KR101504159B1 - 미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도 - Google Patents

미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 성장 촉진용 조성물, 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물, 상기 미생물을 이용하여 미세조류 성장을 촉진시키는 방법 및 신균주인 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)에 관한 것이다.

Description

미세조류의 성장을 촉진하는 엑소피아라 올리고스퍼마 및 이의 용도 {Exophiala oligosperma promoting microalgal growth and use therof}
본 발명은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 성장 촉진용 조성물, 상기 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물, 상기 미생물을 이용하여 미세조류 성장을 촉진시키는 방법 및 신균주인 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)에 관한 것이다.
미세조류는 크게 절대적 광독립영양성(Absolute Photoautotroph) 미세조류와 혼합영양성(Mixotroph) 미세조류로 분류된다. 절대적 광독립영양성 미세조류란 전자 공여체로 이산화탄소를 이용하고 전자 수용체로 물을 이용하는 미세조류를 의미한다. 이러한 일련의 과정에 의한 광합성과정에 의해서만 에너지를 얻을 수 있는 미세조류는 광독립영양성 미세조류라 명명된다. 이와 반대로 혼합영양성 미세조류는 전자 공여체로 CO2를 이용할 수 있을 뿐만 아니라 유기 탄소원으로부터 전자 공여체를 얻을 수 있는 조류를 의미한다. 이 경우, 전자 수용체로 산소나 질산 등의 자유에너지도가 큰 무기물을 이용하는 경우와 클로로필(Chlorophyll)을 촉매제로 하여 물을 전자수용체로 이용하는 경우가 있다.
미세조류라고 분류되는 조류(algal strain), 규조류(diatom), 남조류(cyanobacteria)는 부분적으로 30% 이상의 높은 함량의 지질을 가지고 있는 것이 발견되었다. 이들 미세조류 종들은 오일이나 지질을 높은 비율로서 함유하고 있어 바이오디젤 생산의 지속가능한 공급원료에 대한 연구분야에서 큰 관심을 받고 있다. 미세조류는 에너지원으로 태양광을 사용하여 이산화탄소를 고정시킬 수 있는바, 이를 이용하여 생리활성물질 같은 다양한 유용물질을 생산할 수 있어, 미세조류의 이용을 통하여 이산화탄소 저감 및 대체 연료의 생산이라는 다양한 이점들을 가져올 수 있다. 미세조류는 대체에너지원 및 건강식품으로 잘 알려져 있으며, 수산양식용 사료, 의약 원료물질의 생산 등으로 그 이용성이 확대되고 있다.
대체 자원으로서 미세조류를 이용하기 위해서는 미세조류의 성장율을 높이는 것과 다른 미생물로부터의 오염을 방지하는 것이 중요하다. 미세조류의 대량 배양을 위해서는 편리한 생물반응장치를 개발하거나 세포 성장을 촉진하는 물질의 개발이 고려될 수 있다. 한국등록특허 제0877526호에서 홑파래(Monostroma nitdum Wittrock)의 물 추출물인 레보글루코산을 유효성분으로 함유하는 미세조류 성장 촉진제용 제제 및 미세조류를 배양하기 위한 배양 배지 첨가용 제제를 개시하고 있다.
미세조류는 물, 이산화탄소, 햇빛, 미네랄만 있으면 성장이 가능하며, 성장속도가 빨라 육지식물보다 연간 수확량이 5~10배 많은 바이오 매스를 생산할 수 있으며, 미세조류를 100톤 생산하는 경우 약 180톤의 이산화탄소를 흡수하므로 환경친화적이다. 미세조류 바이오디젤은 미국 등 일부 선진국에서 상용화 진입단계에 있으나 생장률, 배양률이 낮아 아직은 경제성을 확보하지 못하고 있다. 따라서 미세조류의 대량 배양이나 산업적 생산에 효과적인 성장 촉진제의 개발이 요구되어 왔다.
