CN109337826A - 一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法 - Google Patents

一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种真菌及真菌‑蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法。本发明中筛选得到的外瓶霉菌Zh2，属于高产胞外多糖菌株，将外瓶霉菌Zh2与蓝藻复合应用于生物结皮人工固沙，一方面外瓶霉菌Zh2能够为蓝藻生长提供碳源，另一方面能够胶结沙粒使其形成稳定的团聚体，提高土壤的碳氮含量和土壤酶活性，改善土壤理化性质，显著促进土壤的营养水平。本发明将真菌与蓝藻混合接种于流沙，能够较快形成稳定的复合结皮，培育周期短，同时提高了人工结皮的稳定性，加速了藻类结皮向地衣结皮演替的过程。本发明培育的真菌‑蓝藻复合地衣结皮，其抗旱能力显著高于单一藻结皮，表明复合结皮能够更好的适应干旱区的严苛环境。

Description

一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法。
背景技术
土壤荒漠化问题是我国目前面临的最重要的环境问题之一。据第五次全国荒漠化和沙化监测结果显示，截止2014年，全国荒漠化土地面积261.16万平方公里，占国土面积的27.2％；沙化土地面积172.1万平方公里，占国土面积的17.9％，严重的荒漠化问题需要加强荒漠化治理。目前，我国的荒漠化防治措施包含物理方法、化学方法和生物方法，其中生物修复法被公认为是高效、廉价、环保的途径，在当前的荒漠化治理上具有较好的优势。
生物土壤结皮(简称“生物结皮”)是由土壤细菌、真菌、藻类、地衣、苔藓等与土壤形成的有机复合体，广泛存在于全球干旱、半干旱地区。按照生物结皮中主要组成生物的不同，可将其分为藻类结皮、地衣结皮和苔藓结皮。其中地衣结皮是由蓝藻或绿藻与真菌形成的共生联合体，是自然界中互利共生或真菌对藻类有控寄生的典范。地衣中的藻类通过光合作用和固氮作用为共生体提供能量和营养，真菌则通过腐生分解作用为藻类提供无机营养并协助藻类抵御外界胁迫环境。地衣结皮在改土、肥田、防风、固沙等方面都优于藻类结皮，同时与苔藓结皮相比较，真菌-蓝藻复合结皮的形成速度更快，培育成本更低。因此，寻求快速培育真菌-蓝藻复合结皮的方法，对于发挥其生态功能具有重要的实践意义。
目前，关于生物结皮人工固沙技术的专利主要包括对荒漠藻和苔藓的培育以形成藻类或苔藓结皮。中国专利(申请)号为200510018149的专利提供了一种土壤藻类对荒漠半荒漠土壤的改良方法；中国专利(申请)号为201510522936.5的专利提供了一种荒漠藻人工生物结皮固沙的接种方法；中国专利(申请)号为201410691489.1的专利提供了一种沙地苔藓结皮的快速培育方法；中国专利(申请)号为201610899794的专利提供了一种苔藓与荒漠藻复合结皮的培育方法；上述发明中分别利用蓝藻或苔藓培育人工生物结皮，但由于单一蓝藻结皮的抗旱能力仍有较大的提升空间，而苔藓结皮的培育需要的苔藓材料不适合大规模生产，且培育过程中维护成本高，因此不适合大面积的荒漠化土壤修复。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，目的在于提供一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一株真菌，命名为外瓶霉菌Zh2，已于2018年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏单位地址：中国武汉武汉大学，其保藏号为CCTCC NO：M2018613。
上述外瓶霉Zh2的特征为：该菌在液体PDA培养基中，摇床振荡培养3日内达到对数生长期；发酵液呈灰褐色，浑浊，真菌菌丝均匀分布在液体培养基中；在固体PDA培养基上，菌落大小较规则，边缘为白色绒毛状，成熟菌落中心显深褐色，基生菌丝发达，能够生长在培养基内部；菌落为圆形，表面光滑，扁平隆起，边缘有褐色环形；菌株能够利用多种碳源和氮源，且利用效率高；最适生长温度为25～30℃，最适生长pH为6.5～7.5。
