CN110106210A - 褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开褪黑素在促进雨生红球藻生产γ‑氨基丁酸中的应用，培养雨生红球藻到达对数生长期后期，利用BBM培养基稀释细胞作为诱导种子液；用无水乙醇配成浓度为35mmol/L褪黑素母液，将褪黑素母液添加到已经稀释好的诱导的种子液中；将该种子液在连续光照及褪黑素的复合胁迫下，诱导藻细胞积累γ‑氨基丁酸；本发明方法简单可行，成本低廉，并大幅提高雨生红球藻中γ‑氨基丁酸含量，从而很大程度上提高了γ‑氨基丁酸的产率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用。
背景技术
γ-氨基丁酸（Gama-aminobutyric acid，GABA），是一种四碳、非蛋白氨基酸，广泛存在于动物、植物、微生物中，具有诸多生理功能，近些年来颇受关注。GABA 作为哺乳动物中枢神经系统中的重要抑制性神经递质，具有减轻焦虑、减缓郁抑、改善睡眠、增强记忆、强化免疫、防止炎症、降低体重、降低血压、调节血糖等生理功。基于 GABA重要的生理功能，我国2009年将GABA 列为新资源食品。
目前，GABA 的制备方法主要有化学合成法、植物富集法、微生物发酵法。化学合成法的合成方法条件剧烈，且有化学物质残留，即使得到纯品也不属于天然产物，且成本高，主要应用于化工和医药领域，不适合在食品中应用。相比而言，化学合成安全性较差，植物富集的GABA含量很低，而微生物发酵合成GABA就显得具有开发前景了。过去发酵法生产GABA多以大肠杆菌为生产菌，随着绿色食品的不断开发，一些含有谷氨酸脱羧酶的曲霉、酵母菌、乳酸菌等已经逐渐代替大肠杆菌，用于催化谷氨酸脱羧制得GABA，部分己实现商业化生产。但是上述菌株在安全性上也存在一定的问题，会有风险存在。
发明内容
本发明针对以上的问题提供褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用，利用褪黑素可很大程度上缩短积累GABA的周期及提高GABA的产率。
褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用方法，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：在25℃，冷光灯持续光照条件下培养雨生红球藻，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cells mL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成浓度为35mmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液中，使种子液中褪黑素浓度达到5~15μmol/L；将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照下、28~29℃培养3天，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
步骤（1）中雨生红球藻为雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialisLUGU。
步骤（1）中光照强度为2500~2800lux。
步骤（2）中光照强度为8000~10000lux。
本发明的有益效果：
（1）本发明公开了褪黑素的新的应用领域，且操作简单易行、成本低，原材料为自己筛选的雨生红球藻菌株，可按常规方法培养，培养完藻的废液可以直接用于灌溉农田，提高利用率，提高培养完藻的废液利用率。
（2）本发明大幅提高了γ-氨基丁酸GABA的产率，添加15μmol/L的褪黑素MLT的诱导组的γ-氨基丁酸GABA产量比没有加褪黑素的对比例提高了1.56倍，达到49.98mg/g。
附图说明
图1实施例1、2、3、4、对比例中微藻的γ-氨基丁酸GABA含量。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用方法，具体步骤如下：
（1）种子液的制备：在25℃、冷光灯光照强度为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cellsmL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成35mmol/L的褪黑素母液，取200mL步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液，将褪黑素母液添加到种子液中，种子液中褪黑素浓度达到5μmol/L后停止添加褪黑素母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照强度为8000lux，温度28℃培养3天，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例1的方法，再进行两组平行实验，将步骤（1）的冷光灯光照强度设定为2600lux、2800lux，步骤（2）的培养温度分别对应设定为28℃、29℃，冷光灯光照强度分别为9000lux、10000lux，其他条件与实施例1相同，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
本实施例培养完的细胞液利用PITC检测藻细胞的γ-氨基丁酸含量，其具体步骤为：
（1）将培养后的藻细胞悬浮液以3800×g离心5min，沉淀用蒸馏水洗涤2次，收集在50mL离心管中，在-80℃的真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h直至获得恒重得到干藻粉质量；