이러한 배경하에 본 발명자들은 바이오 원료로 사용하기 위한 미세조류들의 성장을 촉진시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 미세조류의 성장을 촉진하는 신균주를 분리하였다. 또한, 상기 균주 또는 이의 배양물을 미세조류의 배양액에 첨가할 경우 미세조류의 성장을 촉진할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 성장촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규한 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물인 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligopserma) 미생물 또는 이의 배양물을 미세조류 배양 배지에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 미세조류의 성장을 촉진시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 성장촉진용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물"은 헤르포트리키엘라세(Herpotrichiellaceae)과 및 자낭균문(Ascomycota)에 속하는 아나모픽 균류(Anamorphic fungi)의 속인 엑소피아라 속의 한 종이다. 상기 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 목적상 미세조류의 성장을 촉진시킬 수 있는 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주인 JM13(KCTC 12136BP)일 수 있다. 본 발명에서 기탁번호 KCTC 12136BP 균주는 "JM13"으로 통칭될 수 있다.
본 발명의 용어 "배양물"이란 상기 미생물을 공지된 미생물 배양방법에 따라 배양한 다음 수득한 산물을 의미할 수 있다. 상기 배양방법은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 본 발명의 배지 조성물을 이용할 수 있으며, 배양조건은 공지된 미생물 배양조건일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 배지를 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지로 하고, 배양온도를 30 ℃로, 속도는 160 rpm을 배양조건으로 하였다. 본 발명의 목적상 상기 배양물은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)의 배양물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주 JM13의 배양물일 수 있다.
본 발명의 용어 "미세조류"란 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 단세포생물들에 대한 통칭으로, 화장품, 제약 산업 및 농식품업에서 이용될 수 있는 생물학적 활성을 갖는 화합물을 공급할 수 있는 잠재력을 가진 광범위한 군을 의미하며 대체 에너지원으로 사용될 수 있는 생물을 의미한다. 상기 미세조류는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물에 의해 성장이 촉진될 수 있는 미세조류는 모두 포함될 수 있으며, 그 예로 녹조류, 규조류, 남조류, 홍조류, 착편모조류 또는 와편모조류의 미세조류가 될 수 있다. 본 발명의 미세조류는 바람직하게는 녹조류에 속하는 미세조류가 될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속 또는 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 미세조류일 수 있고, 가장 바람직하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 또는 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)일 수 있다. 녹조류는 색소체가 다량의 엽록소를 가지고 있어 녹색을 띠는 조류로서, 클로로필 a 및 b를 고등식물과 거의 같은 비율로 함유하고 있고, 그 밖에 고등식물과 같은 카로티노이드 색소를 가지는 조류 문의 하나이다. 녹조류에 속하는 미세조류로는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속의 미세조류를 예로 들 수 있다. 클로렐라는 녹조류에 속하는 속으로서, 식물 중 가장 오래된 단세포 녹조식물 중 하나로 알려져 있다. 클로렐라는 광합성과 세포 분열이 우수하며 엽록소는 물론, 단백질, 비타민, 미네랄 등 영양소가 풍부하며, 체질 개선과 영양 보급에 도움을 주며 성장 발육에 효과가 있어, 모든 사람들이 안심하고 섭취할 수 있는 천연 식품으로 알려져 있다. 또한, 다량의 지질성분을 함유하고 있어서 바이오 연료 연구의 주요 대상 물질로서 연구되고 있다. 클로렐라 속에 속하는 미세조류는 이에 제한되지 않으나, 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 프로토테고이데스(Chlorella protothecoides), 클로렐라 종(Chlorella sp .), 클로렐라 케스레리(Chlorella kessleri), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 스파에리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 맥시마(Chlorella maxima) 또는 클로렐라 플라텐시스(Chlorella platensis)일 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)일 수 있다. 세네데스무스는 녹조류에 속하는 한 속으로서, 담수산으로 습원의 물이 괸 곳이나 호수에서 떠다니며 생활하는 소형 녹조식물의 한 속이다. 세네데스무스는 군체의 세포수가 일정하며, 보통 양끝의 세포에서는 털 모양 돌기가 각각 2O개씩 나오며, 몸에 엽록체가 있어 광합성을 하는 특징이 있다. 