上述外瓶霉菌Zh2的16S rDNA基因序列特征为：16S rDNA序列长度为596bp，采用BLAST分析法将16S rDNA序列与GenBank数据库进行比对分析，发现该菌株与外瓶霉(Exophiala oligosperma，NR111134.1)同源性很高，相似度达到100％，同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为外瓶霉菌属(Exophiala oligosperma)，命名为外瓶霉菌Zh2，其系统发育进化树见图2。
16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
TACGGTCTCATCGGGCCCGACCTCCCAACCCATTGTTTATGATACCTAGTGTTGCTTCGGTAGGCCTGGTCTATCTGTTATAGACCTGCCGGGGGGCCGTAAGACGCCCGCCGGAGAGTGCCTACCGACAGCCTCAACTCCAAAATTCTTTAACCAAACGTGTCTTTGTCTGAGTAACGTCTTTTAAAATAAAGCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGCGAATTGCAGAATTCTCGTGAGTCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCGAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTTCACCCCTCAAGCCCCCGGCTTGGTGTTGGACGGTCTGGTCCGGGGACCTCAAACCCCCTGGACCCCTCCCAAAGACAATGACGGCGGGCTGTTGAACCCCCGGTACACTGAGCATC TTCACGGAGCACGTACCGGTCTCAAGGGTCGACGGCACCCGGTCTATACCTATATTTTTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCCGGGAGGAA
上述外瓶霉菌Zh2在生物结皮人工固沙领域方面的应用。具体地应用为：将外瓶霉菌Zh2与荒漠蓝藻复合形成真菌-蓝藻复合地衣结皮应用于生物结皮人工固沙领域。
上述真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法，包括如下步骤：
(1)外瓶霉菌Zh2培养：将外瓶霉菌Zh2接种到PDA培养基中振荡培养，待培养至对数生长期，获得外瓶霉菌Zh2培养液；
(2)蓝藻培养：将蓝藻接种于无菌培养基中，置于光照培养箱培养，持续光照、通气培养至对数期，获得蓝藻培养液；
(3)将步骤(1)所得外瓶霉菌Zh2培养液和步骤(2)所得蓝藻培养液混合均匀；然后将混合培养物均匀喷洒接种于流沙表面，接种后的流沙置于人工气候箱培养，并进行适当养护，得到真菌-蓝藻复合地衣结皮。
上述方案中，步骤(1)所述振荡培养的条件为150rpm、28℃。
上述方案中，步骤(2)所述蓝藻为纤细席藻，购自中科院水生所淡水培养物保藏中心(FACHB-886)。
上述方案中，步骤(2)所述无菌培养基为无菌BG11培养基，所述光照培养箱的光强为50～200μE/(m2·s)，温度为25～30℃。
上述方案中，步骤(3)所述混合培养物中含5～10μg(叶绿素a)/mL蓝藻和106～108CFU/mL外瓶霉菌Zh2。
上述方案中，步骤(3)所述混合培养物按照1±0.3μg(叶绿素a)/cm2均匀喷洒接种于流沙表面。
上述方案中，步骤(3)所述人工气候箱的培养条件为：温度25～30℃，光照50～200μE/(m2·s)，培养时间为15～30天，每天根据土壤含水率，对土壤适当补充培养液或水，使其土壤含水率保持在10～20％，其中前一周补充PDA：BG11＝1：1培养液，之后补给水分。
上述方案中，所述养护的时间为15～30天。