（2）通过高效液相色谱（HPLC）测量γ-氨基丁酸的含量：取0.1g冻干后的干藻粉与6mL4%（v/v）乙酸溶液一起研磨，匀浆液在室温下提取1h（间隔20min涡旋振荡一次），6037×g离心15min，收集上清液并加入4mL优级纯乙醇，去除大分子聚合物，振荡混匀，取2mL液体16770×g离心20min，收集1mL上清液，真空干燥（0.1MPa，45℃），使乙醇和乙酸挥发，残余物用0.5mL蒸馏水溶解，2683×g离心10min后进行样品衍生化，取300μL样品上清液真空干燥，残余物溶解于60μL乙醇-水-三乙胺（体积比2：2：1），真空干燥，残余物溶解于90μL乙醇-水-三乙胺-PITC（体积比7：1：1：1）中，室温反应20min，形成PITC-GABA，然后真空干燥，残余物溶解于600μL含体积分数80%A相（8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L）和体积分数20%B相（乙腈和水体积比为3：2），pH为5.8，将样品衍生化后，将20μL样品注入HPLC中检测，洗脱梯度由洗脱液A（8.205g无水乙酸钠，0.5mL三乙胺，0.7mL乙酸，5mL乙腈，加水定容至1L）和洗脱液B（乙腈和水体积比为3：2）组成，洗脱梯度0.6mL/min等梯度洗脱，检测波长254nm处的峰面积，50min进样一次；
（3）以GABA标准品浓度25、50、100、200和500mg/L为横坐标，及每个标准品浓度对应波长254处的峰面积为纵坐标构建GABA标准曲线，得到GABA标准曲线:
y = 27.804x + 553.38 （1）
其中，y为峰面积，mAU.s；x为GABA浓度，mg/L，曲线拟合度R² = 0.9927，说明标准曲线的拟合度高；将步骤（2）检测到的峰面积带入公式（1）GABA标准曲线中，即可得到γ-氨基丁酸GABA浓度C；
（4）用将步骤（2）得到的γ-氨基丁酸GABA浓度C带入以下公式计算雨生红球藻γ-氨基丁酸含量：
（2）
其中，
C为γ-氨基丁酸GABA浓度，mg/L；
V为γ-氨基丁酸GABA衍生化后溶解于80%A相和20%B相后的体积，取0.6mL；
m为干藻粉质量，g，检测过程为0.1g。
结果：当褪黑素浓度为5μmol/L时，微藻的γ-氨基丁酸GABA含量最高为35mg/g。且培养完的藻液无污染，可以直接排放，灌溉农田。
实施例2
褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用方法，具体步骤如下：
（1）种子液的制备：在25℃、冷光灯光照强度为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cellsmL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成35mmol/L的褪黑素母液，取200mL步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液，将褪黑素母液添加到种子液中，种子液中褪黑素浓度达到10μmol/L后停止添加褪黑素母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照强度为8000lux，温度28℃培养3天，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例2的方法，再进行两组平行实验，将步骤（1）的冷光灯光照强度设定为2700lux、2800lux，步骤（2）的培养温度分别对应设定为28℃、29℃，冷光灯光照强度分别为9000lux、10000lux，其他条件与实施例2相同，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例1的方法进行检测的结果：当褪黑素浓度为10μmol/L时，微藻的γ-氨基丁酸GABA含量最高为44.6mg/g。且培养完的藻液无污染，可以直接排放，灌溉农田。
实施例3
褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用方法，具体步骤如下：
（1）种子液的制备：在25℃、冷光灯光照强度为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cellsmL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成35mmol/L的褪黑素母液，取200mL步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液，将褪黑素母液添加到种子液中，种子液中褪黑素浓度达到15μmol/L后停止添加褪黑素母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照强度为8000lux，温度28℃培养3天，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例3的方法，再进行两组平行实验，将步骤（1）的冷光灯光照强度设定为2600lux、2800lux，步骤（2）的培养温度分别对应设定为28℃、29℃，冷光灯光照强度分别为9000lux、10000lux，其他条件与实施例3相同，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例1的方法进行检测的结果：当褪黑素浓度为15μmol/L时，微藻的γ-氨基丁酸GABA含量最高为49.98mg/g。且培养完的藻液无污染，可以直接排放，灌溉农田。
