【請求項３】培養中の培養液へ脂肪酸、脂肪酸塩または
油脂を添加することを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載の方法。
【請求項４】モルティエレラ（Mortierella）属に属
し、ビスホモ−γ−リノレン酸生産能を有する微生物を
培養してビスホモ−γ−リノレン酸を含有する脂質を採
取することを特徴とするビスホモ−γ−リノレン酸を含
有する脂質の製造方法。
【請求項５】培地へ炭化水素、脂肪酸、脂肪酸塩または
油脂を添加することを特徴とする特許請求の範囲第４項
記載の方法。
【請求項６】培養中の培養液へ脂肪酸、脂肪酸塩または
油脂を添加することを特徴とする特許請求の範囲第４項
記載の方法。