本发明中，蓝藻的生物量通过测定叶绿素a的含量来表征，叶绿素a的测定方法为：取5mL蓝藻培养液，在8000r/min离心10min，弃去上清液，收集藻体；加入5mL 95％乙醇，置4℃冰箱抽提浸取24h，中间摇荡2～3次以使叶绿素a充分溶出，离心(8000r/min，10min)取上清液，用UV-2000型分光光度计在665nm和649nm波长下测定吸光度值OD665和OD649，根据公式叶绿素a(mg/L)＝13.950*OD665-6.88*OD649计算得叶绿素a含量。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明中筛选得到的外瓶霉菌Zh2，属于高产胞外多糖菌株，将外瓶霉菌Zh2与蓝藻复合应用于生物结皮人工固沙，一方面外瓶霉菌Zh2能够为蓝藻生长提供碳源，另一方面能够胶结沙粒使其形成稳定的团聚体，提高土壤的碳氮含量和土壤酶活性，改善土壤理化性质，显著促进土壤的营养水平；
(2)本发明将真菌与蓝藻混合接种于流沙，能够较快形成稳定的复合结皮，培育周期短，同时提高了人工结皮的稳定性，加速了藻类结皮向地衣结皮演替的过程；
(3)本发明培育的真菌-蓝藻复合地衣结皮，其抗旱能力显著高于单一蓝藻结皮，表明复合结皮能够更好的适应干旱区的严苛环境。
附图说明
图1为外瓶霉菌Zh2在固体平板上的生长特征。
图2为外瓶霉菌Zh2的分子生物学系统发育树。
图3为不同干旱胁迫下藻结皮(a)与真菌-蓝藻复合结皮(b)的生长曲线。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
实施例1高产胞外多糖菌株的筛选及发酵产物的鉴定
采集干旱区自然生长的完整地衣结皮，称取10g置于盛有90mL无菌水的250mL的三角瓶中，30℃，150r/min振荡20min，静置10min，得到土壤悬浮液。采用稀释法将菌悬液稀释到10–6后，取其中10-4，10-5，10-6 3个稀释梯度下的溶液200μL，涂布于PDA培养基上，在30℃恒温培养箱中倒置培养48h，挑选不同类型典型单个菌落，经平板多次纯化后，4℃保存在PDA斜面培养基待用。
向250mL的三角瓶中加入100mL灭菌的液体PDA培养基(含无菌玻璃珠)，将保存在PDA斜面培养基上的各菌株接种到PDA培养基中，150rpm振荡培养3d。向培养3d的发酵液中加入超过2倍体积的95％乙醇，静置2h后7000rpm离心10min，将所得沉淀烘干后溶于去离子水中，向溶液中加入1mL DNS试剂，沸水浴5min充分反应，冷却后溶液呈红棕色，即表明发酵产物属多糖类。最终从多株真菌中筛选得到高产胞外多糖真菌，命名为Zh2。
Zh2在液体PDA培养基中，摇床振荡培养3日内达到对数生长期。发酵液呈灰褐色，浑浊，真菌菌丝均匀分布在液体培养基中。图1为菌落在固体PDA培养基上的生长特征，菌落大小较规则，边缘为白色绒毛状，成熟菌落中心显深褐色，基生菌丝发达，能够延申至培养基内部。菌落为圆形，表面光滑，扁平隆起，边缘有褐色环形。菌株的理化性质鉴定主要通过碳源利用和氮源利用生理生化测试，如表1所示，菌株能够利用多种碳源和氮源，且利用效率高。Zh2最适生长温度为25～30℃，最适生长pH为6.5～7.5。
表1外瓶霉菌Zh2的碳源和氮源利用实验
注：“+”表示培养5天后检测为阳性结果
真菌16S rDNA测序包括了菌株DNA提取、ITS rDNA体外扩增(使用ITS通用引物ITS1和ITS4)，得到596bp的扩增产物。扩增产物经测序公司进行序列测定，将序列与GenBank中的序列进行BLAST比对，结果使用生物学软件分析，并与数据库中相似菌株的16SrDNA序列进行比对，建立菌株16S rDNA系统发育树。如图2所示，该菌株与外瓶霉(Exophiala oligosperma，NR111134.1)同源性很高，与相似度达到100％。同时结合生理生化测试和形态结构观察结果分析，该菌株确定为外瓶霉菌属(Exophiala oligosperma)，命名为外瓶霉菌Zh2。