세네데스무스 속에 속하는 미세조류 역시 이에 제한되지 않으나, 세네데스무스 디모푸스(Scenedesmus dimorphus), 세네데스무스 파리시엔시스(Scenedesmus parisiensis), 세네데스무스 종(Scenedesmus . sp .), 세네데스무스 브레비아쿠레아투스(Scenedesmus breviaculeatus), 세네데스무스 조바이스(Scenedesmus jovais), 세네데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus), 세네데스무스 프라티디스쿠스(Scenedesmus platydiscus), 세네데스무스 아쿠티포르미스(Scenedesmus acutiformis), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 세네데스무스 서브스피카투스(Scenedesmus subspicatus), 세네데스무스 아르쿠아투스(Scenedesmus arcuatus), 세네데스무스 디스파르(Scenedesmus dispar), 세네데스무스 판노니쿠스(Scenedesmus pannonicus), 세네데스무스 바실리엔시스(Scenedesmus basiliensis), 세네데스무스 히스트릭스(Scenedesmus hystrix), 세네데스무스 쿠아드리카우다(Scenedesmus quadricauda)일 수 있으며, 바람직하게는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)일 수 있다. 보트리오코쿠스(Botryococcus)는 녹조류에 속하는 속의 하나이다. 보트리오코쿠스 속에 속하는 미세조류는 이에 제한되지 않으나, 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트리오코쿠스 칼카레우스(Botryococcus calcareus) 또는 보트리오코쿠스 프로투베란스(Botryococcus protuberans)일 수 있으며, 바람직하게는 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 및 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)의 배양액에 JM13 균주의 배양액을 첨가한 결과, 상기 미세조류의 성장을 촉진시킴을 확인하였다 (도 4 내지 9).
본 발명의 용어 "성장 촉진용 조성물"이란 세포의 양 또는 크기의 증가를 촉진시키기 위하여 사용되는 물질을 의미한다. 본 발명의 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 성장 촉진용 조성물로 사용할 경우, 상기 미생물 또는 이의 배양물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용할 수 있고, 상기 미생물 또는 이의 배양물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 본 발명의 상기 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주는 미세조류의 성장을 촉진시킬 수 있는 미생물 제제의 형태로 이용될 수 있다.
본 발명자들은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)의 대표 균주로 JM13을 사용하여 JM13 또는 이의 배양물을 미세조류 배양액에 첨가하여 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 및 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)의 성장 촉진을 확인하여 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물이 미세조류의 성장 촉진용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 4 내지 9).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "배지 첨가용 조성물"이란 배양되는 세포의 성장을 자극할 수 있거나 세포의 생존 능력을 향상시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 배양 첨가용 조성물로 사용할 경우, 상기 미생물 또는 이의 배양물을 그대로 첨가하거나 다른 성분과 함께 사용될 수 있고, 상기 미생물 또는 이의 배양물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 새로운 균주인 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)를 제공한다.
본 발명자들은 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)를 생산하기 위한 배양의 배양액에서 균주를 분리하여 배양한 결과, 단일 세포와 영양균사 형태를 모두 갖는 균주를 분리하였다. 상기 분리한 균주의 동정을 위하여 유전자 분석을 한 결과, 엑소피아라 올리고스퍼마의 ITS1, ITS2 및 5.8S rRNA 유전자와 99%의 상동성을 보여 엑소피아라 올리고스퍼마에 속하는 신규한 균주임을 확인하였다. 이를 미생물 국제기탁기관인 대한민국 대전시 유성구에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여 2012년 02월 16일자로 기탁번호 KCTC 12136BP를 부여받았다. 상기 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)는 인공축산폐수를 이용한 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 배양에서 분리한 것으로서, 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)에 속하는 새로운 균주이다. 상기 JM13은 미세조류의 성장을 촉진시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 또는 이의 배양물을 미세조류 배양 배지에 첨가하여 배양하는 단계를 포함하는, 미세조류의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주 JM13 또는 이의 배양물을 미세조류 배양배지에 첨가하여 배양하는 단계를 포함한다. 상기 미세조류는 특별히 이에 제한되지 않으나, 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 미세조류를 포함하며, 바람직하게는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속 또는 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속 미세조류를 포함하며, 더욱 바람직하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris ), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 또는 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)이다. 