实施例4
褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用方法，具体步骤如下：
（1）种子液的制备：在25℃、冷光灯光照强度为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cellsmL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成35mmol/L的褪黑素母液，取200mL步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液，将褪黑素母液添加到种子液中，种子液中褪黑素浓度达到20μmol/L后停止添加褪黑素母液，然后将该种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照强度为8000lux，温度29℃培养3天，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例4的方法，再进行两组平行实验，将步骤（1）的冷光灯光照强度设定为2600lux、2800lux，步骤（2）的培养温度分别对应设定为28℃、29℃，冷光灯光照强度分别为9000lux、10000lux，其他条件与实施例4相同，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例1的方法进行检测的结果：当褪黑素浓度为20μmol/L时，微藻的γ-氨基丁酸GABA含量最高为23.93mg/g。且培养完的藻液无污染，可以直接排放，灌溉农田。
对比例
（1）种子液的制备：在25℃、冷光灯光照强度为2500lux，持续光照条件下培养雨生红球藻，雨生红球藻采用雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialis LUGU，培养到达对数生长期后期，此时细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cellsmL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：取200mL步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液接种到鼓泡塔式光生物反应器中，持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照强度为8000lux，温度28℃培养3天，连续光照胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照对比例的方法，再进行两组平行实验，将步骤（1）的冷光灯光照强度设定为2600lux、2800lux，步骤（2）的培养温度分别对应设定为28℃、29℃，冷光灯光照强度分别为9000lux、10000lux，其他条件与对比例相同，连续光照及褪黑素的复合胁迫，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
按照实施例1的方法进行检测的结果：当褪黑素浓度为0μmol/L时，微藻的γ-氨基丁酸GABA含量最高为31.95mg/g。且培养完的藻液无污染，可以直接排放，灌溉农田。
利用HPLC测定对比例和实施例1-4中微藻的GABA含量，见图1，图中的含量是每个实施例中的三个平行实验取均质，结果显示：实施例1、2、3中藻细胞积累GABA的量均高于对比例中没有加入褪黑素MLT的情况；但是实施例4当褪黑素浓度达到20μmol/L时，褪黑素MLT对微藻积累GABA没有促进作用，藻细胞积累GABA的量低于对比例中没有加入褪黑素MLT的情况；当褪黑素MLT浓度为5~15μmol/L时，褪黑素MLT对微藻积累GABA具有促进作用，在微藻培养的第1天，当褪黑素MLT浓度为15μmol/L时，微藻内GABA含量达到最大为49.98mg/g，是对比例空白对照组的1.56倍。
Claims (5)
1.褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用。
2.根据权利要求1所述褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子液的制备：在25℃，冷光灯持续光照条件下培养雨生红球藻至细胞浓度达到106cells mL-1，利用BBM培养基稀释细胞浓度到2.5×105cells mL-1作为诱导种子液；
（2）诱导雨生红球藻积累γ-氨基丁酸：用无水乙醇配成浓度为35mmol/L的褪黑素母液，将褪黑素母液添加到步骤（1）已经稀释好的诱导的种子液中，使褪黑素浓度达到5~15μmol/L；将该种子液持续鼓入0.4vvm的含1.5%CO2的无菌空气，冷光灯光照下、 28~29℃培养3天，诱导藻细胞积累γ-氨基丁酸。
3.根据权利要求2所述褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，步骤（1）中雨生红球藻为雨生红球藻菌株Haematococcus pluvialisLUGU。
4.根据权利要求2所述褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，步骤（1）中光照强度为2500~2800lux。
5.根据权利要求2所述褪黑素在促进雨生红球藻生产γ-氨基丁酸中的应用，其特征在于，步骤（2）中光照强度为8000~10000lux。
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