将外瓶霉菌Zh2接种到PDA培养基中，150rpm振荡培养3d，将发酵液离心，取1.5mL澄清发酵液加入5μg内标物ABMBA(2-氨基-3-溴-5甲基苯甲酸)置于真空冷冻干燥机中干燥20h，对其进行衍生化，具体过程为：加入40mg/mL甲氧胺盐酸盐10μL(溶于99.99％吡啶中)，40℃振荡培养80min，再加入92μLMSTFA(N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺)，40℃振荡培养80min。用0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤后使用GC-MS(Shimadzu MSQP2010plus)测定。测定结果根据NIST05标准谱库鉴定各产物的化学结构，根据内标物和峰面积确定其相对含量。如表2所示，结果表明外瓶霉菌Zh2发酵产物中有大量糖类，包含呋喃核糖、塔罗糖、吡喃葡萄糖、赤藓酮糖、呋喃塔格糖、苏阿糖及密二糖，总计占比超过总产物的50％。
表2培养3d后，真菌Zh2主要发酵产物及其相对含量
实施例2真菌-蓝藻复合结皮与单一藻结皮的土壤肥力比较
将外瓶霉菌Zh2接种到PDA培养基中，150rpm振荡培养3d，待培养至对数生长期，备用；本实施例使用的蓝藻为纤细席藻(Phormidium tenue)，购自中科院水生所淡水培养物保藏中心(FACHB-886)。该藻种分离于宁夏沙坡头生物土壤结皮，是应用于库布齐沙漠固沙的优良藻种，将藻种接种于无菌BG110培养基中，置于光照培养箱光强50μE/(m2·s)，25±1℃，持续光照，通气培养至对数期。
将培养至对数期的外瓶霉菌Zh2与纤细席藻，通过血球计数法和比色法确定生物量，稀释后混合，使混合培养物中含5～10μg(叶绿素a)/mL蓝藻和106～108CFU/mL外瓶霉菌Zh2。以1±0.3μg(叶绿素a)/cm2的接种量均匀接种到流沙表面，以未添加真菌的纤细席藻为对照，置于光照培养箱中25℃连续培养，期间每天9：00根据土壤含水量补充水分，使其含水量为20％，培养30天形成较为稳定的真菌-蓝藻复合结皮。
测定真菌-蓝藻复合结皮和单一藻结皮的C/N/H元素含量及其过氧化氢酶、蔗糖酶、脲酶和磷酸酶活性。土壤元素含量采用元素分析仪(Vario Macro Cube,Elementar,Germany)测定，过氧化氢酶采用KMnO4滴定法，蔗糖酶采用二硝基水杨酸比色法，脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法，磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法。如表3所示，真菌-蓝藻复合结皮的碳氮含量和土壤酶活性均显著高于单一藻结皮，表明外瓶霉菌Zh2的添加能够显著促进土壤营养水平的提高。
表3培养30d后，真菌-蓝藻复合结皮与藻结皮的C/N/H含量及土壤酶活性
实施例3不同干旱胁迫下真菌-蓝藻复合结皮与单一蓝藻结皮的生长曲线比较
设置不同土壤含水率组(0、5％、10％、15％及20％)，分别接种真菌-蓝藻混合物和单一蓝藻于流沙表面，接种方法同实施方案3。连续光照恒温培养，期间每天9：00根据土壤含水量补充水分。培养期间每隔5天，取单位面积结皮于10mL离心管中，加入5mL 95％乙醇涡旋混合均匀后置于4℃冰箱提取24h，期间至少摇3次，浸提结束后8000g离心10min，于665nm和649nm下测定其吸光度，并计算叶绿素a含量。干旱胁迫下结皮叶绿素a含量随时间的变化曲线如附图3所示，真菌-蓝藻复合结皮的生物量高达45μg/g，显著高于蓝藻结皮(低于30μg/g)，且真菌-蓝藻复合结皮在土壤含水率为5％时仍能保持增长，单一蓝藻结皮在土壤含水率低于10％时生物量不再增长。表明真菌-蓝藻复合结皮的抗旱能力显著高于单一蓝藻结皮，真菌-蓝藻复合结皮能够更好的适应干旱区的严苛环境。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉大学
<120>一种真菌及真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法
<160> 1
<210> 1
<211> 596bp
<212> DNA
<213>外瓶霉菌属Zh2
＜400＞1
tacggtctca tcgggcccga cctcccaacc cattgtttat gatacctagt gttgcttcgg 60
taggcctggt ctatctgtta tagacctgcc ggggggccgt aagacgcccg ccggagagtg 120