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 속 미생물 또는 이의 배양물이 첨가된 미세조류의 배양 조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 미세조류 배양조건일 수 있다. 미세조류의 배양에 이용하는 배지는 미세조류가 증식할 수 있는 배지이면 종류 불문하고 사용할 수 있고, 예를 들면, 배양 배지는 Chu 13 배지가 될 수 있고, 배양액은 KNO3 371 mg, K2HPO4 80 mg, MgSO4 7H2O 200mg, CaCl2 2H2O 107 mg, 구연산 철 20 mg, 시트르산 100 mg를 포함할 수 있으며, 추가적으로는 H3BO4 5.72 mg, MnCl2 4H2O 3.62 mg, ZnSO4 7H2O 0.44 mg, CuSO4 5H2O 0.16 mg, CoCl2 0.2mg, Na2MoO4 0.084 mg/L(pH 7.5)를 포함할 수 있다. 또한, 클로렐라에서는 글루코스 80g/L, 인산칼륨 2.0g/L, 황산마그네슘 2.0g/L, Fe·EDTA 4.8mg/L, 미량 미네랄 A5(×10) 1.08ml/L, 비타민 B12 2.4mg/L, 요소 6.0g/L의 배지를 사용할 수 있다. 미세조류의 배양 조건에 제한은 없으며, 온도는 5 ℃ 내지 40 ℃의 범위이며, 배양액을 통기 및 교반하고, 필요에 따라 빛을 조사하여 0.5 일 내지 수 일간의 배양에 의해 미세조류를 증식할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 배양온도를 25 ℃로, 120 rpm 속도 및 120 uE/ml을 배양 조건으로 하였다.
본 발명에 따른 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물 및 이의 배양물은 미세조류의 초기 성장을 촉진하는바, 미세조류의 대량 생산 및 산업적 생산을 위한 성장 촉진 조성물 또는 배지 첨가용 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 TSA에서 분리한 신균주 JM13의 콜로니를 나타낸 도이다.
도 2는 TSB 액상배지의 배양 후 상태를 나타낸 도이다.
도 3은 JM13을 광학 현미경으로 분석한 것을 나타낸 도이다.
도 4는 JM13 배양액이 세네데무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 JM13 배양액이 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 6은 JM13 배양액이 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 JM13 배양액이 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 JM13 배양액이 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 JM13 배양액이 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)의 성장에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신균주 엑소피아라 올리고스퍼마 ( Exophiala oligosperma ) JM13 의 분리
인공축산폐수를 이용하여 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)를 생산하기 위한 배양에서 배양시 배양액에 함께 공존하고 있는 미생물을 분리하기 위해 배양액으로부터 시료를 채취하여 BG11 평판배지, TSA(Tryptic Soy Agar) 평판 배지 및 R2A 평판배지에 도말한 후, 30℃에서 배양하였다. 발생한 단일 콜로니는 계대배양하여, 콜로니를 분리하였다. 분리한 균주 가운데 검정색 콜로니를 JM13으로 명명하고 이를 분리하였다 (도 1).
실시예 2: 분리균주의 배양
상기 실시예 1에서 분리한 균주를 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에 접종하여 30℃, 160 rpm으로 4일 후 TSB 배지의 색상이 검정색으로 변하는 시점까지 배양하였다 (도 2).
실시예 3: 분리균주의 동정
분리균주의 동정을 위하여 TSB 배지에서 원심분리(centrifugation)를 통하여 균체를 모은 다음, G-spin DNA 추출 키트(G-spin DNA extraction kit, Intron)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
추출된 DNA를 이용하여 분리균주를 동정하기 위한 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머의 서열을 표 1에 나타내었으며, PCR 조건을 표 2 및 표 3에 나타내었다.
프라이머 서열 서열번호
Fun-ITS1F 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3' 1
Fun-ITS4R 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' 2
반응 혼합물의 조성
DNA 1㎕
Fun-ITS1F 프라이머(12.5 pmol) 2.5㎕
Fun-ITS4R 프라이머(12.5 pmol) 2.5㎕
10mM dNTP 혼합물 1㎕
10x PCR 완충액 5㎕
보빈 시럼 알부민(BSA) 0.5㎕
Taq DNA 중합효소(Takara, 일본) 0.5㎕
dH20 36㎕
총 부피 49㎕
온도(℃) 시간(분) 횟수(cycle)
초기 변성(pre-denaturation) 95 3 1
변성(denaturation) 94 1 30
결합(annealing) 55 1
확장(extension) 72 1
최종 신장(post-elongation) 72 10 1
상기의 조건에서 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물을 겔을 통하여 확인한 후, 쏠젠트(대전)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, 분석된 염기서열을 NCBI Blast search에서 검색하여 동정하였다.
염기서열 분석 결과, 분리균주는 자낭균류의 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)와 99%의 상동성을 가짐을 확인하였다(표 4). 분리균주를 400 배의 광학 현미경(니콘)으로 확인하여 도감과 비교한 결과, 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)의 단일세포 형태와 영양균사 형태를 가지고 있는 것을 확인하였다(도 3). 이상의 형태학적, 분자유전학적 특성을 종합하여 분리균주는 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)에 속하는 것으로 동정되었다. 상기 균주는 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)와는 100% 동일하지 않아 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma)에 속하는 새로운 균주임을 확인하였다. 이에 상기 균주를 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) JM13이라 명명하고 이를 미생물 국제기탁기관인 대한민국 대전시 유성구 과학로에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하여, 2012년 02월 16일자로 기탁번호 KCTC 12136BP를 부여받았다.
Accession Description Identification

AB480204		 Exophiala oligosperma genes for ITS1, 5.8S rRNA, ITS2, 부분 서열(partial sequence)
99%
실시예 4: 엑소피아라 올리고스퍼마 ( Exophiala oligosperma ) JM13 의 미세조류 성장 촉진 확인
미세조류의 성장 촉진 실험을 위하여 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris, AG10032), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus, Y836) 및 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)를 사용하였다.
미세조류의 성장을 조사하기 위하여 각각의 미세조류 배양액에 미세조류와 함께 분리한 스핑고모나스속(Sphingomonas sp.) 균주 및 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) JM13 균주의 배양액을 각각 접종한 후, 25 ℃, 120 rpm, 120 μE/ml에서 배양하였고, 미세조류의 양은 해마사이토미터를 이용하여 균체수를 현미경으로 측정하였다.
그 결과, JM13의 배양액을 접종한 실험구에서 세네데스무스 오블리쿠스는 초기 성장 속도를 200% 촉진시켰으며 (도 4 및 5, 표 5), 클로렐라 불가리스는 성장속도를 약 30% 촉진시켰다 (도 6 및 7). 보트리오코쿠스 브라우니의 경우, 성장속도를 27% 촉진시켰다(도 8 및 9). 비교실험으로 사용된 스핑고모나스속(Sphingomonas sp.)의 실험구는 무균 상태인 대조군과 비교하여 세네데스무스 오블리쿠스의 성장촉진이 미비하거나 저해된 것을 확인하였다 (표 5).
세네데스무스 오블리쿠스( Scenedesmus obliquus )
대조군 스핑고모나스 속 JM13
초기 9.247E+05 8.048E+05 9.589E+05
3 일 1.373E+06 1.873E+06 4.961E+06
6 일 2.512E+06 3.224E+06 6.788E+06
상기와 같은 결과는 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물이 미세조류의 성장을 촉진할 수 있음을 뒷받침하는 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC12136BP 20120216
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Claims (13)

  1. 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물을 포함하거나, 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 성장촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)인 미세조류 성장촉진용 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 것인 미세조류 성장촉진용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 미세조류 성장촉진용 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 및 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 미세조류 성장 촉진용 조성물.
  6. 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13).
  7. 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물을 포함하거나, 또는 이의 배양물을 포함하는 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)인 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 미세조류는 녹조류(Chlorophyta)에 속하는 것인 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물.
  10. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속 및 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물.
  11. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus) 및 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 미세조류 배양 배지 첨가용 조성물.
  12. 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 미생물을 미세조류 배양 배지에 첨가하거나, 또는 이의 배양물을 미세조류 배양 배지에 첨가하는 단계를 포함하는, 미세조류의 성장을 촉진시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCTC 12136BP인 엑소피아라 올리고스퍼마(Exophiala oligosperma) 균주(JM13)인 방법.
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