cctaccgaca gcctcaactc caaaattctt taaccaaacg tgtctttgtc tgagtaacgt 180
cttttaaaat aaagcaaaac tttcaacaac ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa 240
cgcagcgaaa tgcgataagt aatgcgaatt gcagaattct cgtgagtcat cgaatctttg 300
aacgcacatt gcgccctttg gtattccgaa gggcatgcct gttcgagcgt cattttcacc 360
cctcaagccc ccggcttggt gttggacggt ctggtccggg gacctcaaac cccctggacc 420
cctcccaaag acaatgacgg cgggctgttg aacccccggt acactgagca tcttcacgga 480
gcacgtaccg gtctcaaggg tcgacggcac ccggtctata cctatatttt tcaaggttga 540
cctcggatca ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caaaagccgg gaggaa 596

Claims (10)

1.一株真菌，其特征在于，命名为外瓶霉菌Zh2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2018613。
2.权利要求1所述外瓶霉菌Zh2在生物结皮人工固沙领域方面的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述应用为：将外瓶霉菌Zh2与荒漠蓝藻复合形成真菌-蓝藻复合地衣结皮应用于生物结皮人工固沙领域。
4.权利要求3所述真菌-蓝藻复合地衣结皮的快速培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）外瓶霉菌Zh2培养：将外瓶霉菌Zh2接种到PDA培养基中振荡培养，待培养至对数生长期，获得外瓶霉菌Zh2培养液；
2）蓝藻培养：将蓝藻接种于无菌培养基中，置于光照培养箱培养，持续光照、通气培养至对数期，获得蓝藻培养液；
3）将步骤（1）所得外瓶霉菌Zh2培养液和步骤（2）所得蓝藻培养液混合均匀；然后将混合培养物均匀喷洒接种于流沙表面，接种后的流沙置于人工气候箱培养，并进行适当养护，得到真菌-蓝藻复合结皮。
5.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，步骤（2）所述蓝藻为纤细席藻。
6.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，步骤（2）所述无菌培养基为无菌BG11培养基，所述光照培养箱的光强为50~200 μE/(m2·s)，温度为25~30℃。
7.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，步骤（3）所述混合培养物中含5~10 μg（叶绿素a）/ mL蓝藻和106~108CFU / mL外瓶霉菌Zh2。
8.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，步骤（3）所述混合培养物按照1±0.3μg（叶绿素a）/ cm2均匀喷洒接种于流沙表面。
9.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，步骤（3）所述人工气候箱的条件为：温度25~30℃，光照50~200 μE/(m2·s)，培养时间为15~30天，每天根据土壤含水率，对土壤适当补充培养液或水，使其土壤含水率保持在10~20%，其中前一周补充PDA：BG11=1：1培养液，之后补给水分。
10.根据权利要求4所述的快速培育方法，其特征在于，所述养护的时间为15~30天。
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